PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS

ESCOLA DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA

Bárbara de Paula Souza Ferreira

Brunna Michelle Fagundes Ribeiro
Marco Aurélio Ferreira da Silva Fonseca
Rafael Costa de Sousa
Rafael Vieira França Garcia
Thais Camargo Oliveira

AED- Técnicas de imunodiagnóstico “Imunofluorescência indireta”

e “Western Blot” e seus respectivos Procedimento Operacional
Padrão (POP)

Goiânia - Goiás
2021
 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

A imunofluorescência é um método laboratorial que permite a visualização ou

quantificação de anticorpos contra determinado antígeno em células e tecidos, através
de marcadores. Dentre os marcadores mais comumente utilizados estão os
fluorocromos, que são corantes que absorvem a luz ultravioleta (UV). Tais corantes
são excitados pela radiação e assim emitem luz visível ao se utilizar microscópio de
fluorescência se houver ligação entre os anticorpos marcados com fluorocromos
(conjugado) e os anticorpos do paciente. Se há interação antígeno-anticorpo
possibilita o entendimento de que o paciente tem anticorpos contra o antígeno
utilizado na técnica, podendo ser vírus, bactérias, entre outros, significando que o
paciente está infectado ou foi infectado. Ao adicionar o conjugado ele se ligará ao
anticorpo do paciente que teve interação com o antígeno, indicando
microscopicamente a visualização e quantificação dos antígenos existentes. O teste
de imunofluorescência indireta possui alta especificidade e sensibilidade, não
demanda muito tempo de realização e é capaz de localizar antígenos intra e
extracelulares. Ele permite a avaliação de auto-anticorpos circulantes e auxiliam no
diagnóstico nas dermatoses vesicobolhosas autoimunes (DVB).

Imunofluorescência indireta em células Hep-2 testadas com soro

 Elaboração: Karolina
POP – IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Damiani

Objetivo
Facilitar a identificação do anticorpo contra determinado antígeno, para o diagnóstico de
doenças.

Material Necessário
● Microscópio de imunofluorescência;
● Luva e papel absorvente;
● Lâmina e lamínula;
● Recipiente para fazer as lavagens podendo ser jarras de Coplin;
● Conjugado fluorescente;
● Envelopes com tampão PBS em pó ou PBS líquido concentrado para diluição;
● Glicerol tamponado (meio de montagem);
● Diluente de imunofluorescência;
● Tubos e suportes para fazer diluições;
● Câmara úmida

Microscópio de imunofluorescência Jarras de Coplin Tampão PBS

Descrição da Atividade
● Diluir o PBS (tampão fosfato-salino) concentrado com água destilada/deionizada, esse
PSB diluído é usado como tampão de lavagem e diluente das amostras do paciente;
● Diluir o soro de cada paciente a 1/40 com tampão PBS diluído;
● Deixe a lâmina atingir temperatura ambiente por 15 (quinze) minutos antes de retirar do
envelope;
● Remover sem tocar no substrato e colocar em câmara úmida;
● Pingar uma gora dos controles: positivo homogêneo, positivo centromérico e negativo;
● Pingar uma gota dos soros desconhecidos diluídos 1/40 nas áreas restantes;
● Incubar por 30 (trinta) minutos na câmara húmida em temperatura ambiente;
● Remover a lâmina da câmera úmida, segure por uma extremidade e lave com tampão
PBS diluído;
● Dirigir o PBS pela borda da lâmina e ter cuidado para não atingir diretamente as áreas
reativas evitando assim prejudicar o substrato;
● Coloque a lâmina em um recipiente e lavar 2 (duas) vezes com PBS diluído, por cinco
minutos cada vez;
● Remover a lâmina do recipiente e tirar o excesso de PBS sacodindo sobre o papel
absorvente;
 ● Secar em torno das áreas reativas e retomar a câmera úmida IMEDIATAMENTE;
● Pingue uma gota de fluoresceína nas áreas reativas dos anticorpos;
● Incubar novamente em câmara úmida em temperatura ambiente por 30 (trinta) minutos
e com proteção de excesso de luz;
● Remover a lâmina da câmara úmida e mergulhar em um recipiente com PBS diluído;
● Lavar 2 (duas) vezes, por 5 (cinco) minutos cada vez, agitando suavemente o
recipiente algumas vezes;
● Pingar 2 (duas) a 3 (três) gotas de azul de Evans no recipiente desta última lavagem;
● Remover a lâmina e tirar o excesso de PBS secando em torno das áreas reativas;
● Pingar 3 (três) a 4 (quatro) gotas de glicerina tamponada entre as áreas reativas;
● Cobrir a lâmina com lamínulas, evitando a formação de bolhas, depois secar o
excesso de glicerina com papel absorvente e limpar o dorso da lâmina;
● Faça leitura em microscópio de fluorescência;

Referências
Imunofluorescência direta e indireta: diferenças,vantagens e desvantagens
(ibapcursos.com.br)
Técnica de FAN - Imunofluorescência Indireta <https://youtu.be/fblyi4r-N7w>
WESTERN BLOT

A técnica de western blotting se baseia na detecção de proteínas específicas em

amostras de lisados celulares ou de tecidos. As cinco etapas deste métodos são:
extração e quantificação das proteínas; fracionamento das proteínas da amostra em
um gel de poliacrilamida; transferências dessas proteínas para uma membrana;
incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser
analisada; e revelação dessa membrana para análise dos dados.

Essa técnica permite detectar, caracterizar e semi-quantificar múltiplas proteínas,

principalmente aquelas que estão em baixas quantidades na amostra. Ela possui alta
sensibilidade e especificidade e pode diagnosticar Encefalopatias espongiformes
transmissíveis, Leishmaniose visceral americana, Mieloencefalite equina por
protozoário, Salmonelose e Mycoplasma hyopneumoniae (suínos), além de confirmar
HIV, detectando anticorpos anti-HIV no soro do paciente. Também contribui para
pesquisas de neoplasias, doenças hereditárias e descobertas de proteínas para
produção de vacinas.

Dos métodos espectroscópicos utilizados na etapa para a quantificação de proteínas,

destaca-se o método de Bradford. Ele se baseia na mudança de cor do corante
Coomassie Blue em solução ácida que vai da cor vermelha para a cor azulada na
presença de proteínas. Para quantificar a concentração de proteínas na amostra deve-
se fazer uma curva de padronização com concentrações conhecidas de uma proteína.
A partir dessa curva obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir
os valores médios de absorbâncias das amostras, para alcançar os valores da
concentração das proteínas e o coeficiente de correlação linear deve ser maior que
0,98.

Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a

eletroforese em gel de poliacrilamida, onde, prepara-se o gel do qual as proteínas
poderão migrar. As proteínas podem possuir cargas positivas ou negativas,
dependendo das cargas dos aminoácidos que as compõem. É utilizado, então, o SDS,
um poderoso detergente carregado negativamente, que se liga nas regiões
hidrofóbicas das moléculas de proteínas mascarando a carga intrínseca, e permitindo
que as proteínas migrem em direção ao polo positivo em um campo elétrico.

É necessário utilizar anticorpos específicos para a proteína desejada, desde que elas
estejam em um suporte sólido. Essa transferência das proteínas do gel para a
membrana inicialmente era feita por meio da capilaridade, mas atualmente usa-se a
transferência eletroforética que é muito mais rápida e eficiente. Depois que o tempo
de aplicação da corrente elétrica tiver terminado usa-se um corante para confirmar a
transferência das proteínas para a membrana, e verificar se essa transferência
ocorreu de maneira igual para todas as amostras. Para visualizar uma proteína de
interesse é utilizado um anticorpo específico que vai reagir com um epítopo da
proteína, formando um complexo anticorpo-antígeno. Esse anticorpo é denominado
anticorpo primário e é produzido geralmente em camundongo ou em coelho. A
incubação da membrana com o anticorpo primário geralmente ocorre overnight e,
depois disso, a membrana é lavada intensamente com tampão de lavagem para retirar
todo o anticorpo que não está especificamente ligado à proteína de interesse.
 Elaboração: Luis Carlos
POP – WESTERN BLOT
(Promega)

Objetivo
Separação das proteínas por peso molecular através de uma eletroforese, seguindo-se da
transferência para uma membrana e a detecção da proteína de interesse com um anticorpo
específico.

Material Necessário
● PhastGel Blue R250
● água destilada
● metanol
● ácido acético
● Separating gel 4x buffer
● 30% Acrylamide solution
● SDS – Polyacrylamide
● wash solution
● TEMED
● Stacking Gel (H2O (milli-Q) 1.0ml, solução de acrylamida 30% 300ml, stacking gel 4x
buffer 444ml, 10% amonium persulfate 28ml, TEMED 4ml)
● Buffer de transferência (glicina 39mM, tris base 48mM, SDS 0,037%, metanol 20%,
Blotto, leite diluído a 5% em PBS 1X, Tween-20 0.05%)
● Marker
● Papéis filtros
● Membrana de nitrocelulose
● Pipeta
● Pente
● Placas de vidro
● Extran
● Álcool
● Estufa
● Kit ECL de Quimioluminescência
● Eppendorf

Soluções para preparação do gel

● Separating gel 4x buffer:
Tris base 18.17g
SDS 10% 4ml
H2O q.s.p 100ml
pH 8.8

 30% Acrylamide solution

acrylamide 30g
bisacrylamide 0.8g
H2O q.s.p 100ml

 Running 10x buffer

 Tris base 30g
glicina 144g
SDS 10% 100mL

 Staining solution 1
ácido acético glacial 100mL
metanol 450mL
H2O 450mL
Coomassie blue 1,25g

30% Acrylamide solution TRIS base PhastGel Blue R250 Eppendorf

Membrana de nitrocelulose Pápeis filtros Pente

Interpretação
● Em amostras não reagentes terá a ausência de reatividade independente da proteína viral
usada. Já nas amostras reagentes, há presença de reatividade em pelo menos duas das
seguintes proteínas: p24, gp41, gp120 e gp160.

Descrição da Atividade
PREPARAÇÃO DO GEL
● Dissolver 1 tablete de PhastGel Blue R250 em 80mL de água destilada e manter sob
agitação por 5-10 min.
● Adicionar 120mL de metanol e deixar sob agitação até que o corante dissolva. Filtrar a
solução. Esta solução é estável por 3 semanas à 4°C.
● Solução final:
● Para uma solução 0,1% misturar 1 parte da solução stock filtrada com 1 parte de ácido
acético 20% em água destilada.

CORRIDA
 Lavar as placas de vidro e alumina com Extran, enxaguar com água destilada e depois
com álcool. Secar na estufa. Não tocá-las com os dedos.
 Montar o “sanduíche” sobre uma superfície plana.
 Preparar o SDS - Polyacrylamide gel e colocar com uma pipeta. Esperar polimerizar
(±15’)
 Retirar possíveis bolhas com adição da wash solution.
 Preparar o Stacking Gel. O último reagente a ser adicionado é o TEMED.
 Colocar na cuba, colocar o pente diagonalmente para evitar bolhas e esperar
polimerizar.
 Retirar o pente, lavar com água com 0.1% SDS para retirar as bolhas
 Colocar as amostras e o Marker (3-5mL).
 Correr o gel a uma amperagem de 15mA no Stacking gel e 25mA no SDS -
Polyacrylamide gel.

TRANSFERÊNCIA
 Retirar o gel da cuba, marcar o canto esquerdo superior, cortar os pentes e medir o
gel. Manter sempre o gel umedecido com buffer de transferência.
 Cortar os papéis filtros e a membrana de nitrocelulose (NC) no mesmo tamanho do gel
(EXATAMENTE). Não tocar a membrana com as mãos.
 Colocar no transferidor 3-6 camadas de papel filtro imersos em tampão de
transferência. Sobre o papel filtro colocar a NC. Colocar o gel, e sobre ele, mais 3-6
camadas de papel filtro. Tudo deve estar embebido em tampão de transferência e as
bolhas expulsas com um tubo de ensaio.
 IMPORTANTE: NÃO PODE HAVER CONTATO ENTRE AS CAMADAS DE
PAPEL FILTRO, POIS PODE HAVER ESCAPE DE CORRENTE.
 Controlar a amperagem do transferidor em 0,8mA/cm2 de membrana. Deixar transferir
durante aproximadamente uma hora.
 Retirar a NC (não toca-la com as mãos) e incubá-la em blotto (5% leite + 0.05% tween
20) sob agitação moderada.
 Incubar com anticorpo devidamente diluído em blotto durante uma a uma hora e meia
sob agitação lenta.
 Lavar com TBS (20mM TRIS + 385mM NaCl + 0.05% Tween 20) 4 vezes por 15
minutos.
 Incubar com conjugado anti- mouse devidamente diluído em blotto, durante uma hora.
 Lavar com TBS 4 vezes por 15 minutos

REVELAÇÕES
● Utilizar o Kit ECL de Quimioluminescência, misturando na proporção de 1:1 os dois
reagentes de revelação, colocá-lo sob a NC, envolvê-la com plástico, e coloca-la no
cassete.
● Em câmara escura, cortar o filme, colocá-lo dentro do cassete, durante 5min (variável).
● Retirar o filme e revelá-lo, deixando-o 2 minutos em solução reveladora, lavar, deixar
mais dois minutos em solução fixadora.

PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO
● Com o tapete apresentando por volta de 30% em garrafa de 75 cm 2 tripisinizar o
tapete como no cultivo celular (3 vezes 1 ml ...)
● Com o 1 ml de tripsina + células obtido, recolher em um eppendorf e centrifugar
● Desprezar a tripsina e lavar o pellet obtido com 200ml de PBS
● Desprezar o PBS e colocar 250 ml de Loading Buffer (250ml para cada 75cm
2 de cultivo do vírus)
 ● Ferver a amostra no momento da corrida por 3-5 min.

Indicações
 Deixar as amostras e os reagentes atingirem a temperatura ambiente antes de iniciar o
processo;
 Usar exatamente os volumes indicados;
 Seguir rigorosamente os ciclos de lavagens indicados pelos fabricantes;
 Tomar cuidado para evitar contaminação cruzada de amostras;
 Conferir se todos os materiais necessários para a realização do teste estão no kit;
 Usar os reagentes de cada kit até sua data de validade descrita na parte externa da
embalagem e se passar da data da validade jogar fora em recipiente apropriado;
 Antes de iniciar o teste analisar se os reagentes estão límpidos sem alteração na
coloração;
 Os substratos devem ser guardados longas de substância oxidantes ou de metais para
evitar sua decomposição;
 Fazer a manutenção periodicamente dos equipamentos de lavagem e por fim, estar
sempre atualizado as indicações do fabricante nas instruções do kit caso ele mude.

Referências
Protocolo do Luis Carlos (Promega) <Microsoft Word - aulap24.doc (ufrgs.br)>
REFERÊNCIAS

- SciELO - Brasil - Imunofluorescência direta e indireta Imunofluorescência direta e indireta

- Imunofluorescência direta e indireta: diferenças,vantagens e desvantagens (ibapcursos.com.br)

- Técnica de FAN - Imunofluorescência Indireta https://youtu.be/fblyi4r-N7w

- Técnicas & Metodologias | EUROIMMUN Brasil - Medicina Diagnóstica

- Apresentação do PowerPoint (unesp.br)

- Western Blotting: Sample Preparation to Detection | Protocol (Translated to Portuguese) (jove.com)

- e-Aulas da USP :: Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI

- Apresentação do PowerPoint (unesp.br)

- Western Blotting: Análise de Proteínas - Kasvi

- http://www.conhecer.org.br/enciclop/2012b/ciencias%20agrarias/western.pdf

- Link <Western Blotting: Sample Preparation to Detection | Protocol (Translated to Portuguese)

(jove.com)>

- Microsoft Word - aulap24.doc (ufrgs.br)