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TESTE IMUNODIAGNÓSTICO - IMUNODIFUSÃO

DUPLA

Componentes: Isadora Tavares, Laiza Motta, Luna Vieira e Maria Eduarda Marques.
Turma: 2 Biotecnologia
Disciplina: Imunologia
Professor: Marcos Almeida e Flávia Ribeiro

Rio de Janeiro
2022
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1. INTRODUÇÃO
Do inglês “Double Immunodiffusion", o teste de Imunodifusão Dupla (IDD) é um
imunodiagnóstico que foi descrito por Ouchterlony, um médico bacteriologista sueco, por volta
de 1946-1948. A técnica consiste em identificar anticorpos e/ou antígenos por meio de uma
precipitação que se dá por conta dos imunocomplexos estáveis, visualizados –
macroscópicamente – como linhas ou arcos de precipitações na área de reação. Tais linhas
evidenciam-se caso os anticorpos e os antígenos da amostra sorológica encontrem-se em
semelhantes proporções, difundindo-se.

Testes finalizados com linhas de precipitações visíveis – autoria própria.

A ou o longo dos anos, o IDD vem mostrando-se extremamente necessário, tendo em vista que a
técnica apresenta graus simples de execução, baixo custo para a realização e pode ser utilizada
em pesquisas para a detecção de anticorpos associados a doenças autoimunes, como artrite
reumatóide, lúpus sistêmicos, esclerose sistêmica, síndrome de Sjögren e vasculite. Ademais, a
técnica de imunodifusão apresenta determinadas combinações, seguidas de suas respectivas
características e especificidades, dividindo-se em radial, simples e como já descrito acima, a
dupla.
A imunodifusão radial (IDR) é uma técnica simples e manual de placa de gel, em que as amostras
são posicionadas em poços cilíndricos e perfurados em gel agarose; tais amostras se difundem
radialmente através desse gel, formando os responsáveis pela produção do anel de precipitina, o
complexo antígeno-anticorpo.
Por sua vez, compreende-se por imunodifusão simples, a fixação de um de seus elementos
(antígeno/anticorpo) ao gel, e a migração do outro até a formação do imunocomplexo formando a
ligação do antígeno ao anticorpo – caso positivo

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2. OBJETIVO
1- Compreender as noções e etapas necessárias para o preparo da lâmina e execução do
teste com excelência.
2- Produzir o suporte necessário para que o resultado do teste possa ser obtido (preparo da
lâmina; aplicação das amostras sorológicas; entre outros)
3- Coloração da lâmina com Comassie Blue.
4- Identificação dos resultados a partir das ligações de antígeno-anticorpo.

3. MATERIAIS UTILIZADO

Vidrarias
- Lâmina Laboratorial
Utensílios
- Perfurador
- Agulha
Equipamentos
- Microondas
- Geladeira
- Autoclave
Reagentes
- Água Destilada
- PBS: Tampão Salina Fosfato (100 ml)
- Agarose (1%)
- Soro Padrão
- Citrato de Sódio (5%)
- Solução Salina Nacl (0,9%)
- Coomassie Blue
- Soro Padrão
- Amostra Sorológica dos pacientes
- Amostra do Antígeno

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4. PROCEDIMENTOS
- Primeiramente, realizamos a higienização das mãos com água e sabão, depois, fizemos a
antissepsia das mesmas com álcool 70%;
- Após a antissepsia, colocamos os EPIs necessários, sendo eles o jaleco e as luvas;
- Em seguida, realizamos uma higienização da lâmina com álcool 70%, caso ela esteja com
alguma espécie de sujidade;
- Após, foi feita a filmagem da lâmina com 0,5% de agarose;
- Em seguida, fizemos o gel de agarose (100ml de PBS, 1g de agarose; colocar dentro de
um becker para realizar a mistura, esquentar a mistura cerca de 2 minutos no micro-
ondas);
- Logo, despejamos 4 ml do gel de agarose produzido na lâmina.
- Levamos a lâmina com o gel até a geladeira e deixamos por volta de 15 minutos, até o gel
ficar com uma consistência mais firme;
- Após ser retirada a lâmina da geladeira, fizemos 7 cortes esféricos no gel com um
perfurador, formando uma roseta, e retiramos o conteúdo de dentro desses cortes com
uma agulha, gerando espaço suficiente para receber os futuros materiais despejados;
- Em seguida, pipetamos o soro padrão, o antígeno e a amostra dos pacientes (assim como
demonstrado na foto abaixo);
- Depois, foi feita uma difusão por 48 horas;
- Logo após, foram feitos dois banhos. O primeiro foi feito com concentração de 5% de
Citrato de Sódio, por 2 horas. O segundo foi feito com concentração de 0,9% de Solução
Salina (NaCl), por 46 horas.
- Em seguida, deixamos secar por 30 minutos na autoclave a 37°C;
- Após a secagem, fizemos a coloração com comassie Blue e os resultados ficaram
aparentes para a identificação.

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante a aula prática podemos ter uma maior compreensão da disciplina e da realização
de procedimentos laboratoriais com sucesso. Foi realizada a preparação e perfuração do gel em
formato de roseta com excelência. Portanto, podemos afirmar que concluímos um dos objetivos
principais da aula prática, nos quais realizamos toda a feitura do teste imunodiagnóstico de
imunodifusão dupla até a etapa de sua difusão e compreender a compatibilidade dos antígenos e
anticorpos inseridos, podendo identificar se o resultado do teste foi total, parcial ou não
identificado segundo a análise a olho nu com o auxílio do coomassie blue.

6. CONCLUSÃO
Em nossa aula prática podemos ter maior compreensão teórica e prática das noções básicas da
realização de um teste imunodiagnóstico. Podemos dizer que todas as nossas metas e expectativas
como estudantes e futuros técnicos em biotecnologia foram supridos com excelência, com a
feitura de um teste de imunodifusão dupla, análise do mesmo e a aplicação dos conhecimentos
obtidos em aula teórica de imunologia.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

● PEREIRA, Aline Lyra. Diagnóstico sorológico da paracoccidioidomicose : comparação

entre os testes de Imunodifusão Dupla (IDD) e Ensaio Imunoenzimático (ELISA).
RiUfest, 2012. Disponível em: <https://repositorio.ufes.br/handle/10/5958>. Acesso em:
18/09/22.
● RIZALDO, Raymundo Pinheiro. ANDRIOLI, Alice Pinheiro. GUIMARÃES, Aurora
Maria Gouveia. Métodos de Diagnóstico das Lentivírus de Pequenos Ruminantes,
Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2001. Disponível em:
<https://repositorio.ufes.br/handle/10/5958>. Acesso em: 18/09/22.
● GRAHAM, Bailey. Ouchterlony Double Immunodiffusion technique. Microbe Notes,
2022. Disponível em: <https://microbenotes.com/ouchterlony-double-immunodiffusion-
technique/>. Acesso em: 18/09/22.
● OUCHTERLONY, Orjan. Microbiologica Scandinavica, 1949. Disponível em:
<https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1699-0463.1949.tb00751.x>. Acesso em:
18/09/22.
● SITE BLINDING, 2022. Imunodifusão radial. Disponível em
<https://www.bindingsite.com/pt-br/the-science/understanding-binding-site-technology/
radial-immunodifussion?disclaimer=1#>. Acesso em: 18/09/22.
● RAJPUT, Prachee. Double immunodiffusion technique, 2016. Disponível em
<https://pt.slideshare.net/msaltyy/double-immunodiffusion-technique>. Acesso em:
18/09/22.
● DMP (departamento de Microbiologia e Parasitologia). Imunodifusão de Ouchterlony.
Universidade federal de Santa Maria, 2004. Disponível em:
<http://jararaca.ufsm.br/websites/imunologia/68fc006051130b9331a29389c46de3f9.htm>
. Acesso em: 18/09/22.

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