Universidade Federal da Paraíba

Centro De Ciências Exatas e da Natureza

Departamento de Biologia Molecular
Fundamentos de Química de Proteínas

Discente: Matheus V. S. Laurentino

Introdução
A dosagem de proteínas permite a quantificação da concentração de proteínas totais em
uma determinada amostra biológica, os métodos de quantificação de proteínas solúveis em
meio aquoso são: método de Biureto, método BCA, método de Lowry, método de Bradford, e
método de absorbância no ultravioleta.
Na aula de dosagem de proteínas, fizemos a construção de retas padrão dos métodos de
Bradford e Lowry. O objetivo dessa aula foi determinar o melhor método para quantificar nossa
proteína de interesse, a caseína do leite de cabra. O método de Bradford é rápido, simples e
mais sensível que o método de Lowry. O ensaio de Bradford baseia-se na ligação do corante
azul de Coomassie (G250) com a proteína. E a quantidade de corante ligado a proteína pode
ser feita em um espectrofotômetro a 595nm. O método de Lowry baseia-se na reação de
Biureto, onde as proteínas reagem com sais de cobre II em solução alcalina, que é seguido da
redução do reagente de Folin resultando na formação de substância colorida de cor azul, a
intensidade da cor é determinada por espectrofotometria em comprimento de onda de 750nm.
Na aula de cromatografia, realizamos a cromatografia de troca iônica que separa
moléculas polares e íons com base na sua afinidade com a resina da coluna (sua força iônica).
Para separação de proteínas usamos a variação de pH para dá carga a proteína, proteínas em
pH acima do seu pI terão carga negativa e se ligam a resinas carregadas positivamente
(trocadores aniônicos), e em pH abaixo do seu pI irão assumir carga positiva e se ligando a
resinas carregadas negativamente.
Metodologia
Quantificação
A confecção da reta padrão para quantificação por Bradford foi feita seguindo a metodologia
descrita por Kruger (1994), usando albumina nas concentrações de 0,0039- 0,2496 mg/mL.
Para preparar a curva padrão para quantificação por método de Lowry primeiro fizemos as
seguintes soluções NaCO3, CuSO4.5H2O, NaOH e tartrato de potássio de sódio. Foi a curva
padrão foi produzida seguindo o que está descrito em Waterborg, et al., (1994), usando as
concentrações de 0,031- 0,992mg/mL de albumina.
Cromatografia
Realizamos a cromatografia de troca iônica usando uma resina aniônica FastFlow de 3mL, foi
ambientada com 10 vezes o volume da coluna (CV). A amostra foi aplicada e eluida com cerca
de 10 CV. Ao obter a absorbância zero a 280nm, foi eluido com o tampão com gradiente
crescente de NaCl até 1M.
Análise
A construção dos gráficos, cálculo das equações das retas e R² foi feito usando o Software
Excel.
Resultados
Obtemos as retas padrão para ambos os métodos, no de Bradford (figura 1) nas
concentrações de 0,0039- 0,2496 mg/mL tivemos uma reta com R² de 0,8781, já no de Lowry
(figura 2) no intervalo de 0,031- 0,992mg/mL obtemos uma reta com R² de 0,9924, logo, a reta
padrão de Lowry ficou mais adequada para os próximos experimentos. Ainda, devemos
considerar que a caseína é uma proteína em alta concentração no leite, a reta padrão de Lowry
compreende o intervalo de concentrações que é maior do que o de Bradford, e usar esse método
permitirá respeitar a linearidade do espectrofotômetro. Entretanto, esse método tem baixa
sensibilidade, sendo recomendados para concentrações de proteínas de 0,01 a 1,0 mg/mL.
O reagente de folin interage com aminoácidos aromáticos presentes na proteína,
principalmente tirosina, em menor grau com o triptofano e fenilalanina. Assim, a intensidade
de coloração vai depender da natureza da proteína, uma vez que diferentes tipos de proteínas,
possuem resíduos diferentes de aminoácidos e consequentemente podem dar reações de cor de
intensidade diferente, portanto, para usá-lo para a quantificação é recomendado fazer a reta
padrão com uma proteína que possua resíduos de aminoácidos semelhantes à da caseína.
Também, o método de Lowry possui diversos interferentes como sais, compostos tiol,
carboidratos, lipídios e solventes orgânicos, mas como a amostra passou anteriormente por um
processo de purificação parcial com a precipitação em sulfato de amônio seguida de uma
dialise, espera-se que a presença desses interferentes esteja reduzida.
Nas cromatografias usando pH de 5,0 e 7,5 obtemos 18 frações em cada pH. Na cromatografia
de pH 5,5 até a 7° fração ela foi eluida com tampão sem NaCl, ou seja, com baixa força iônica e tudo o
que não se ligou a coluna foi retirado. A partir da 8° fração se início a eluição com tampão com gradiente
de concentração de NaCl, que exerce força iônica, assim o que tinha anteriormente se ligado a coluna
começou a desprender, assim observamos que a fração 10 possui uma maior quantidade de proteínas,
então espera-se que a nossa proteína de interesse esteja nessa fração ou em frações próximas. O mesmo
foi realizado em tampão pH 7,0, mas nele observamos que a fração 11 possui uma maior concentração
e a amplitude é menor podendo indicar uma maior pureza. Eletroforese ou ensaios de atividade
específica precisam ser feitos para confirmação.
Figura 1: gráfico com a reta do método de BRADFORD

Figura 2: gráfico com a reta do método de Lowry

 Figura 3: gráfico da quantificação das frações obtidas por cromatografia de troca iônica.

Referencias
Waterborg, J.H.; Matthews, H.R. The Lowry method for protein quantitation. Basic Protein
and Peptide Protocols. Methods Mol. Biol. 1994.
Kruger N. J.; The Bradford Method for protein quantitation. Basic Protein and Peptide
Protocols. Methods Mol. Biol. 1994.