Universidade Federal da Paraíba

Centro De Ciências Exatas e da Natureza

Departamento de Biologia Molecular
Fundamentos de Química de Proteínas

Discente: Matheus V. S. Laurentino

Resumo de Imunoensaios
Técnicas para detecção ou quantificação de antígenos ou anticorpos, podendo usar
reagentes marcados ou não. Os ensaios marcados possuem menor sensibilidade de
detecção pois é necessário que se forme quantidade de imunocomplexos para que se
processe a visualização do fenômeno.
Detecção direta de ligação antígeno anticorpo: ensaios de precipitação, aglutinação e
floculação.
Detecção com marcadores ou sistema revelador: Elisa, cromatográfica etc.
Os sistemas reveladores são compostos por enzimas e substratos, as enzimas podem estar
ligadas ao antígeno ou anticorpo.
Tipos de testes
• Qualitativo: positivo (reagente) ou negativo (não reagente).
• Semiquantitativo: amostra testada é diluída, por diluição seriada, para determinar
a titulação da amostra. Exemplo: título 32 (amostra reagente até 32 diluições).
• Quantitativo: obtém a quantidade absoluta do material detectado, calculada a
partir de uma curva padrão.

Parâmetros dos testes

Especificidade: capacidade de detectar verdadeiro-negativos (VN) e evitar falso-
positivos (FN). Usados para a confirmação do diagnóstico. E= VN/VN+FP
Sensibilidade: capacidade de detectar verdadeiro-positivos e evitar falsos-negativos.
Testes indicados para triagem. S= VP/ VP+FN

Aglutinação
Detecção direta da interação antígenos-anticorpos a partir da visualização de agregados
formados.
IgM é a imunoglobulina mais eficiente para aglutinação por ter mais sítios e formar
agregados maiores.
Pros: alta sensibilidade, fácil, barato.
Contra: pode apresentar muitas alterações, baixa reprodutividade dependendo do kit
Existe dois tipos de aglutinação direta e indireta
Aglutinação direta: os antígenos estão naturalmente ligados a células e hemácias. Ex:
hemaglutinação direta para tipagem sanguínea.
Aglutinação indireta: antígenos são adsorvidos (fixados) em partículas, células ou
hemácias. Essa adsorção é feita para que tenha tamanho para os agregados serem visíveis.
Ex: teste ALSO e hemaglutinação indireta.
Aglutinação indireta reversa: é feita com anticorpos adsorvidos em partículas.

Os antígenos e anticorpos podem ser adsorvidos em partículas de látex, hemácias e

células. Partículas de látex são esferas de poliestireno utilizadas como suportes na
adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídeos, funcionando como sistema
indicador da reação antígeno-anticorpo. O teste pode ser empregado na pesquisa de
antígenos ou anticorpos.

Microaglutinação
Aglutinação realizada em placa de 96 poços em fundo U. As amostras reagentes vão
formar um tapete que cobre o fundo do poço, já amostras não reagentes fica apenas um
botão formado pelas hemácias que sedimentaram.
Teste de coombs
Teste para detectar anticorpos na mãe (Rh-) contra o fator Rh+ do feto, e tentar evitar
eritroblastose fetal.
Pode ser feito de forma direta e indireta
Coombs direto: pra saber se tem anticorpo materno ligado no Rh+ da hemácia do recém-
nascido.
Coombs indireto: pra saber se a mae tem anticorpos contra o Rh+

Floculação
Variante da aglutinação indireta, ocorre quando a interação direta de anticorpos
específicos com o antígeno leva a formação de imunocomplexos em meio líquido,
detectáveis com auxílio de lupa ou microscopia. Um exemplo é o teste VDRL, o efeito
prozona é muito importante evitá-lo, existe uma portaria do MS que determina que o teste
deve ser feito com a mostra não diluída e diluída por

Ensaios conjugados
ELISA
Tecnica imunoenzimatica (que usa sistema revelador para detecção de antigenos e
anticorpos), sensível, heterogenica e quantitativa.
A ação da enzima sonre o substrato forma um produto coroleido que pe moniorada
visualmetne ou por meido de espectofotômetro, que determina a reação entre a
intensidade da cor e a quantidade do que está sendo analisado na amostra.
Pros: elevada sensibilidade e especificidade, capacidade de altomação entre outros.
Podem ser competitivos ou não competitivos: os não competitivos a deteção da cor é
diretamente proporcional a quantidade de Ag ou Ac detectado. Os competitivos a
datecção da cor é inversamente proporcional a quantidade de Ag ou Ac detectado.
Elisa direta: usada para medir antigenos baseada na competição entre o antigeno da
amostra e o antigeno marcado com enzima pelo anticorpo.
Elisa indireto ou ensaio imunométrico: mede a concentração de anticorpo usando o
antigeno ligado a fase solida (fixado).
Elisa Sanduiche: usando um anticorpo fixado na fase solida para capturar o antigeno e
outro ligado a enzima para revelar a quantidade de antigenos tem na amostra. No
sanduiche anticorpos tambem pode ser pesquisados.
1. Coating (anticorpo primario ou de captura é fixado na placa de poliestireno) (em
elisa indireta o antigeno é fixado na placa)
2. Lavagem a primeira lavagem deve retirar o coating que não foi fixado na placa
3. Bloqueio do fundo da placa para não deixar mais nada se ligar evitando ligações
inespecíficas da amostra ou do antigeno do sistema revelador.
4. Lavagem para retirar o excesso de proteina usada no bloqueio da placa
5. Amostra, ela vai conter ou não o alvo, seja um antigeno na sanduiche ou direta ou
seja um anticorpo na indireta.
6. Lavagem para retirar tudo aquilo que não se ligou com o coating
7. Anticorpo secundário que faz parte do sistema reveçador deve está conjugado com
a enzima, caso ainda não estija conjugado uma fase é adicionada para colocar a
enzima e depois lavagem antes de colocar o substrato).
8. Lavagem para retirar o exvcesso de anticorpos que não se ligou ao complexo
formado no elisa, essa é uma das lavagens maisn importantes visto que o que ficar
de excesso vai ser mostrado pelo sistema revelador.
9. Substrato, uma substancia cormogenica que ao ser quebrado pela enzima do
sistema revvelador, vai gerar cor.
10. Parada da reação, como a proporção de substrato/ enzima não é conhecida (a
quantidade de enzima depende da formação de complexos) uma enzima pode
metabolizar mais de um substrato, então a reação deve ser parada com um acido
oou alg que desnature a enzima.
11. Leitura, é feita no espectrofotometro, com a quantificação é feita relativa a uma
curva padrão que é preparada com quantidades conhecidas de antigeno isso
permite saber quantos complexos foram formados na reaação.
As placas: placas de poliestireno ideal papra a fixação.
Amostras: soro ou plasma.
Boqueio: feito com leite desnatado, caseina, gelatina e albumina.
Diluente: assay buffer (tampão de BSP soro e com twinn)
Enximas: peroxidase ou fosfatase alcalina
Substratos:
Anticorpos biotinizados ( anticporpos ligados a streptoabidina que tem alta afinidade pela
porção Fc do anticorpo humanos, isso permite usa-la para ligar o anticorpo com a
peroxidase
Substratos cromogenicos:
Espectrofotômetro:

Radioimunoensaio
Antigenos ou anticorpos macados com radioisotopos como o iodo 125, que se liga
facilmente a residos de tirosina das pproteinas com tempo de meio vida de 57 dias. EX:
teste RAST que pesquisa IgE alergêno.
A leitruia é feita em leitor radiométrico
Podem ser competivios ou sanduiche
Competitivo: Ag ou Ac marcado com radioisotopo, e como é competitivo quanto menor
a radiação maior vai ser a detecção doque se deseja.
Sanduiche: o principio é o mesmo da elisa sanduiche, mas o anticorpo secundário está
conjugado com radioisotopos.

Quimiluminescência (Substituto dos radioensaios)

A interação Ag e Ac ou a quantidade, é medida a partir da detecção de energia luminoza,
produzida pela metabolização do substrato que produz cor.
Peroxidase: luminol
Realizada em equipamentos totalmente automatizados, com alta sensibilidade.
Pode ser feita em placa ou em bids magnéticas que diminue as etapas e facilita o teste
Amplamente aplicados para detecção de hormonios e drogas, atualmente já existe
diversos testes que já são aprovados para detecção de anticporpos. 45min de teste já elisa
leva 1,5h.
Imunofluorescência
Anticorpos de detecção é conjulgado com fluorocromo.
Realizada em uma lamida contendo celuas, tecidos, antigenos ligados.
É avaliaada em microscopio de fluorescencia que possui luz para excitar os fluorocromo
Direta: pesquisa de antigenos na amostra, a amostra fixida na lamina e usa um anti-her2
conjugado com o fluorocromo. Ex: Biopsia de mama pesquisa por Her2.
Indireta: pesquisa de anticorpos na amostra usa uma lamina para capturar os anticorpos
que vão ser pesquisados, e depois é adicionada anticorpos anti-anticporpos ligados a
fluorocromo. Ex: Ac anti-Her2.

ImunoHistoquimica
Mesmo principio da imunofluorescência, mas o anticorpo está conjulgado com uma
enzima que metaboliza um substrato produzindo pigmento que precipita e cora o tecido.
Citometria de fluxo
Uso de anticorpos marcados com fluorocromos para analise de componentes estruturais
celulares e particulas microscópicas por meio da medição do desvio de luz incidente sobre
a célula/paricula e de sinais fluorecentes gerados.
O citometros permite a caracterização básica de morfologia celular: tamanho relativo e
complexidade interna (refletindo vesículas e oranelas)
Capaz de detectar qualquer célula ou particula em suspenção com diametro entre 0,2 e
100 micrometro, alem de identificar a emissão de dezzenas de espectrod de florescencia
pelos fluorocromos.
A principal aplicação é no diagnostico e prognostico de leucemias e linfomas e
monitoramento de contagem de linfócitos T CD4+ em pacientes HI0V+.
Fluorocromos são essencialmete corantes que absorvem a luz em um cpmprimento de
onda e emite com um comprimento de onda maior.