PROCEDIMENTO WESTERN BLOT

Principais passos envolvidos no Western blot:

1. Preparaçã o das amostras: Extrair as proteínas de interesse de células ou tecidos

e quantificar sua concentraçã o. (AULA 1)
1. Plaqueamento das células em placas de 6 poços com meio DMEM sem soro fetal
bovino (FBS).
2. O fator de crescimento EGF é preparado e adicionado aos poços das células para
os poços de controlo e teste, seguido de incubaçã o.
3. Preparaçã o da soluçã o de tampã o de lise química.
4. Remoçã o do meio de cultura e lavagem das células com soluçã o de PBS.
5. Adiçã o da soluçã o de tampã o de lise aos poços, aguardando e raspando as células,
e transferindo as soluçõ es para novos eppendorfs.
6. Centrifugaçã o das soluçõ es e transferência do sobrenadante para novos tubos.
7. Preparaçã o da placa de 96 poços com soluçõ es padrã o, amostras de controle e
teste, e adiçã o do reagente de Bradford a todos os poços.
8. Incubaçã o e leitura das absorvâ ncias das soluçõ es em cada poço.
8. A placa é incubada e as absorvâ ncias das soluçõ es em cada poço sã o medidas.
2. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE): Separar as proteínas de
acordo com seu tamanho molecular usando a técnica de SDS-PAGE.

3. Transferência:
1. Montar a sanduíche de transferência com papel de filtro, membrana de
nitrocelulose e gel de poliacrilamida.
2. Fechar a cassete de transferência para assegurar a transferência correta das
proteínas do gel para a membrana.
3. Colocar a cassete no equipamento de transferência e executar o programa
apropriado.
4. Apó s a transferência, remover a membrana da cassete e corar as proteínas
usando soluçã o de corante Ponceau S.
Estes passos essenciais permitem que as proteínas do gel sejam transferidas para a
membrana, onde podem ser visualizadas e detetadas posteriormente.
4. Bloqueio: Incubar a membrana em uma soluçã o de bloqueio para evitar ligaçõ es
nã o específicas de anticorpos.
5. Incubaçã o com anticorpos primá rios: Adicionar anticorpos primá rios específicos
para a proteína de interesse à membrana e incubar durante a noite, para estes se
ligarem à proteína alvo. Apó s a noite, lavar a membrana para remover anticorpos nã i
ligados.
6. Incubaçã o com anticorpos secundá rios: Adicionar anticorpos secundá rios que se
ligam aos anticorpos primá rios. Os anticorpos secundá rios amplificam o sinal. Apó s
a incubaçã o, lavar novamente a membrana para remover anticorpos secundá rios
nã o ligados.
7. Revelaçã o: Para a revelaçã o, misturar as soluçõ es ECL1 e ECL2 em um tubo. Apó s
as lavagens, colocar a membrana sobre uma folha de acetato, aplicar a mistura
ECL1+ECL2 (500 μL) sobre a membrana e cobrir com outra folha de acetato.
8. Captura da imagem: Registar a imagem do Western blot usando um sistema de
detecçã o adequado.