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BIOQUÍMICA - Doseamento das proteínas pelo método do bioreto (Relatório)

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INSTITUTO POLITÉCNICO DE SANTARÉM – ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA CURSO DE ENGENHARIA DA PRODUÇÃO ANIMAL BIOQUÍMICA

Doseamento das proteínas pelo método do bioreto (Relatório)

#2439 – David Quintino #2466 – Filipe Sampaio #2587 – André Chucha

Este trabalho teve como objectivo a determinação da quantidade de proteína numa amostra. Para tal foi utilizada a espectroscopia de absorção molecular, mais concretamente o método do Biureto. Esta reacção ocorre com todos os compostos que contenham duas ou mais ligações peptídicas, formando-se um complexo azul púrpura. A concentração da proteína na amostra foi calculada a partir de uma curva de calibração feita usando uma solução proteica padrão, a solução de albumina de soro bovino (BSA) 2mg/mL. A equação da recta de calibração é y = 0,0371x + 0,0159 e através dela e dos valores da absorvência para o tubo 6 e 7, podemos concluir que as suas concentrações são: 21,17 mg/mL e 8,277 mg/mL, respectivamente. Em relação à Lei de Lambert – Beer podemos concluir que existem desvios, pois o coeficiente de correlação (r) = 0,9878, quando deveria ser 0,9999.

Resumo

Introdução Teórica
Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ ou emissão de radiação electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultra violeta e o infra vermelho. A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultra violeta ao infra vermelho no espectro da radiação electromagnética. O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 µm. Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida em cada comprimento de onda. O conjunto das absorvências dos vários comprimentos de onda para um composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância, a espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro como também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a concentração da substância. Existe então princípios de absorção da luz: A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada; A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras.

Juntando estes princípios temos a lei de Lambert – Beer:

Abs = E. b. c

A absorvência da luz a cada comprimento de onda

é directamente

proporcional à concentração da solução contida na couvette. Esta linearidade deixa de ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nestes casos diluir previamente a amostra a medir. Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda. Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos, o composto a quantificar é posto em contacto com um reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja intensidade é directamente proporcional à concentração da substância na mistura original. Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode medir-se a absorvência a 280µm, sendo esta proporcional à concentração de proteína. Mas se quisermos saber a concentração de proteína num extracto impuro, este método já não pode ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo os ácidos nucleícos, também absorvem a este comprimento de onda. Neste caso, podemos utilizar, por exemplo, o reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as proteínas, originando um complexo violeta, que absorve fortemente a radiação a 540µm. Para quantificar espectrofotométricamente uma substância é necessário saber o valor de . Para isso é necessário preparar uma série de soluções do composto a quantificar, de concentração conhecida, fazê-las contactar com o reagente e medir as absorvências ao comprimento de onda adequado. Assim, podemos fazer corresponder uma absorvência medida, a uma concentração de substância na solução a analisar, obtendo deste modo, uma curva de calibração. Na determinação da concentração de proteínas, objectivo deste trabalho, há que ter em conta que nem todas as proteínas exibem o mesmo comportamento perante os ensaios espectrofotométricos de doseamento.

As

características

físico-químicas

das

proteínas

exploradas

em

análises

quantitativas são: 1. As absorvências das cadeias laterais de resíduos aromáticos a 280µm; 2. Absorvências específicas de grupos prostéticos de proteínas, por exemplo do grupo heme a 415µm; 3. A ligação peptídica que forma um complexo violeta com Cu Biureto; 4. As cadeias laterais de Tyr e Trp, que reagem com agentes oxidantes no método de Lowry; 5. A ligação de corantes a regiões hidrofóbicas, como no método de Bradford; 6. As cadeias laterais de Lys e His e o terminal amina que reagem com a ninidrina. Cada método é aplicável a gamas restritas de concentrações de proteínas e apresentam sensibilidades e interferências a considerar, quando as amostras contém outras moléculas para além das proteínas. Entre as vantagens da utilização destes métodos, figuram a facilidade de execução e o facto de substâncias específicas poderem ser doseadas em soluções que contenham misturas de várias biomoléculas sem etapas prévias de purificação. A reacção do Biureto (método utilizado nesta experiência) é um dos métodos mais rápidos e mais utilizados no doseamento de proteínas. Foi um dos primeiros ensaios colorimétricos a ser desenvolvido. A natureza do complexo colorido não é conhecida em detalhe, no entanto pensa-se que está envolvida a formação de um complexo de cobre em soluções muito alcalinas com uma ligação peptídica das proteínas e também com alguns resíduos de tirosina, formando um complexo de cor violeta.
2+

na reacção do

Procedimento Experimental
Material e reagentes: o Solução padrão de albumina de soro de bovino (BSA) 2 mg/mL o Solução de proteína de concentração desconhecida o Reagente do Biureto: dissolveu-se 6g de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado em 500mL de água destilada. Adicionou-se lentamente 1,5g de sulfato de cobre pentahidratado e 300 mL de hidróxido de sódio10% (m/v). diluiu-se para 1 L. o Espectrofotómetro o Cuvettes para medição no visível (plástico ou vidro) o Tubos de ensaio o Copo de precipitação o Pipetas o Balança analítica Procedimento: 1. Preparou-se o branco e os tubos para a curva de calibração de acordo com o quadro: Tubo mL BSA mL H2O 1 0,3 1,2 2 3 4 0,5 0,7 1,0 1,0 0,8 0,5 Tubo branco: 1,5 mL de H2O 5 1,2 0,3

2. Diluiu-se o extracto proteico preparado na aula anterior 1/50 (0,1 mL de extracto + 4,9 mL de H2O) e prepararam-se os tubos com a amostra de proteína: Tubo 6: 0,2 mL de amostra + 1,3 mL de H2O Tubo 7: 1,0 mL de amostra + 0,5 mL de H2O 3. Adicionou-se 1,5 mL de reagente do Biureto a todos os tubos e agitou-se. 4. Deixou-se em banho-maria a 37ºC durante 15 minutos; 5. Leu-se a absorvência 540µm (calibrou-se o espectrofotómetro com o branco)

Apresentação e tratamento de resultados
Cálculos: o Tubo 1 2 mg ------------ 1 mL x ------------ 0,3 mL o Tubo 2 2 mg ------------ 1 mL x ------------ 0,5 mL o Tubo 3 2 mg ----------- 1mL x ----------- 0,7 mL o Tubo 4 2 mg ------------ 1mL x ------------ 1,0 mL o Tubo 5 2 mg ----------- 1mL x ----------- 1,2 mL x = 2,4 mg x = 2,0 mg x = 1,4 mg x = 1,0 mg x = 0,6 mg

TUBOS

Abs 540µm

mL de BSA

mg de proteína

1 2 3 4 5

0,051 0,097 0,118 0,170 0,200

0,3 0,5 0,7 1,0 1,2

0,6 1,0 1,4 2,0 2,4

Gráfico:
0,25 0,2 y = 0,0371x + 0,0159 R2 = 0,9878

ABS. 540nm

0,15 0,1 0,05 0 0,6 1,0 1,4 mg de proteína 2,0 2,4 Series1 Linear (Series1)

Cálculos: (amostras) A partir da equação da recta: y = 0,0371 x + 0,0159 o Tubo 6 0,173 = 0,0371 x + 0,0159 x = 4,234 mg Concentração do tubo 6 = (4,234 x 1) / 0,2 = 21,17 mg/mL o Tubo 7 0,323 = 0,0371 x + 0,0159 x = 8,277 mg Concentração do tubo 7 = (8,277 x 1) / 1 = 8,277 mg/mL Resultados do cálculo da massa (mg) apartir da equação da recta
4,234 8,277

TUBOS

Amostra (mL)

Abs. 540µm

Concentrações (mg/mL)

6 7

0,2 1,0

0,173 0,323

21,17 8,277

Discussão e conclusões
De acordo com os nossos princípios teóricos concluímos que existem desvios à Lei de Lambert–Beer pois o coeficiente de correlação é igual a 0,9878, quando deveria tomar valores próximos de 0,9999. Podemos também concluir que este é um método muito sensível, daí a existência de desvios, que podem ter ocorrido devido a pouco cuidado na execução e utilização da curva de calibração. No entanto, todos os objectivos foram alcançados, dentro dos quais se destaca a obtenção, através da recta de calibração y = 0,0371 x + 0,0159, do valor da concentração da amostra contida no tubo 6 e no tubo 7. Este trabalho permitiu também a familiarização com a técnica da espectrofotometria e um dos métodos colorimétricos mais utilizados – o método do Biureto.

Bibliografia
www.google.com Protocolo experimental dado na aula Sebenta teórica de Bioquímica

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