TÍTULO: Análise de Salmonella - DNAble

DATA DA APROVAÇÃO: 13/04/2018

CÓDIGO: IT.9296.CP
REVISÃO: 1
1. OBJETIVO
Extrair e detectar o DNA de salmonella em matéria prima produto acabado através do teste DNAble – Envirologix.

2. ABRANGÊNCIA
Este procedimento aplica-se ao laboratório de matéria prima da Affinity PetCare – Unidade Campinas.
Frequência: Conforme IT.6692.CP Plano de análises de monitoramento de produto acabado.

3. RESPONSABILIDADES
Auxiliar/analista de Garantia da Qualidade (Matéria Prima): responsável em executar as atividades descritas
neste procedimento.
Supervisor de Garantia da Qualidade: responsável em garantir todos os recursos necessários para que este
procedimento seja cumprido.

4. CONDIÇÕES NECESSÁRIAS
• Amostra enriquecida;
• Luvas nitrílica;
• Álcool 70%
• Hipoclorito de sódio 12%
• Balde,
• Hipoclorito de sódio,
• Pipetas com capacidade para 1000 µL, 200 µL e 25 µL; Figura 1. Pipetas utilizadas

• Aquecedor

• Aquecedor;

• Vórtex;

• Micro centrífuga;

• Aparelho DNAble

Figura 2. Vórtex e aquecedor Figura 3. Microcentrifuga

• Kit de extração – Sample Extraction Set: Solução tampão de extração MB3, tubos de micro centrífuga azul e
transparente de 1,5 mL;

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(a) (b) (c)

Figura 4. (a) Kit de extração com (b) tubos de micro centrífuga azul e transparente e (c) tampão de extração
MB3

• Kit de detecção – Molecular Detection Kit: Tubos de Ependorf azul e tubos de Ependorf transparentes para
leitura, cada um contendo seus correspondentes reagentes.

(a) (b) (c)

Figura 5: (a) Kit de detecção com (b) tubos de Ependorf azul e (c) tubo de Ependorf transparente para leitura,
cada um com seus respectivos reagentes.

Notas
• Os kits de extração e detecção devem ser estocados sob refrigeração entre 04 a 08ºC.
• Os kits devem estar em temperatura ambiente durante a análise de Salmonella. Desta forma,
recomenda-se retirar da refrigeração de 10 a 30 minutos antes da análise.

5. ATIVIDADES
5.1 Preparo do Ambiente de Trabalho
1. Limpar a estação de trabalho com álcool 70% e hipoclorito de sódio 12%

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2. Preparar balde de descarte: Banho com hipoclorito de sódio 12% onde serão descartados os utensílios
durante a análise:
o Colocar um saco plástico em um balde;
o Adicionar 2.000 mL de água;
o Adicionar 200 mL de hipoclorito de sódio 12%

3. Identificar os tubos de micro centrífuga a serem utilizados.

Notas

O DNAble é um teste altamente sensível. Portanto, as seguintes precauções são recomendadas para
reduzir a chance de contaminação das amostras:

• Limpar vidrarias e utensílios com hipoclorito de sódio 12% antes e depois do uso.
• Não reutilizar componentes descartáveis do kit.
• Mudar as ponteiras da pipeta entre as amostras.
• Usar luvas e troca-las entre o manuseio das amostras e/ou limpar com álcool.
• Evitar longo tempo de espera entre as etapas do procedimento de análise.

5.2 Preparo das Amostras: Extração da Salmonella

1. Ligar o aquecedor e esperar a temperatura estabilizar a 95ºC.
2. Agitar o plástico (Figura 6) de forma a homogeneizar a cultura enriquecida antes da amostragem.
3. Abrir o plástico com cuidado e comprimi-lo, fazendo o líquido subir para facilitar a amostragem.

5.2.1 Preparo dos Tubos Transparentes

1. Pipetar 1000 µL da cultura enriquecida para um tubo de micro centrífuga transparente (Figura 7) e
descartar a ponteira da pipeta no balde de descarte. Nesta etapa deve-se tomar cuidado para
encostar somente a ponteira da pipeta no líquido, pois esta será descartada, e não encostar a pipeta
na cultura devido a fatores de contaminação.

Figura 7. Disposição dos tubos identificados e etapa inicial sendo transferido 1 mL da cultura
enriquecida para os tubos transparentes
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2. Centrifugar amostras a 12.0 rpm por 5 minutos:

o Abrir micro centrífuga apertando o botão OPEN;
o Colocar tubos fechados no posicionamento adequado (Figura 8a);
o Fechar a micro centrífuga;
o Programa-la a 12.0 rpm por 5 min (Figura 8b);

Apertar START

Figura 8. (a) Disposição dos tubos na micro centrífuga e (b) botões para programar o aparelho indicando o
START

3. Remover o sobrenadante no balde de descarte com cuidado para evitar a ruptura do “pellet” (Figura
9). Se não for possível observar o “pellet”, deixe um pequeno volume remanescente
(aproximadamente 100 µL).

Figura 9. Após centrifugação deve-se descartar o sobrenadante

4. Adicionar 100 µL da solução tampão MB3, colocar no vórtex para suspender o “pellet” e posicionar
no bloco de aquecimento. Recomenda-se colocar de 2 em 2 amostras no vórtex por tempo suficiente
para ocorrer homogeneização.

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5. Aquecer as amostras no bloco de aquecimento por 95 ± 1,5ºC por 10 ± 2 minutos (Figura 10). O
aquecimento possibilita a lise de células de Salmonella.

Figura 10. Aquecimento das amostras a 95ºC por 2 minutos

6. Centrifugar novamente a 12.0 rpm por 5 minutos.

Notas

• A capacidade da centrífuga e da estufa para o enriquecimento da cultura é de 12 amostras, portanto,

recomenda-se trabalhar com 12 amostras por vez.

5.2.2 Preparo dos Tubos Azuis

1. Com a pipeta de 200 µL, colocar 100 µL da solução tampão MB3 em um tubo de micro centrífuga azul
de 1,5 mL.
2. Transferir ao tubo azul 25 µL do sobrenadante da última centrifugação do tubo transparente e misturar
com o auxílio da pipeta.
3. Transferir 5 µL do tubo de micro centrífuga azul para o tubo de Ependorf verde e misturar com o auxílio
da pipeta (Figura 11).

(a) (b) (c)

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Figura 11. (a) Transferir 5 µL de solução do tubo de micro centrífuga azul (b) para o tubo de Ependorf azul posicionado no
suporte (c) ocasionando a reação de ambos

5.2.3 Preparo dos Tubos de Ependorf Transparentes

1. Retirar a tampa do tubo transparente.

2. Transferir todo conteúdo do tubo de Ependorf azul para o transparente e misturar com o auxílio da
pipeta.

(a) (b)

Figura 12. (a) Transferir 25 µL de solução do tubo de Ependorf azul para o transparente (b) ocasionando a
reação

5.3 Procedimento da Análise

5.3.1 Preparo do Aparelho DNAble

(a) (b) (c)

Figura 13. (a) Aparelho DNAble ligando, (b) Tela para identificar o usuário e cadastrar as amostras, (c) Clicando
nos espaços de cada amostra irá aparecer uma tela para inserir o nome da amostra conforme o recomendado

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Notas

• Ligar o computado e o aparelho, verificar que o cabo USB está reconhecido, abrir o programa DNAble
Desktop, conectar dispositivo, identificar amostras com código do PA e data de fabricação.

5.3.2 Leitura das Amostras no Aparelho DNAble

1. Abrir o aparelho DNAble;

2. Inserir os tubos de Ependorf transparentes e fechar a tampa do leitor;
3. Pressionar START no programa DNAble;
4. Aguardar 15 minutos.

Figura 14. (a) Inserir tubos de Ependorf transparentes.

5.4 Resultados da Análise

• Após 15 minutos o software irá exibir os resultados (Figura 15) em:

o Positivo  com presença de Salmonella.
o Negativo  sem presença de Salmonella.

Figura 15. (a) Escala do leitor DNAble.

Notas

• Deve-se tomar cuidado na destinação do balde de descarte. Se houver presença de Salmonella em

qualquer amostra deve-se descartar em lixo orgânico. Caso contrário, o descarte pode ser realizado em
lixo comum.

6. DOCUMENTOS RELACIONADOS
IT.6692.CP – Plano de Análises de Monitoramento de Produto Acabado.

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