ENZIMAS DE RESTRIO VETORES DE CLONAGEM

Enzima de restrio:
Reconhecem seqncias especificas e cortam em lugares determinados. Reconhecem de 4 a 8 pares de bases. Reconhecem seqncias palindrmicas. Encontrada em ampla variedade de organismos procariticos.
Tipo I - Enzimas com capacidade de corte e metilao. Tm sequncias de reconhecimento especficas, mas cortam de forma inespecfica dentro da sequncia de reconhecimento. Enzimas de Tipo II - Apenas possuem capacidade de corte. A metilao feita por restrio protenas diferentes. Cortam sequncias especficas de forma tambm especfica. Tipo III - Enzimas com capacidade de corte e metilao. Cortam sequncias especficas de forma tambm especfica.

ALGUMAS ENZIMAS DE RESTRICAO UTILIZADAS EM BIOLOGIA MOLECULAR

ATIVIDADE STAR As enzimas em condicoes no ideais podem reconhecer e cortar em sitios no especificos. Os fatores que levam a atividade star so: 1. Alta concentracao de enzima (>100 unid/ug) 2. Alta concentracao de glicerol (>5%) 3. Substituicao de Mg por Mn. 4. Baixa concentracao de sal (<25mM) 5. pH extremos, especialmente acima de 8.0. 6. Presenca de DMSO, etanol ou outro solvente organico.

Anabaena variabilis Bacillus amyloliquefaciens H Bacillus globigii Escherichia coli RY13 Escherichia coli R245 Haemophilus aegyptius Haemophilus gallinarum Haemophilus haemolyticus Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzae Klebsiella pneumoniae Moraxella bovis Providencia stuartii Serratia marcescens Streptomyces stanford Xanthomonas malvacearum

Ava I BamHI BglII EciRI EcoRII HaeIII HgaI HhaI HindII Hind III HpaI HpaII KpnI MboI PstI SmaI SstI XmaI

C G A G

(C/T)CG(A/G)G GATCC GATCT AATTC CC(T/A)GG GG CC GACGC GCG C GT(C/T) (A/G)AC A AGCTT GTT AAC C CGG GGTTAA C GATC CTGCA G CCC GGG GAGCT C C CCGGG

INATIVACO TERMICA Grande parte das enzimas de restricao podem ser inativadas por calor (65C 15 min.) Enzimas inativadas: AatI, AluI, ApaI, AvaII, BalI, BamHI, BglI, ClaI, EcoRI, EcoRV, HindIII, HincII, MboI, MboII, MspI, NotI, NurI, PstI, PvuII, SacI, SalI, Sau3A, SmaI, XhoI, XmaI. Enzimas no inativadas: BanI, BclI, BglII, HaeIII, HinfI, HpaI, HpaII, PvuI, TaqI, XbaI.

ISOESQUIZOMEROS Enzimas de restricao com regioes coesivas complementares. Algumas reconhecem sequencias de numero diferente de bases. Exemplo: BamHI 5- G/GATCC- 3 e Sau3A ou MboI 5- N/GATCN- 3

INIBICO POR METILAO A metilao afeta a especificidade das enzimas de restrio. Os genes DAM e DCM de Escherichia coli codificam metilases que acrescentam um radical metila (-CH3) em sitios especificos do DNA. 1- A metilase DAM transfere um grupo metil da S-adenosilmetionina para o N6 do residuo de adenina das sequencias GATC. Enzimas inibidas: BclI (T/GATCA), ClaI (GAT/CGAT), MboI (/GATC), XbaI (T/CGATC), TaqI (GAT/CGA). Enzimas no inibidas: BamHI (G/GATCC), BglII (A/GATCT), Sau3A (/GATC). 2- A metilase DCM metila a citosina interna nas sequencias 5>3 CCAGG e CCTGG. Enzimas inibidas: ApaI (GGGCC/CAGG), AvaII (G/GACCAGG), etc. Enzimas no inibidas: BglI, KpnI, etc.

UNIDADE 1 unidade de enzima de restricao corta completamente 1ug de DNA de fago Lambda em uma hora em um volume de reacao de 50ul na temperatura ideal da enzima e no tampao apropriado. TAMPES DE ENZIMAS DE RESTRIO (em geral adquirido junto com a enzima) a) 10mM Bis-Tris-Propano-HCl, pH 7.0; 10mM MgCl2; 1mM DTT AluI, EaeI, HgaI, HpaI, KpnI, SpeI, XmaI b) 10mM Tris-HCl pH7.9; 50mM NaCl; 10mM MgCl2; 1mM DTT BsmI, EcoRV, HindIII, HinfI, MboII, MseI, MspI, PstI, PvuII, SstI, StuI, XhoI, XorII c) 50mM Tris-HCl pH7.9; 100mM NaCl; 10mM MgCl2; 1mM DTT AseI, BclI, BglII, BspEI, BstEI, DraIII, MboI, MluI, PstI, PvuI. d) 20mM Tris-Acetato pH7.9; 50mM KOAc, 10mM Mg(OAc)2; 1mM DTT AatII, ApaI, AvaI, AvaII, BanI, BanII, ClaI, DraI, EcoRII, HaeIII, HpaI, SacII, SmaI.

FERRAMENTAS MOLECULARES
CORTE COM ENZIMAS DE RESTRICAO E MAPAS DE RESTRICAO

1.

CORTE COM ENZIMA DE RESTRICAO O corte deve ser realizado com a quantidade adequada de enzima. Quantidades exageradas podem levar a atividade star e concentracoes baixas podem resultar em corte parcial (as vezes desejado). 1 unidade por ug de DNA genomico 3 unidades por ug de DNA circular (plasmidial).

2.

PROTOCOLO TIPICO Tampo de enzima 1x (normalmente adquirido 10x) DNA - o seu volume no deve ser superior a 50% do volume total. Enzima - o seu volume no deve superar 10% do volume total. Agua - deve ser utilizada agua ultrapura esterilizada por calor.

BglII
6.2

BamHI PstI

BglII BglII BamHI PstI

BamHI PstI

QUE TIPO DE ALTERACOES PODEM SER RECONHECIDAS ATRAVES DE ANALISE DE FRAGMENTOS DE RESTRICAO?
1. Mutacoes de ponto no local de reconhecimento e corte por parte da enzima de restricao e c onsequentemente, a ausencia de sitio de corte. 2. Mutacao de ponto que cria um novo sitio de corte com enzima de restricao.

5.2 4.2 3.6 3.5 3.3 2.6 1.7 1.0 0.7 0.5 0.3 0.3 0.3 1.7 1.4 1.2 1.2 0.9 1.4 1.2 1.0

3. Delecao que elimina sitio de corte e ao mesmo tempo muda o comprimento dos fragmentos gerados por uma enzima ou outras enzimas. 4. Delecao que nao elimina sitio de corte mas altera o comprimento do fragmento gerado por enzimas que franqueiam o local. 5. Insercao que gera novo sitio de corte e ao mesmo tempo altera o comprimento dos fragmentos gerados por uma enzima ou outras enzimas. 6. Insercao que nao gera novo sitio mas aumenta o comprimento dos fragmentos gerados por enzima ou outras enzimas.
2.6 0.6 1 3.5 1.2 6.7 0.2 2.2

uma

BglII

BamHI

PstI

BglI

PstI
0.6 1 3.5 1.2 6.7 0.2

0.3

0.7

2.6

0.9

0.5

1.2
0.6 1 3.5 1.2 0.3 6.4 0.2 1.1

Desenhe o gel correspondente a estes fragmentos de seis organismos.

VETORES DE CLONAGEM

Caracteristicas de um vetor de clonagem: -Autoreplicativo -Com sitios unicos de corte com enzimas de restricao. -Com marcada de selecao.

PLASMIDIOS TIPO DE VETORES -PLASMIDIOS Moleculas circulares de DNA extracromossomico autoreplicativas; limite para clonagem 100 a 10.000pb. -FAGOS Derivados de bacteriofago Lmbda; molecula de DNA linear com regioes que podem ser substituidas por DNA externo sem quebrar o ciclo; limite para clonagem de 8 a 20.000pb. -COSMIDIOS DNA extracromossomico circular que combina caracteristicas plasmidiais e fagicas; limite para clonagem 35.000 a 50.000pb. -BAC (CROMOSSOMO BACTERIANO ARTIFICIAL) Baseado em plasmidios mini-F; limite para clonagem 75.000 a 300.000pb. -YAC (CROMOSSOMO ARTIFICIAL DE LEVEDURA) Cromossomo artificial contendo centromero, telomeros, origem de replicacao e marcadores de selecao; limite para clonagem 100.000 a 2.000.000pb.

POLILINKER SEQUENCIA DE DNA COM DIVERSOS SITIOS DE RESTRICAO.

VETORES BINARIOS PARA LEVEDURAS: VETORES DE EXPRESSAO: - Os vetores de expressao devem conter promotor e terminador proximos a sitios de corte com enzimas de restricao visando a expressao de genes clonados sob o controle de tal sistema. -Os vetores binarios incluem origens de replicacao eficientes em mais de um organismo e sistema de selecao nos organismos para os quais foram desenhados. -YEP352- apresenta origem de replicacao de 2um -YADE4- apresenta origem de replicacao ARS1

VETOR BINARIO PARA TRANSFORMACAO DE PLANTAS COM MONITORAMENTO DE EXPRESSAO.

METODO DE LISE ALCALINA PARA EXTRACAO DE PLASMIDIOS (Miniprep).

Eco Hind Hind pC194 TcR Corte com Hind III Corte com HindIII Eco Hind Hind Hind CmR CmR

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

ApR

pBR322

ApR

TcR Eco ApR Hind CmR Ligacao com T4 ligase

Crescer 5ml de cultura bacteriana em meio LB contendo o antibiotico seletivo a 37C com agitacao por 6h a 18h. Centrifugar 5000 a 10000 rpm por 5 min. e descartar sobrenadante. Adicionar 100ul de 50mM glicose, 25mM TrisHCl pH8.0, 10mM EDTA, 2mg/ml lisozima. Ressuspender e manter em banho de gelo por 10 min. Adicionar 200ul de 0.2N NaOH, 1% SDS. Misturar lentamente por inversao. Incubar em banho de gelo por 10 min. Adicionar 150ul de acetato de sodio 3M pH4.8. Misturar lentamente por inversao. Incubar por 10 min. no freezer. Centrifugar por 15 min. 15000rpm a 4C. Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar 2 a 2.5 volumes de etanol (-20C). Incubar em banho de gelo por 10 min. Centrifugar por 1-5min a 10000rpm. Lavar com etanol 70% (-20C) Secar a vacuo ou ambiente, e ressuspender em 50ul de TE. Tratar por 90 min. com RNAse.

TcR Hind

+
Eco ApR

OBS: pretratamento com cloranfenicol aumenta o numero de plasmidios por celula e o rendimento da extracao.
Hind

Construcao do plasmidio binario pHV14 e pHV15 funcionais em E. coli e B. subtilis, pela ligacao de pBR322 e pC194.

TcR

CmR Hind

VETORES VIRAIS -Os vetores virais aproveitam a grande capacidade de transfeccao dos fagos (1000 vezes maior que um plasmidio) e a possibilidade de transferencia de fragmentos de DNA de alto peso molecular.

MAPA FISICO DO FAGO LAMBDA Regiao nao essencial Cabeca AWB 0 Terminacao coesiva esquerda DEFZ 10 20 30 Cauda J 40 att 50 int xis 60 Integracao e recombinacao red 70 N cI cro 80

Regulacao final OP Q 90

Lise S R 100 Terminacao coesiva direita

Regulacao e Sintese de imunidade DNA

Capsdio (cabea)

Pescoo

Fibras da cauda Placa basal

As terminacoes do DNA Lambda sao conhecidas como sitios COS, cada uma corresponde a uma sequencia fita simples de 12 nucleotidios. Como suas sequencias sao complementares, uma terminacao liga-se a outra formando CONCATOMEROS. As duas terminacoes de um fago Lambda podem tambem se ligar entre si formando uma molecula circular. Na celula bacteriana formam-se fagos circulares pois a DNA ligase sela a uniao entre as extremidades COS. No processo de EMPACOTAMENTO do virion Lambda, duas proteinas Nu1 e A podem reconhecer os sitios COS, direcionando a insercao do virion para uma cabeca vazia. A cabeca e entrao acoplada a uma cauda formando a particula viral completa. Este ;processo ocorre normalmente na celula hospedeira, entretanto, para processos de clonagem um complexo de empacotamento e utilizado. Proteinas Nu1 e A sao codificadas por genes presentes no fago. Se os dois genes encontram-se mutados nao ocorre empacotamento. Como o empacotamento ocorre em cabecas e caudas preformadas, a celula hospedeira deve acumular estas estruturas vazias, as quais podem ser extraidas. Quando os DNA recombinantes de Lambda sao misturados com cabecas vazias, caudas, proteinas Nu1 e proteinas A, o empacotamento ocorre.

LAMBDA GT11

COSMIDIOS Os cosmidios sao uma combinacao de plasmidios e sitios COS que permitem que o DNA cosmidial seja inserido em cabecas de fagos. Os cosmidios apresentam as seguintes vantagens: -Alta eficiencia de transferencia -Permite carregar aproximadamente 45kb, enquanto que plasmidios e fagos carregam no maximo 25kb.

YAC
Os cromossomos artificiais de leveduras (YAC) sao capazes de carregar fragmentos de mais de 2Mb, mas a sua taxa de transferencia e baixa. Componentes essenciais de vetor YAC -Centromero (CEN), telomeros (TEL) e sequencia de replicacao autonoma (ARS). -Gene AMP para amplificacao seletiva e marcadores como TRP1 e URA3 para selecao em leveduras. -Sitio de reconhecimento por enzimas de restricao.

Processo 1.O DNA alvo e parcialmente digerido com EcoRI e o YAC completamente digerido com EcoRI e BamHI.. 2.Ligacao do vetor clivado com o DNA digerido formando cromossomos artificiais. 3.Transformacao de leveduras.

FERRAMENTAS MOLECULARES
LINHAGENS MICROBIANAS E MODELOS BIOLOGICOS

ALGUNAS LINHAGENS DE LEVEDURAS UTILIZADAS EM BIOLOGIA MOLECULAR A maior parte das linhagens sao derivadas da linhagem isogenica S288C. AH22 a leu2-3 leu2-112 his4 canr

ALGUNAS LINHAGENS DE Escherichia coli UTILIZADAS EM BIOLOGIA MOLECULAR HB101- F- mcrB mar- hsdS20 (rb- ma-) recA13 leuB6 ara14 proAZ lacY1 galK2 xyl5 mtl1 rpsL20 (smr) supE44 LambdaDH5 F- 80d lac ZM15 (lacZYA-argF) U129 endA1 recA1 hsdR17 (rk-mk+) deoR thi1 supE44 Lambda- gyrA96 relA1 MC1061 F- araD139 (ara-leu) 7679 galU galK (lac) X74 rpsL (strr) hsdR2 (rk-mk+) mcrB1 GM2163 F- dam dcm supE44 rpsL (strr) Lambda- mcrB1 GENES IMPORTANTES EM LINHAGENS PARA BIOLOGIA MOLECULAR mcr- sistema de restricao metilcitosina especifico. mar- sistema de restricao metiladenina especifico. hsd- sistema de restricao de K12 reconhece AmeACNNNNNNGTGC rec- sistema de recombinacao dam- adenina metilase dcm- citosina metilase

GRF18 leu2-3 leu2-112 his4 canr

leu2-3 e lau2-112- mutacoes de ponto no gene leu2 his3-200 delecao in vitro trp1-901 delecao in vitro ura3-52 insercao de Ty1

Caenorhabditis elegans

Dictyostelium discoideum (ameba colonial)

Danio rerio (Zebra fish)

Drosophila melanogaster

Arabidopsis thaliana

Xenopus Mus musculus

FERRAMENTAS MOLECULARES
TRANSFORMACAO
TRANSFORMACAO EM E. COLI METODO 1 -Crescer a linhagem bacteriana em LB a 37C por 18h. -Inocular 1/40 em 250ml de LB e incubar a 37C com agitacao ate uma absorbancia de 0.4-0.5 a 550nm. -Esfriar em banho de gelo, centrifugar a 6000 rpm a 4C por 10 min. -Decantar o sobrenadante e colocar o pellet em gelo. -Ressuspender em 125ml de 100mM CaCl2 gelado, e incubar em banho de gelo por 30 min. com agitacao ocasional. -Centrifugar a 6000 rpm por 10 min a 4C. -Ressuspender em 10 ml de 100mM CaCl2 e 15% glicerol. -Separar em aliquotas e 0.2ml, e incubar em gelo por 12 a 24h. (nesta etapa podem ser congelados em N2-liquido e mantidos a 80C por varios meses). -Adicionar o DNA (1 a 10ug de plasmidio para 0.2ml de celulas competentes). Incubar em banho de gelo por 30 min. -Realizar choque termico a 42C por 2 a 5 min. -Adicionar 0.4ml de LB e incubar 1h a 37C. -Plaquear no meio seletivo apropriado.

TRANSFORMACAO EM S. cerevisiae ACETATO DE LITIO -Crescer a levedura em YEPD ate a metade da fase logaritmica (~2 x 107 cels/ml) 10 ml. - Centrifugar a 5000 rpm por 2 min. - Ressuspender as celulas em 5ml de 0.1M Acetato de Litio em TE. - Incubar 30 C por 1 h sob agitacao. - Centrifugar e ressuspender em densidade de 2 x 109 cels/ml. - Colocar as celulas em aliquotas de 100ul e acrescentar 1ug de DNA plasmidial. Adicionar 50ug de DNA de esperma de salmao ou timo de boi em TE (previamente passar a solucao de DNA carregador varias vezes por seringa). - Incubar 30 min a 30C. - Adicionar 0.7ml de 40% PEG4000, 0.1M acetado de litio em TE (pH7.5). - Incubar 1 h. a 30C. - Colocar em banho a 42C por 5 min. - Centrifugar, lavar em agua esterilizada e ressuspender em 0.2 a 0.4ml de agua. - Plaquear em meio seletivo. TRANSFORMACAO DE BACTERIAS - ELETROPORACAO -Utilizar uma colonia de E. coli para inocular 50ml de meio SOB (sem Mg), e crescer com agitacao a 37C por 18h. -Diluir 0.5ml ca cultura em 500ml de meio SOB (sem Mg) e crescer por 2 a 3h a 37C ate D.O.550= 0.8 -Centrifugar e ressuspender em 500ml de WB (10% glicerol, 90% agua) gelado. Centrifugar novamente e repetir. -Ressuspender em 2ml de WB gelado e aliquotar em fracoes de 200ul. Conservar a 70C. -Juntar 20ul de suspensao de celulas com 1ul de DNA e colocar na celula do eletroporador. -Aplicar um pulso de 2400V, 4000 ohms. Protocolos semelhantes sao utilizados para outros microrganismos.