RELATÓRIO 4

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS

ALUNA: LOHAYNE SZEREMETA, R.A.: 18009025

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS – CURVA DE

CALIBRAÇÃO

Espectrofotometria é um procedimento analítico através do qual se determina a

concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante, Cada
composto absorve luz em uma certa amplitude de comprimento de onda. A quantidade
de luz absorvida é proporcional à concentração da substância em solução.
Quando a radiação emitida pelo equipamento atravessa uma camada de sólido, líquido
ou gás, parte das frequências emitidas de energia (luz) são absorvidas e/ou refletidas
pela amostra.

A Lei de Lambert-Beer diz que a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma
determinada solução absorbância é proporcional à concentração do soluto presente,
sendo constante o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e
demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância e concentração, e de
uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.

Dedução das equações da Lei de Beer:

Onde:
▪ A: absorbância (unidades de absorbância)
▪ a: absortividade (cm-1.conc-1(quando concentração molar, absortividade molar )
▪ b: caminho ótico (largura da cubeta, cm)
▪ C: concentração
A determinação da concentração de um soluto em uma solução-problema pelo método
espectrofotométrico envolve a comparação da absorbância da solução problema com
uma solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto.
Utilizando-se de uma curva de calibração ou curva padrão qual trata-se da resposta
observada na realização de um método analítico para quantidades conhecidas de
constituinte. Para os experimentos de espectrofotometria, é realizado a partir de
soluções padrões de concentrações conhecidas do determinado composto, quais
através das medidas de absorbância observadas podem construir a curva de calibração
do determinado composto. A curva padrão corresponde à relação gráfica entre os
valores de absorbância e os de concentração. Ao realizar a análise gráfica é possível
verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de
absorbância em concentração, assim essa curva poderá ser utilizada para determinar a
concentração deste composto em diferentes amostras.
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de
cobre e hidróxido de sódio com um complexo que estabiliza o cobre em solução, no
presente caso tartarato de sódio. O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas
formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica de coloração
violeta-azulada. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270
nm e outra em 540 nm. A banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins
analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios
analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método.
A presente prática tem como objetivo a realização de uma curva padrão para proteínas
pelo método de Biureto

Materiais e métodos

Água destilada
Sulfato de cobre pentaidratado
Tártaro duplo de sódio e potássio
Solução de hidróxido de sódio
Solução de proteínas (Albumina bovina)

Reagente do Biureto: dissolveu-se 1,5g de sulfato de cobre pentaidratado, 6,0g de

tartarato duplo de sódio e potássio em 500 mL de água destilada, adicionou-se 300 mL
de solução de hidróxido de sódio a 10% com constante agitação. Posteriormente
adicionou-se água destilada suficiente para 1 litro de solução.

Solução padrão de proteína: 5 mg.mL-1

Curva de calibração: Foram utilizados 6 tubos, sendo um deles o tubo branco, destinado
para zerar o equipamento. Em cada um dos 5 tubos foram adicionadas diferentes
concentrações de solução padrão de proteínas, e corrigiu-se a diferença de volume com
água destilada, pois o volume fixo era de 1 mL para todos os tubos. Em seguida,
adicionou-se o reativo Biureto, agitou-se e foi deixado reagir por 10 minutos.
O espectrofotômetro foi calibrado com o tubo branco e foram realizadas as leituras dos
padrões a 540 nm.
A Tabela 1 abaixo demonstra os dados para cada tubo:

Tubos 1 2 3 4 5 6
Reagentes Tubo
branco
Solução padrão de proteína - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
(5 mg/mL)
Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -
Reativo do Biureto 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Leituras dos padrões (λ 540nm) - 0,042 0,085 0,128 0,172 0,210
Concentrações dos padrões (mg/mL) - 1 2 3 4 5
Resultados e Discussão
Tabela 2 apresenta as concentrações dos padrões de proteína utilizados e os valores de
absorbância obtidos
Tabela 2: Dados de concentração e absorbância para a presente solução padrão.
Tubos 1 2 3 4 5 6
Leituras dos padrões (λ 540nm) - 0,042 0,085 0,128 0,172 0,210
Concentrações dos padrões (mg/mL) - 1 2 3 4 5

O Gráfico 1 abaixo apresenta a curva padrão para solução de proteínas pelo método de
Biureto, e a equação da reta para a presente curva.
Gráfico 1: Curva de calibração das soluções de proteína

As ligações peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagem com íons cúpricos em meio
alcalino provenientes do reagente Biureto formando um complexo de coloração violeta,
cuja absorbância medida em 540 nm é diretamente proporcional à concentração de
proteínas na amostra. Assim, amostras com maior concentração de proteína apresentam
coloração mais intensa, resultando em absorção de energia maiores. A partir desta curva
de calibração é possível calcular a concentração de proteínas utilizando o método de
espectrofotometria em conjunto com a reação de Biureto.

Conclusão
A partir deste experimento foi possível realizar a curva de calibração para quantificação
das concentrações de proteínas utilizando do método de biureto com espectrofotometria.

Referências Bibliográficas

KASVI. Espectrofotometria: Análise da concentração de soluções.

Disponível em: https://kasvi.com.br/espectrofotometria-analise-concentracao-solucoes/
Acesso em: 06/03/2021

XV Curso de Verão em Bioquímica e Biologia Molecular- Métodos

espectrofotométricos mais utilizados para a determinação de proteínas totais
Disponível em:
http://cursobioquimica.iq.usp.br/paginas_view.php?idPagina=503&idTopico=1060#.YE
aDQVVKjIX
Acesso em: 06/03/2021

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO- Bioquímica: Roteiro de Aulas Práticas

Disponível em:
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4935544/mod_resource/content/1/Apostila%20
Bioquimica%202019.pdf
Acesso em: 06/03/2021

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica, Guanabara Koogan, Compri-Nardy

M., Stella M.B., Oliveira C. (2009), 200 págs.