PL1- PROTEÍNAS – DOSEAMENTO POR ESPETROFOTOMETRIA

UV/VISÍVEL

CONCEITOS BÁSICOS SOBRE ONDAS E COR

Frequência = 1 oscilação por segundo

Os λ (comprimentos de onde) que uma certa substância absorve são característicos da sua
estrutura.

Cada substância tem um espetro de absorção característico, podendo, desta forma, ser
identificada.

LEI DE LAMBERT-BEER
A quantidade de radiação absorvida pode ser calculada de diferentes formas:

▪ Transmitância T = I/I0 T(%)

= 100 x T

▪ Absorvância A = log10 I0 /I A
= log10 1/T

LEIS DA ABSORÇÃO
1. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução que ela
atravessa

Ex: Absorvância: 20g/l > 10g/l

2. A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe
luminoso através das amostras

Ex: Tem maior absorvância 3cm > 1cm

LIMITE DE LINEARIDADE
A concentração tem um limite de saturação.

Com o aumento da concentração a linearidade deixa de ser constante.

O limite de linearidade é 2 mg/ml.

Uma amostra desconhecida só e lida até 2 mg/ml e 0.40 de absorvância.

A absorvância é o dobro da concentração, mas só até o limite de linearidade.

ALBUMINA
Concentração no plasma: 45 g/L

Representa ≈ 60% das proteínas plasmáticas

Principais funções:

 Manutenção da pressão osmótica do plasma

 Transporte de:
▪ Hormonas esteroides
▪ Ácidos gordos livres
▪ Bilirrubina
▪ Fármacos
▪ Iões (Ca2+ e Cu2+)

MÉTODO DE BRADFORD
Técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante Coomassie brilliant
blue G-250.

A interação entre o corante de Coomassie com a proteína, causa uma visível mudança de
coloração inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da
proteína.

Solução com concentração nula ou baixa em proteínas- cor castanha.

Solução com concentração crescente de proteínas- coloração mais azulada.

Este método tem sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos meios:
plasma sanguíneo, saliva humana, produtos alimentares, leite humano, etc.

Vantagens:
Simples; rápido; económico;
Alta sensibilidade na deteção;
Poucas etapas;
Não requer aquecimento;
Possui grande estabilidade colorimétrica.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

PARTE 1: DETERMINAÇÃO DO ESPETRO DE ABSORÇÃO DO COMPLEXO ALBUMINA-

BRADFORD

1. Colocar 50 µL de uma solução a 5 mg/mL de BSA (albumina) e juntar 50 µL de água

destilada num tubo de ensaio.

2. Homogeneizar bem no vórtex.

3. Preparar outro tubo de ensaio com 100 µL de água destilada.

4. Adicionar 0,5 mL de reagente de Bradford (azul Coomassie) a cada tubo e aguardar 5

minutos.

5. Regular o espetrofotómetro para 400 nm. Acertar o zero com a solução de BSA de
concentração 0 mg/mL – Branco. Registar a absorvância.

6. Continuar as medições em intervalos de 15 nm até um comprimento de onda de 700 nm.

PARTE 2: CONSTRUÇÃO DE UMA CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA A PROTEÍNA BSA

1. Pipetar para tubos de ensaio devidamente marcados:

2. Homogeneizar os tubos no vórtex.

3. Adicionar 0,5 mL de reagente de Bradford (azul Coomassie) e aguardar 5 minutos.

4. Regular o espetrofotómetro para 595 nm. Calibrar com a solução de BSA de

concentração 0 mg/ml – Branco. Ler a absorvância de cada solução preparada no ponto 1.

PARTE 3: DETERMINAÇÃO DA ABSORVÂNCIA DAS AMOSTRAS

1. Pipetar, para tubos de ensaio devidamente marcados, 0,1 mL de cada amostra e

adicionar 0,5 mL de reagente de Bradford.

2. Homogeneizar e aguardar 5 minutos.

3. Ler a absorvância de cada amostra a 595 nm. Caso os valores de absorvância sejam
muito elevados, diluir as amostras
 QUESTÕES PÓS-LABORATORIAIS

1. Indique qual a enzima associada à primeira etapa de degradação enzimática

do colesterol.

Na primeira etapa da degradação enzimática do colesterol é utilizada uma enzima, a

colesterol esterase.

2. Indique o principal motivo para a utilização desta enzima.

De entre os vários motivos para a utilização desta enzima, podemos realçar a sua
ação de hidrolise sobre os ésteres de colesteril, isto é, a clivagem da ligação entre
os ácidos gordos e colesterol.

3. Com base nas bulas de cada kit comercial, ambos os protocolos requerem um
período de incubação.

3.1. Relacione os períodos/temperaturas de incubação com o que ocorre a nível

biológico.

Nos processos a nível biológico, a temperatura corporal (aproximadamente 37ºC) é

um dos parâmetros ideais para a atuação das proteínas. Considerando que não se
apresentava um valor tão discrepante desta no laboratório, é possível efetuar um
paralelo de similaridade entre o que ocorre a nível biológico e o experienciado na
atividade prática. Além deste fator, o período de incubação experimental
(ligeiramente inferior a 10 minutos) permite a decomposição do colesterol presente
na amostra por ação das enzimas. Se a temperatura verificada fosse 37ºC, este
processo ocorreria num intervalo de tempo menor.

4. Indique a importância do doseamento rápido de biomoléculas como o

colesterol e os triglicerídeos.

O doseamento rápido de biomoléculas como o colesterol é um processo fulcral na

manutenção dos níveis normais das mesmas, além de ter extrema importância na
prevenção de doenças de foro cardiovascular.