CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PRODUTOS E PROCESSOS

Diversidade de Lactococcus lactis revelada pelo sequenciamento de Amplicon

direcionado do gene purR , comparações metabólicas e propriedades antimicrobianas
em uma cultura inicial mista indefinida usada para fabricação de queijo macio
Sabrina Saltaji , Olivier Rué, Valérie Sopena, Sophie Sablé, Fatoumata Tambadou, Sandrine Didelot, Romain Chevrot

DOCENTE: FERNANDA BADOTTI

D I S C E N T E : B R E N D A PA L H A R E S D O S R E I S V I E I R A

BELO HORIZONTE

2022
Sumário
• Artigo
• Introdução
• Objetivo
• Metodologia
• Resultados e discussão
• Conclusão
• Referências bibliográficas
Artigo

Fator de
impacto: 4,350
Introdução
Produção de queijos de pasta mole
Introdução
Bactérias de ácido láctico
As BAL que compõe o leite cru são:
• Lactococcus lactis,
• Leuconostoc mesenteroides,
• Streptococcus spp. e
• Lactobacillus spp.

As subespécies L. lactis subsp. lactis e L. lactis

subsp. cremoris.
Introdução
Tecnologias de sequenciamento
Introdução
Bactérias patógenas e deteriorantes
• Placa de ágar EMB semeada com Escherichia coli.
•Meio ágar Hektoen em sua coloração original (placa da esquerda); HE
semeado com cepa de Salmonella (placa ao centro). Note a presença de
pigmento negro. HE semeado com cepa de coliforme fecal (placa à
direita).
 Objetivos
• Conhecer a diversidade microbiana CIMI;
• Criar um acervo a partir da CIMI;
• Realizar as associações genótipo-fenótipo;
• Determinar o perfil do metabolismo de carboidratos;
•Avaliar a atividades antimicrobiana.
Materiais e métodos
Coleta de Amostras
• Adicionado durante a adição do coalho,
algumas horas após o enriquecimento
do leite com fermentos acidificantes.
Extração de DNA
• O DNA foi extraído com o DNeasy
PowerFood Microbial Kit,
• O DNA purificado foi armazenado a -
80°C
 Sequenciamento de genes da microbiota CIMI
Sequenciamento de genes e análise de dados de 16S rRNA

• Ampliação por PCR

• Sequenciamento pela plataforma Eurofins Genomics usando uma tecnologia Illumina ® MiSeq.
• O pipeline FROGS foi usado para recuperar as unidades taxonômicas operacionais (UTOs)
• As sequências de referência de cada UTO foram lançadas contra o banco de dados SILVA

Sequenciamento de Genes PurR e Análise de Dados

• Ampliação por PCR
• Sequenciamento pela plataforma Eurofins Genomics usando uma tecnologia Illumina ® MiSeq.
• O pipeline DADA2 foi usado para recuperar as sequências biológicas de leituras (erros).
• Comparada no banco de dados NCBI usando o programa BLAST.
 Isolamento de bactérias lácticas (BAL) e não-BAL
Atmosfera aeróbica Atmosfera microaerofílica Atmosfera aeróbica

• Temp.: 28°C • Temp.:28°C • Temp.:22°C

• Ágar BHI
• Ágar BHI • Ágar BHI
• Ágar MRS
• Ágar MRS • Temp.:37°C
• Ágar M17

• Ágar MRS + 2% NaCl • Ágar M17 • Ágar MRS

• Ágar MRS + 4% NaCl • Temp.:44°C
• Ágar MRS + 6,5% NaCl
• Ágar MRS
• Ágar BHI + 6,5% NaCl
 Identificação de Perfis Fenotípicos e Isolados de LAB
Perfil do Metabolismo de Carboidratos Bacterianos

• 2 bactérias isoladas aleatórias.

• 49 testes bioquímicos com meio API 50 CHL.

MALDI-TOF MS Identificação Bacteriana

• Pela Eurofins Microbiologie Ouest.

Extração de DNA, Procedimento de PCR de Rotina e Sequenciamento de Gene de

rRNA 16S de Comprimento Completo
• Pela Eurofins Microbiologie Ouest.
• Comparada no banco de dados NCBI usando o programa BLAST.
 Sequenciamento do Genoma e Análise de Dados
Extração de DNA de cultura pura
• 6 BAL isolados de L. lactis para associações genótipo-fenótipo.
• Extração: kit de sangue e tecido DNeasy
• Quantificação: NanoDrop ND-1000

Sequenciamento de genoma completo e anotação de genes

• Tecnologia de sequenciamento PacBio ® RS II e Illumina ® iSeq .
• As informações das vias relacionadas ao metabolismo de carboidratos foram identificadas a
partir daquelas descritas na Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto.
• Produção de peptídeos antimicrobianos foi realizada usando BAGEL4.
Atividade antimicrobiana
Cepas bacterianas e
Número(s) de
condições de
Adesão
crescimento
• Os dados do amplicon 16S e purR foram
depositados em DDBJ/ENA/GenBank sob • Cultivado duas vezes.
o número BioProject PRJNA615620. • Condições de crescimento específicas para
• O projeto de genoma completo foi cada cepa.
depositado no DDBJ/ENA/GenBank sob o
número BioProject PRJNA615395.
 Atividade antimicrobiana
•Bacillus cereus
•Bacillus subtilis
•Brochothrix thermosphacta
•Carnobacterium maltaromaticum
•Cronobacter sakazakii
•Escherichia coli
•Enterococcus faecalis
•Leuconostoc mesenteroides
•Listeria innocua
•Listeria ivanovii
•Listeria monocytogenes
•Listeria monocytogenes
•Mucor circinelloides
•Mucor racemosus
•Penicillium solitum
•Pseudomonas aeruginosa
•Pseudomonas fluorescens
•Staphylococcus aureus
•Staphylococcus aureus
•Salmonela ser. Enteritidis
•Salmonela ser. Typhimurium
•Yarrowia lipolytica
•Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
Determinação das Propriedades Inibitórias de Isolados de LAB
contra Bactérias Patogênicas Transmitidas por Alimentos e
Bactérias de Deterioração
Preparações de Sobrenadante Livre de
Teste de mancha de ágar Células (CFS) e CFS Neutralizado
(NCFS)
• 5 microlitros de uma cultura de BAL • Os CFSs foram obtidos por
em placas de ágar BHI, deixa secar por centrifugação.
20 min; • Os NCFS :pH do CFS ajustado para 7,0
• Cobre com 10 mL de ágar mole com para excluir o efeito antimicrobiano
10 6 UFC/mL da cepa indicadora; dos ácidos orgânicos.
• Incubação à noite; • Aquecimento a 100°C por 10 min para
• Verificar os halos de inibição. inibir a atividade da enzima.
• Controle positivo: Lactobacillus sakei
Determinação das Propriedades Inibitórias de Isolados de LAB
contra Bactérias Patogênicas Transmitidas por Alimentos e
Bactérias de Deterioração
Ensaio de Difusão em Poços de Agar.
• O ágar BHI foi semeado com 10 6 UFC/mL de cepas indicadoras e vertido em
placas de Petri.
• Alíquotas de CFS ou NCFS não diluídas preenchem os poços de vidros nas placas
• Incubação a noite.
• Registro: Halos de inibição.
Efeito inibitório durante o co-cultivo
• Lote 1: co-inoculação de S. aureus + BAL isolado selecionado;
• Lote 2: co-inoculação de S. ser. Typhimurium + BAL isolado selecionado.
• As atividades antimicrobianas: ensaio de difusão em poço de ágar.
 Resultados e discussão
Análise da diversidade microbiana das CIMI

Análise de sequências Análise de

Análise de sequências
de fragmentos de genes sequenciamento de
de genes purR
de rRNA 16S genoma completo

Um gênero dominante, Lactococcus sp.,

abrangendo 99,9% de abundância relativa,
foi identificado para cada região do gene 16S
rRNA
PurR Análise de Sequência de Genes
Contagem de matriz de variantes de sequência de amplicon (ASVs) (%)
determinada com análise do gene purR .

Abundância (%)
ASV_1 99,86
ASV_2 0,13
ASV_3 0,005
ASV_4 0,005
ASV_5 0,002
 A

PurR Análise de
Sequência de
Genes
Dendrogramas mostrando
semelhanças de sequência de
cepas de L. lactis com base B
em uma análise de
agrupamento das variantes de
nucleotídeos de amplicon
purR (A) ou variantes de
aminoácidos (B).
Análise de sequenciamento de genoma completo
.
O valor ANI é usado para estimar a distância genética entre isolados..

A subespécie cremoris possui um valor de ANI abaixo de 95%.

A identidade ANI foi >99,8% para todos os genomas de L. lactis,

Sugerindo que todos pertencem ao grupo de subespécies de lactis .

MALDI-TOF MS e Análise de Sequenciamento Genético
de rRNA 16S de Comprimento Completo
• Foram 4 identificações de espécies:
• Lactococcus lactis (L) ( n = 18/26),
• Lactococcus raffinolactis (R) ( n = 1/26),
• Enterococcus faecalis (E) ( n = 5/26) e
• Staphylococcus warneri (S) ( n= 2/26).
• A análise dependente de cultura mostrou semelhanças na diversidade da CIMMI e
concordou com estudos independentes de cultura para a identificação de L. lactis
• As diferenças observadas entre o método analítico de 16S rRNA foram provavelmente
resultado de leituras não classificadas no pipeline de bioinformática.
 Características Metabólicas e Funcionais
das Cepas CIMI
Grupos fenotípicos de L.

(A) para os isolados L1 a L6,

Três isolados faziam parte do
L10 a L13 e L15 a L17 ( n = Consumo da D-xilose
grupo A (L1, L2, L3),
13)

Degradação da D-sorbitol* e
(B) para os isolados L7 e L8 Um isolado fazia parte do
Conumo da D-tagatose e D-
(n = 2) grupo B (L8),
sacarose*
lactis

(C) para os isolados L14 e Um isolado fazia parte do Consumo da D-xilose e D-

L18 ( n = 2) grupo C grupo (L14) e sacarose*

Consumo da D-xilose e D-
(D) para o isolado L9 ( n = 1) Um isolado fez parte do sacarose*
grupo D (L9)
Resultados e discussão
• A porcentagem de carboidratos utilizada pelas bactérias isoladas foi ligeiramente
maior (33% a 45%) em comparação com cepas do tipo L. lactis (29%).
• O processo de pseudogenização progressiva (inativação de genes) ligado à sua
especificação de nicho atual.
• A L. lactis isolados vieram de um ambiente de fazenda antes de serem
introduzidos no leite cru e depois no UMSC
• As bactérias isoladas da CIMI foram progressivamente domesticadas, uma vez
que não podiam mais crescer em uma variedade de carboidratos derivados de
plantas devido à pseudogenização ou inserções de transposons em genes.
Atividades antimicrobianas

Os isolados 14 e 15 mostraram o
N= 34 bactérias maior espectro antimicrobiano
A atividade antimicrobiana do isolado 14
isoladas apresentou inibindo o crescimento das cinco
de L. lactis foi estudada em ensaios de
Ensaios atividade cepas indicadoras ( S. ser.
co-cultivo contra as duas cepas
(n = 1616) antimicrobiana Typhimurium CIP 104115, S.
indicadoras: S. aureus DSMZ 13.661
contra até 5 cepas aureus DSMZ 13661, S. aureus CIP
ou S. ser. Typhimurium CIP 104115
indicadoras 76.25, E. faecalis CIP 103.015 e L.
innocua CIP 80.11)
Atividades antimicrobianas
S. ser. Typhimuri Lactobacillus S. aureus DSMZ L. inócua
CFS testado L. lactis IL1403 d
um CIP 104115 Sakei CIP 104494 13661 CIP 80.11
L. lactis isolado
8,0 ± 0,7 a 12,0 ± 0,7 8,0 ± 0,0 24,0 ± 0,7 13,0 ± 1,4
14
S. ser. Typhimuri
um /b / / / /
CIP 104115
Isolado 14
+ S. ser. Typhimur 11,0 ± 0,0 14,0 ± 1,4 ND c 22,0 ± 1,4 15,0 ± 2,12
ium CIP 104115
S. aureus DSMZ
/ 10,0 ± 2,12 / / /
13661
Isolado 14 + S.
aureus DSMZ ND 11,0 ± 1,4 14,0 ± 0,0 18,0 ± 0,7 17,0 ± 0,7
13661
Atividades antimicrobianas
A ferramenta baseada na web BAGEL4 foi usada para minerar agrupamentos de genes de
metabólitos secundários dentro de todo o genoma L. lactis L3 (isolado 14).
O gene é conhecido por estar envolvido na produção da bacteriocina lactococina B (LcnB).

O LcnB afeta a permeabilidade da membrana, dissipando seu potencial e seu gradiente de pH

causado pelo vazamento de íons. Em cepas de L. lactis que carregam a proteína de imunidade, o
LcnB é inativo

O isolado 14 inibiu o crescimento de L. lactis IL1403, uma cepa livre de plasmídeo sensível à
bacteriocina. Esses resultados sugeriram que o isolado 14 poderia produzir um peptídeo
antimicrobiano próximo ao LcnB.
Conclusão
•Cinco variantes de L. lactis foram identificadas e cinco perfis de metabolismo de carboidratos foram
destacados no gênero Lactococcus.
• Essas cepas de Lactococcus diferem em suas propriedades fenotípicas das cepas comumente usadas
como iniciadores industriais.
• Além disso, algumas L. lactis isolados apresentaram atividade antimicrobiana detectada por métodos
culturais.
•Essas bactérias poderiam atuar como agente de biocontrole quando combinadas com outros
procedimentos da chamada tecnologia de barreiras.
•Além disso, considerando as características da cultura e sua relação com a qualidade do produto,
estudos adicionais podem ser úteis para determinar seus efeitos na aptidão tecnológica e nas
propriedades sensoriais do queijo.
Referências bibliográficas
https://omelhordeparis.com.br/confira-5-queijos-tipicamente-franceses/
https://pt.dreamstime.com/desenhos-animados-infographics-da-produ%C3%A7%C3%A3o-de-
queijo-image101748586
https://www.google.com/imgres?imgurl=https%3A%2F%2Fwww.milkpoint.com.br%2Fimg%2F
artigo%2F73129%2F%3Fw%3D1200%26vs%3D20112019092814&imgrefurl=https%3A%2F%
2Fwww.milkpoint.com.br%2Fcolunas%2Fclaucia-fernanda-souza%2Fbacterias-acidolacticas-e-
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AegUIARC5AQ..i&docid=hrpFLaxKJtFIDM&w=1200&h=900&q=bacterias%20lacticas&ved=
2ahUKEwiex83X1Jr4AhWsDrkGHSyFDIsQMygAegUIARC5AQ
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/748514/1/Doc124.pdf
https://neobio.com.br/blog/o-sequenciamento-de-dna-a-revolucao
Referências bibliográficas
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/10/reacao-em-cadeia-da-polimerase-pcr.html
https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/24343/5/Manual%20de%20bacteriologia%20e%2
0de%20enteroparasitos.pdf
https://pt.dreamstime.com/imagens-de-stock-ilustra%C3%A7%C3%A3o-da-f%C3%A1brica-de-
queijo-image28552374
SALTAJI, S. et al. Lactococcus lactis Diversity Revealed by Targeted Amplicon Sequencing of purR Gene,
Metabolic Comparisons and Antimicrobial Properties in an Undefined Mixed Starter Culture Used for Soft-
Cheese Manufacture. Foods, v. 9, n. 5, 1 maio 2020.