Alimentos

Geneticamente
Modificados
Prof. Humberto M. F. Madeira
 O QUE SÃO?

ORGANISMO TRANSGÊNICO
Organismo cujo genoma foi
modificado pela aplicação de DNA
de outro organismo
= ORGANISMO GENETICAMENTE
MODIFICADO
 O QUE SÃO?

TRANS: para além de

GENE: A unidade fundamental, física
e funcional, da hereditariedade, que
carrega informação de uma geração
para outra; um segmento de DNA,
composto de uma região transcrita e
uma seqüência reguladora que torna
possível a transcrição.
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO
Agrobacterium
Sementes
comerciais de
tomate. Estas são
limpas e prontas
para
transformação.
Sementes são
tratadas com 50%
hipoclorito de
sódio, 0,1%
Tween para
impedir
crescimento de
micorganismos.
As sementes
esterilizadas são
colocadas em
placas de Petri
com meio
nutriente para
germinação.
(Murashige &
Skoogs – MS)
Após 07 dias as
plântulas estão no
estágio em que os
cotilédones
podem ser
cortados para
transformação
(explantes).
Os explantes de
cotilédones
podem são pré-
condicionados
para
transformação em
placas
alimentadoras. A
placa
alimentadora é
composta de MS-
ágar e suspensão
de calo de fumo.
Um papel de filtro
é colocado para
separar os
explantes da
suspensãod e
células de fumo.
TIPOS DE OGM’S
Produção de Transgênicos por País (2000)

País Área plantada Culturas

(milhões de acres)

USA 74.8 soja, milho, algodão, canola

Argentina 24.7 soja, milho, algodão

Canadá 7.4 soja, milho, canola

China 1.2 algodão

África do Sul 0.5 milho, algodão

O CASO DA SOJA RR
 O CASO DA SOJA RR

• Soja: flor pequena (0,5 cm), perfeita, pólen

cai sobre órgão feminino com flor fechada
• Menos de 0,5% de fertilização cruzada
• Pólen muito pesado para ser carreado pelo
vento
• Pode ser transportado por insetos
 MELHORAMENTO
CONVENCIONAL

• Polinização artificial
• Cruzamento entre dois ancestrais, gerando
híbrido
• Ancestral recorrente (a ser melhorado)
• Ancestral doador (gene de interesse)
• Retrocruzamentos
• Seleção
• Linhagens elite, limitando diversidade
ENGENHARIA GENÉTICA
STS – (mutagênese EMS- etil
metanosulfato)
Tolerância à sulfoniluréia
DuPont
Synchrony STS: chlorimuron e
thifensulfuron
• Glifosato: inibe enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-
fosfato-sintase – presente em bactérias,
fungos e plantas, mas não em animais,
• Síntese de aminoácidos aromáticos (vitaminas,
fitohormônios, ligninas)
• Agrobacterium tumefasciens CP4
• um gene dominante
• 150 companhias – mais de 1000 variedades
• Primeiras 4-6 semanas sem daninhas
• ou somente as primeiras 4-6 semanas de competição
• Aplicação de glifosato: 10-28 dias, daninhas <30 cm
• Regiões mais frias: 1 aplicação; mais quentes, 2.
• Arkansas: 1a. Aplicação: 10-14 dias após plantio
2a. Aplicação: 7-10 dias depois da 1a.
aplicação
• Partículas de ouro (1,3 a 3,0 µm) – 1500 km/h
• Agrobacterium tumefasciens CP4
• Embriões imaturos
• 5-7 camadas de células
• Plasmolizados, protoplastos
• Controle de daninhas simplificado
• Controle de mais amplo espectro
• Menos danos à soja
• Mais flexibilidade na hora da aplicação
• Menos preocupação com efeito residual
• Preço competitivo
• Redução na quantidade total de herbicida
(20%)
O CASO DO MILHO BT
 O CASO DO MILHO BT
• Bt – Bacillus thuringiensis
• ocorrência natural em solos
• produz proteínas em forma de cristal que
seletivamente mata certos grupos de insetos
 As proteínas “Cry” são toxinas no trato
digestivo dos insetos
 As enzimas digestivas convertem a pré-
toxina para sua forma tóxica
 A toxina se liga a receptores no tecido
epitelial causando rompimento das células
 O inseto perde a capacidade de digestão
 O CASO DO MILHO BT

• Insetos param de se alimentar 2 h após

primeira mordida

• Se toxinas em quantidade suficiente

forem ingeridas, morte em 2-3 dias
• Aventis StarLink

• Se toxinas em quantidade suficiente

forem ingeridas, morte em 2-3 dias
NOVAS GERAÇÕES

• Papaya resistente ao vírus da mancha

anelar do mamão, cultivado no
Havaí

• EMBRAPA
 NOVAS GERAÇÕES

• Tomate com mais licopeno

• Milho com beta-caroteno
• Canola com vitamina A
• grama: roundup-ready, menor crescimento,
maior resistência à seca
• Bananas com virus inativados de cólera,
hepatite B, diarréia = vacinas naturais
TERCEIRA GERAÇÃO
MÉTODOS DE DETECÇÃO
Joint Workshop on Method Development in
Relation to Regulatory Requirements for
the Detection of GMOs in the Food Chain

Internacional Life Sciences Institute (ILSI)

The European Commission`s Joint Research Centre (JRC)
Bruxelas, 11-13 de dezembro de 2000
União Européia
Reconhece que não se pode excluir a possibilidade de
presença acidental de OGM, ocorrida durante cultivo,
colheita, armazenamento e transporte. Estabelece o
limite máximo de 1% para presença acidental de DNA
e/ou proteína resultante de modificação genética.

Objetivos: Baixa tolerância com contaminação involuntária

Tolerância zero com produtos não-autorizados
Preservação de identidade
Possibilidade de escolha dos consumidores

Necessidade de métodos de detecção

Fundamentos da análise de OGMs
- Presença de nova seqüência de DNA - (PCR)
- Presença de nova proteína - (ELISA)

Célula transgênica Célula normal

Detecção de DNA recombinante

Material genético (DNA) presente em pequena quantidade

DNA introduzido corresponde a uma parcela ínfima do total.

Necessidade de um método sensível e poderoso

Uso de PCR (Polimerase Chain Reaction) na

amplificação de sequências de DNA introduzidas por
engenharia genética.
 Etapas da PCR
PCR

normal DNA

Eletroforese
_

transgênica DNA

P T N
+
Pontos críticos para aplicação da PCR

• Extração do DNA da amostra

• Presença de inibidores da polimerase
• Condições específicas para cada reação

Limitações da PCR

• Falsos resultados positivos devido a contaminação.

• Falsos resultados negativos.
• Análises conduzidas em laboratórios especializados.
Detecção de novas proteínas

• Baseada no uso de anticorpos.

• Alta especificidade e afinidade pela proteína-alvo.

O que são os anticorpos?

Anticorpos são proteínas produzidas com a função de defesa

contra organismos invasores e toxinas.
Domínios
variávies

Cadeias leves

Cadeias pesadas Região Fc

 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Incubação Lavagem Desenvolvimento de cor

amostra
+

amostra
-
Atrativos dos métodos imunológicos

• Usados em análises clínicas há anos

• Robustos e formatos aplicáveis em condições de campo
• Custo por análise relativamente baixo
• Relativamente sensíveis (0,5-1%)

Desvantagens dos métodos imunológicos

• Necessidade de proteína pura para produção de anticorpos
• Produção de anticorpos pode ser cara
• Isolamento do anticorpo específico pode ser difícil
• Conformação da proteína pode afetar a reação
A PCR e ELISA são utilizados em pesquisa e análises
clínicas. Porém, a análise de um alimento traz limitações
adicionais.
Métodos de detecção de DNA e proteína foram
originalmente utilizados para distinguir entre os
organismos transformados e os não-transformados,
não para avaliar produtos, nem serem aplicados em
outras matrizes, por exemplo, produtos alimentícios.

Alguns desafios impostos aos métodos de análise:

• diferentes matrizes alimentares

• materiais de referência positivos e negativos apropriados
• como expressar e interpretar os resultados
Como expressar e interpretar os resultados ?

A estimativa da quantidade de material geneticamente

modificado é uma medida indireta

O percentual é calculado a partir da relação entre

amplificação do DNA alvo e de um DNA controle
externo ou de gene de referência (naturalmente
presente)

Etapas: 1. Calibração
2. Quantificação
 1. Calibração
A partir de amostras com quantidades conhecidas de material
GM (DNA alvo) determinar a correspondência com quantidade
do DNA referência

%GM 0 0,1 0,2 0,5 1 2 5 10

DNA alvo

DNA referência

O ponto de equivalência permite relacionar intensidade da

banda do DNA de referência e percentual de OGM.
Quantidade X do DNA de referência equivale a um conteúdo de Y %
de material GM na amostra
 Quantificação de material geneticamente modificado
2. Quantificação
Amplificação simultânea de quantidades fixas de amostra com
diferentes quantidades de DNA referência, equivalendo a
diferentes porcentagens de material GM.
%OGM 0 1 2 5 10 20 50 100

DNA alvo
DNA referência

DNA alvo com a mesma intensidade do DNA referência quando

adicionado a uma concentração equivalente a 5 % de GM

Conteúdo GM = 5 %
Avaliação do uso de PCR na detecção de OGMs em
alimentos
• Mais sensíveis do que os métodos imunológicos.

• Capacidade de detectar DNA depende da integridade da

amostra extraída.
• Capacidade de detecção depende do conhecimento da seqüência
de DNA introduzida
• Supõe que o DNA -alvo e o gene de referência sejam degradados
igualmente.
• Análise é afetada pelo número de cópias do transgene e do gene
referência.
• Materiais de referência devem ser constituídos da mesma matriz
do material a ser testado.
Avaliação do uso de métodos imunológicos na detecção
de OGMs em alimentos

• Mais baratos e rápidos que DNA, mas menos sensíveis.

• Extremamente dependente da capacidade de extrair a proteína-alvo

• Afetados pela desnaturação e degradação da proteína.

• Potencial reatividade cruzada com outras proteínas.

• Variabilidade da expressão gênica.

Considerando as limitações dos métodos e também os
decorrentes da matriz alimentar, outros pontos devem ser
valorizados no processo de análise:

Amostragem
Amostragem

Preparoda
Preparo da Métodode
Método de Materiaisde
dereferência
referência
Materiais
amostra
amostra detecção
detecção

Avaliaçãodos
Avaliação dos
métodos
métodos
Amostragem

• Tamanho da amostra
• número de amostras testadas
Influencia na capacidade do ensaio resultar em
positivo ou negativo.

Amostragem parece ser a maior fonte de variabilidade

dos resultados.
Necessidade de harmonização internacional
Amostragem

EUA União Européia

Diretrizes para amostragem Diretrizes para

de grãos, semelhantes aos amostragem de grãos e
métodos para verificar derivados.
contaminação por fungos.
Amostragem intermitente. Amostragem contínua.

Apenas métodos Maior aplicação de

imunológicos são métodos baseados em
aplicáveis. PCR.
Preparo de amostras

Qualidade da extração sustenta a validade da análise

Quantidade, qualidade e integridade do material

extraído, seja proteína ou DNA
(Inibidores, matriz alimentar, armazenamento da
amostra, grau de processamento)
• Condições ótimas de extração devem ser determinadas
empiricamente
• Métodos de extração devem ser validados
Materiais de referência certificados (MRC)

Essenciais para avaliar a confiabilidade e reprodutibilidade

dos métodos e estabelecimento de curvas de calibração
para métodos quantitativos.

• Métodos de produção de MRC devem ser semelhantes

aos utilizados para a produção das amostras.
• Desenvolvimento de MRC com proteína-alvo ou DNA
degradados (simulação do processamento).
• Desenvolvimento de MRC para produtos não-autorizados na
Europa.
• Necessidade de desenvolvimento de materiais de referência
certificados de aceitação internacional.
Materiais de referência certificados (MRC)

Prioridades:

1. Desenvolvimento de MRC para análise de DNA

2. Desenvolvimento de MRC matriz-específicos

3. Desenvolvimento de MRC para análise de proteína

4. Estabelecimento de zero absoluto

5. Desenvolvimento de MRC de alimentos processados

Avaliação de desempenho dos métodos

Objetivos:

• Avaliar os diferentes métodos disponíveis.

• Comparar os resultados obtidos por diferentes métodos.

• Estabelecer critérios de aceitação/rejeição dos resultados.

• Estabelecimento de critérios de avaliação quanto a:

precisão, especificidade, sensibilidade, exatidão, aplicação,
mais do que prescrever um procedimento.
Avaliação de desempenho dos métodos

Resultados de estudos de validação inter-laboratoriais:

• Revelam boa reprodutibilidade entre os laboratórios.

• Bons resultados na detecção de teores próximos ou

superiores a 1%, contudo, variabilidade aumenta muito
abaixo desse valor.

• Reforçam a importância de materiais de referência

certificados.
Conclusões:
• Atualmente existe grande variedade de métodos de análise.

• Já existem métodos validados.

• Os métodos devem ser validados por testes envolvendo

pelo menos 12 laboratórios.
• Escolha dos métodos (DNA ou proteína) recai sobre aquele
que melhor atende às necessidades.
• Tolerância zero é impossível.

• Qualquer limite de tolerância constitui uma medida

arbitrária.
• Abandono de listas negativas
Perspectivas

• Com a introdução de mais de um gene e cruzamento entre

linhagens transgênicas, as incertezas associadas com os
métodos de DNA irão aumentar.

• Desenvolver competência na amostragem, análise e

quantificação de OGMs em ingredientes e produtos finais.

• Desenvolvimento de MRC é prioritário.