Programa de Pós-Graduação Interunidades em

Biotecnologia - UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

MATA DOS COCAIS

Chapter 6
The Elispot Assay

Natália Vicentino

Professora Drª Elizabeth Natal de Gaspari

Disciplina BTC5840 : Aplicabilidade da Técnica de ELISpot Presente, Passado e Futuro 1

6.1 Coating
O revestimento é normalmente
feito no dia anterior ao ensaio e a
placa é incubada durante a noite.
Recomenda-se seguir as instruções
do fabricante sobre a concentração
de revestimento recomendada ao
usar os kits comerciais Elispot.
Para a maioria das aplicações, é
suficiente revestir a placa com 100
μL de tampão de revestimento
contendo 10–15 μg/mL de
anticorpo de captura. 2
Uma questão muito importante é a pré-umedecimento necessária das placas de
PVDF

Os seguintes passos são essenciais para uma pré-molhagem bem sucedida:

1. Use apenas etanol puro para preparar a solução estoque. O etanol não puro
contém aditivos que podem interferir na membrana e no resultado geral do
ensaio.
2. Use uma solução umectante recém-preparada que contenha entre 35 e 70%
de etanol.

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3. Use apenas 15 μL de etanol para pré-umedecer. Isso é extremamente
importante. O volume é suficiente para molhar a superfície da membrana.
Volumes mais altos levarão ao vazamento de etanol no dreno inferior que está
preso ao fundo da placa.
O etanol permanecerá no subdreno e promoverá vazamentos durante todo o
experimento. As manchas podem parecer “desbotadas” e extremamente fracas,
ou não serem visíveis . Bata na placa para garantir uma distribuição uniforme
dessa pequena quantidade de etanol em todo o poço. A membrana ficará cinza-
azulada escura, um sinal de que foi pré-molhada com sucesso.

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Fig.1 Imagem do poço com sinais de
desenvolvimento de manchas
prejudicado devido a vazamento.
Manchas na periferia são muito fracas
e parecem desbotadas devido ao
contato direto da membrana com
etanol que vazou no subsolo.

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4. Não incubar a placa com etanol por muito tempo. Os poços podem secar e
retornar ao estado de alta hidrofobicidade em que estavam antes de adicionar a
solução de etanol.
Lave a placa três vezes com PBS. Deixe a última lavagem de PBS na placa até
ter preparado a solução de revestimento. Em seguida, despeje o PBS e adicione a
solução de revestimento.
5. NÃO pré-molhe as placas de nitrocelulose.

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6.2 Blocking
Depois de revestir a placa, remova o anticorpo não ligado (ou antígeno)
lavando a placa 1–2 vezes (é eficiente usar 150–200 μL de tampão de bloqueio
por poço). Não são necessárias mais lavagens.
Em seguida, adicione entre 100 e 200 μL de buffer de bloqueio por poço e
incubar a placa por pelo menos 2 h a 37 ° C (incubadora).
Esta etapa é importante para bloquear quaisquer sítios de ligação não
específicos na membrana

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6.3 Preparação de células efetoras
O tempo de bloqueio pode ser usado para preparar as células efetoras para
plaqueamento.

(a) Células frescas

Se PBMC, então repousou idealmente durante a noite para redefinir as células
para um estado semelhante ao tecido . Ou células obtidas de tecido, mais
provavelmente células do baço no caso de trabalhar no sistema murino
(b) Células congeladas, descongeladas e PBMC otimamente descansadas
durante a noite
(c) Células frescas ou congeladas, posteriormente manipuladas

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Dois passos importantes são necessários: (1) lavagem eficiente e (2) contagem precisa
das células.
As células precisam ser lavadas para remover quaisquer impurezas que possam afetar o
ensaio
cada etapa de lavagem pode promover a perda de algumas células; consequentemente
realize apenas o número absolutamente necessário de etapas de lavagem

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6.4 Preparação do estimulante
Existem várias formas de estimulantes às quais as células podem ser expostas,
para verificar a secreção de analitos específicos e inespecíficos

o Peptídeos e pool de peptídeos

Peptídeos e pools de peptídeos pertencem aos antígenos mais comuns usados para
estimulação em Elispot
A pureza dos peptídeos usados em um ensaio Elispot requer atenção. Quanto menor o
grau de pureza, maior é a probabilidade de respostas falso-positivas

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As recomendações gerais são obter peptídeos e pools de peptídeos de uma fonte
confiável que possa fornecer documentação sobre a síntese e o conteúdo da preparação
do pool de peptídeos/peptídeos e armazenar os peptídeos liofilizados a -20 °C ou, se
dissolvidos em DMSO, em -80°C.
Use peptídeos com pureza >70%, preferencialmente >90%.
Para estimulação adequada em um ensaio Elispot, pode ser necessário descobrir a
concentração ideal de peptídeos em experimentos de titulação, durante os quais as
células são estimulados com diferentes concentrações de peptídeos

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o Proteínas e Lisado
Proteínas inteiras e lisado contendo proteína também podem ser usados para estimulação
mas requerem captação e processamento por APC . Assim, o tempo de incubação para o
ensaio deve ser aumentado
o Apresentadores de Antígenos
O número de células e a concentração que precisam ser preparadas dependem da
configuração do ensaio Elispot.
As células precisam ser lavadas e contadas, de forma semelhante às células efetoras.
Não é necessário avaliar seu grau de apoptose.
o Estimulantes de Controle
Servem como um controle geral do ensaio (o ensaio funcionou), bem como um controle
de amostra (a amostra é responsiva)

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6.5 Amostras de Referência
As amostras de referência seguem as mesmas regras de preparação das
amostras de teste, PBMC ou splc

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6.6 Plaqueamento de células e estimulantes

Três regras importantes devem ser seguidas ao plaquear as células:

1. Condições “felizes” para células efetoras devem ser fornecidas.
2. Todas as células efetoras devem “ver” o antígeno.
3. As células efetoras e o anticorpo de captura devem estar em contato direto.

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6.7 Incubação

Adicione a tampa às placas e transfira-as cuidadosamente para uma incubadora

com 37 °C, 5% CO2. Certifique-se de que os racks dentro da incubadora estejam
nivelados.
Evite abrir ou fechar repetidamente a porta da incubadora, ou outros distúrbios
como vibração devido a centrífugas próximas, que podem fazer com que as
células se movam e produzam padrões irregulares de pontos que podem
apresentar desafios para a contagem de pontos .
O tempo de incubação necessário depende da velocidade com que a citocina
será secretada

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Fig.2 Elispot
imagem com forte
manchas de formato
irregular devido à vibração.
A imagem foi tirada com um
leitor Zeiss KS Elispot
(Thornwood, NY).

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6.8 Remoção de células

Uma vez terminada a incubação, não é mais necessário trabalhar em condições

estéreis.
Um passo importante agora é a remoção de todas as células da membrana antes
que as manchas possam ser desenvolvidas
A lavagem eficiente é crucial, Lavagem repetida (seis vezes)com PBS mais 0,05%
de Tween20 usando uma garrafa de esguicho

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6.9 Desenvolvimento Pontual
O desenvolvimento de manchas para um ensaio enzimático Elispot normalmente
consiste em três etapas:
1. Adicionando um anticorpo de detecção biotinilado (ou antígeno biotinilado )
2. 2. Adicionando o complexo avidina-enzima,
3. Adicionando o substrato.

Para preparar o anticorpo secundário, as recomendações dos fabricantes devem ser

seguidas de perto. No geral, é necessária uma quantidade menor de anticorpo em
comparação com o revestimento.
A incubação com o anticorpo deve durar em média cerca de 2 h a 37 ° C, seguida de
três lavagens com PBS/0,05% Tween 20. A incubação com o complexo avidina-
enzima requer cerca de 1 h 18
O detergente (Tween20) pode interferir na etapa final de desenvolvimento; portanto,
recomenda-se lavar a placa três vezes com PBS antes de adicionar o substrato.
O tempo de incubação com substrato depende do próprio substrato e do frescor
(atividade) da enzima. As manchas normalmente aparecem em poucos minutos, mas
podem não ser reconhecidas imediatamente
Pare o desenvolvimento de manchas assim que você vir manchas aparecerem. Lave as
placas em água corrente e a parte de trás das membranas, remova a água restante
batendo a placa em toalhas de papel
Deixe as placas secarem completamente antes da enumeração dos pontos. As manchas
são estáveis por muito tempo, normalmente meses ou mesmo anos

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6.10 Enumeração de pontos
A análise das placas Elispot é uma etapa crucial de um experimento Elispot
Marca registrada das manchas verdadeiras é um centro escuro com cor desbotada em
direção à periferia da própria mancha

Figura 3.Eli-”Spots”. imagem retrata um bom Elispot

com manchas vermelhas de vários tamanhos. As
características típicas de manchas verdadeiras pode
ser claramente distinto: centros escuros e
desvanecimento da coloração em direção a periferia
do local. a imagem foi tirada com um KS Elispot
Reader (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

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1. Seu tamanho (precisa ser maior que a célula que secretou o analito devido à sua
cinética de difusão);
2. Sua intensidade de coloração (quanto mais analito ligado em uma determinada
área, maior a intensidade de coloração de um ponto);
3. Sua cor (que é definida pelo substrato usado;
4. Sua forma (determinada pela difusão do analito para longe da célula em todas as
direções, portanto as manchas são mais ou menos redondas)

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Fig. 4 Exemplo de desafios de
avaliação de placas. Uma visão geral de
toda a placa é fornecida (uma). A placa
foi desenvolvida com BCIP/NBT para
manchas azul-púrpura. Os poços
parecem ter diferentes quantidades de
manchas. Um olhar mais atento ao poço
A5 (primeira linha, 5ª coluna) (b) revela
manchas de diferentes tamanhos,
algumas das quais parecem confluentes
(estrelas vermelhas) e de forma ímpar
(triângulos vermelhos), provavelmente
devido ao movimento das células
durante a incubação. Poço A10
(primeira linha, 10ª coluna) (c) tem
vários sinais azuis, mas a maioria, se
não todos, são artefatos. A principal
diferença entre os sinais em (b) e (c) é o
desvanecimento da coloração do centro 22
da mancha para a periferia (b) ou a falta
dela (c).
Fig. 5 Mancha branca nos centros
devido à remoção insuficiente de células
após a incubação. As células que
aderem à membrana bloqueiam a
ligação do anticorpo de detecção,
causando centros brancos dentro de
pontos desenvolvidos regularmente.
Setas azuis indicam aleatoriamente três
dos muitos exemplos neste poço

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Os parâmetros devem ser ajustados para um Elispot, e constantemente verificados e, se
necessário, ajustados para cada amostra testada. A ocorrência esporádica de qualquer um dos
desafios acima pode exigir o ajuste dos parâmetros de leitura apenas para essa condição
específica.

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