UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ

VIROLOGIA E IMUNOLOGIA VETERINÁRIA

Trabalho Sobre Diagnósticos

Curso: Medicina Veterinária

Bárbara Toledo Catarcione Barros

202202273661

Nova Friburgo – RJ

2022

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Universidade Estácio de Sá
Graduação: Medicina Veterinária
Tema: Diagnósticos
Disciplina: Virologia e Imunologia Veterinária
Docente: Tarcisio Teixeira
Discente: Bárbara Toledo Catarcione Barros
Nova Friburgo/RJ, Outubro de 2022.

Resultados:

Diagnóstico direto molecular (amplificação de material genético):

Uma das mais importantes infecções virais que podem acometer cães é a
parvovirose canina (CPV). O parvovírus canino, pertecente à família Parvoviridae,
gênero Parvovírus, agente etiológico da CPV, é um vírus de DNA não envelopado.
A técnica selecioada foi a qPCR (Reação da Cadeia de Polimerase em Tempo
Real), que pode ser utilizada para o diagnóstico da CPV. As amostras utilizadas
podem ser o sangue total em EDTA ou fezes frescas sem conservantes, para o
sucesso do resultado as amostras devem ser acondicionadas de forma correta, o
sangue coletado deve ser imediatamente colocado em tubo contendo EDTA, as
fezes frescas devem ser coletadas em frasco coletor estéril e todas as amostras
devem ser refrigeradas (2 – 8°C) até 5 dias ou a 20°C por até um mês.
O DNA total deve ser extraído de 200 mg de amostras fecais frescas ou
congeladas usando o kit QIAamp® DNA Stool. Para medir a carga viral do CPV, um
ensaio de qPCR em tempo real é desenvolvido usando QuantiFast SYBR Green
PCR, forward primer AGCTACTATTATGAGAACCAGCTGAG e reverse primer
CCTGCTGCAATAGGTGTTTTAA. Esses primers amplificam um fragmento de 98 pb
da posição 981 a 1079 das regiões conservadas do gene VP2 de CPVs. Os ensaios
são realizados usando o Eco™ Real-Time PCR System. A reação deve conter 10 µL
de 2X QuantiFast SYBR Green Master Mix, 1 µM de cada primer e 5 µL de DNA de
amostra fecal em uma reação de PCR de 20 µL. O perfil térmico para qPCR deve
ser de 95°C por 5 min, seguido por 40 ciclos de 95°C por 10 s e 60°C por 30 s, com
uma análise da curva de fusão a 60-95°C com incrementos de 0,3°C para 5
segundos. A amostra de controle para qPCR, é um vetor de plasmídeo pGEM®-T
Easy, contendo o fragmento VP2 de 98 pb descrito acima. A amostra é considerada
positiva para amplificação de CPV quando o valor médio de Ct (threshold cycle) de
três réplicas foi menor que o valor médio de Ct para controles negativos (amostras
de cães saudáveis) mais 2 vezes o desvio padrão das mesmas réplicas.
As principais vantagens da qPCR são a rapidez do diagnóstico e a elevada
sensibilidade analítica e diagnóstica, como desvantagens podemos citar o custo
elevado e a necessidade de treinamento específico do corpo técnico para a
realização do protocolo.

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Diagnóstico indireto (pesquisa de anticorpo).

A imunodifusão em gel de agar é uma técnica utilizada para a detecção de

anticorpos. Essa técnica é muito utilizada em casos de Brucelose Bovina. Para
obter um diagnóstico da brucelose bovina através da técnica de imunodifusão em
gel de agar, deve-se utilizar amostras de soro sanguíneo do animal que apresenta
suspeita da doença.

Para se obter sucesso no resultado do teste, a amostra deve receber um

acondicionamento correto. Dessa forma, após a retirada do sangue do animal e
aguardado o tempo recomendado para separação do coágulo, deve-se transferir o
soro para tubos do tipo Eppendorf. Em seguida, esse tubo deve ser devidamente
identificado. Após isso, os tubos devem ser colocados em ordem em uma placa
de isopor e envolvidos por um plástico filme. Por último, essa placa deve ser
colocada em uma caixa de isopor que acomode corretamente as amostras e
bastante gelo e, por fim, enviadas ao laboratório responsável pelo teste.

Primeiramente, para a execução da técnica, o gel de agar deve ser preparado.

Após o preparo, esse gel é distribuído em placas de Petri. Após a sua
solidificação, deve ser perfurado. Em seguida, o antígeno do material coletado
deve ser colocado nos orifícios do gel. Nessa etapa, são colocados soros controle
positivos e soros a testar. Essas placas devem ser mantidas em câmara úmida e
em temperatura ambiente. A leitura é realizada após 24, 48 e 72 horas, utilizando-
se sistema de iluminação indireta e fundo escuro.

A técnica de imunodifusão por gel de agar possui vantagens e desvantagens.

Uma vantagem é que se trata de uma técnica de simples execução e
implementação. Um desvantagem é que se trata de uma técnica somente
qualitativa, ou seja, não permite a quantificação de anticorpos.

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Diagnóstico direto por pesquisa de antígeno.

A imunofluorescência é uma técnica utilizada para identificação de antígenos de

algumas doenças, como por exemplo a Raiva. Para obter um diagnóstico de raiva
através da técnica de imunofluorescência, deve-se utilizar o sistema nervoso
central do animal como amostra. Para se obter sucesso no resultado do teste, a
amostra deve receber um acondicionamento correto. Para isso, a amostra deve ser
encaminhada ao laboratório em condições de refrigeração. O material deve ser
colocado em um frasco com tampa de rosca, de boca larga e de capacidade maior
do que o tamanho da amostra. O recipiente deve ser hermeticamente fechado, de
maneira a não haver vazamento de fluidos e contaminação dos manipuladores. O
frasco deve ser identificado de maneira clara e visível e ser colocado em isopor
com gelo suficiente para manter a amostra refrigerada durante o transporte até o
laboratório que executará o teste.

Para execução do teste, primeiramente, deve-se efetuar a impressão nas lâminas,

em dois campos isolados; pressioná-la sobre papel pouco absorvente e deixar
secar ao ambiente. Em seguida, preparar no mínimo de 4 lâminas por material
suspeito. Se o material estiver conservado em líquido de Vallé, aplicar calor fraco
sobre a lâmina. Em outra lâmina, efetuar a impressão do cérebro controle positivo
para raiva, em dois campos isolados, pressioná-la em papel pouco absorvente. Em
seguida, fixar as lâminas em acetona por dez minutos a -20°C. Depois secar as
lâminas em temperatura ambiente. Delimitar os dois campos preparados na lâmina.
Dispor duas gotas de com o conjugado adsorvido a uma suspensão de cérebro de
camundongo normal e depois no infectado. Incubar as lâminas a 37°C por 30
minutos, em câmara úmida; Lavar as lâminas com PBS, colocá-las em um
recipiente contendo PBS (pH 8,5), durante 10 minutos. Lavar as lâminas em água
destilada, afim de retirar o excesso de cristais. Deixar escorrer e secar as lâminas,
em posição vertical. Dispor uma gota de glicerina tamponada (pH 8,5) sobre cada
campo e cobri-los com lamínulas (espessura menor que 0,2 mm). Por último ler as
lâminas em microscópio para imunofluorescência. Suas vantagens e desvantagens
são, respectivamente, boa sensibilidade e especificidade e acontecimento de
reações inespecíficas.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27876613/

http://www.tecsa.com.br/assets/pdfs/PARVOVIROSE%20CANINA%20-
%20CORRETO%20DIAGNOSTICO%20DA%20DOENCA.pdf

https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/
HELIOJOSEMONTASSIER/tecnica-de-imunodifusao-v-f-set-24-17.pdf

https://www.ufrgs.br/labvir/material/aulap21.pdf

https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_diagnostico_laboratorial_raiva.pdf

https://www.scielo.br/j/abmvz/a/sm7QXHLGFFLfVWYxsdHGfBg/?lang=pt#

https://www.ufrgs.br/labvir/material/aula7biomed.pdf

https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/
HELIOJOSEMONTASSIER/tecnica-de-imunodifusao-v-f-set-24-17.pdf

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