Sebenta de Introdução à Biotecnologia Vegetal

Produtos de origem vegetal e Biotecnologia

Normalmente quando falamos de biotecnologia, pensamos
sempre em grandes fermentadores para a indústria de
produção de produtos à base de levedura ou dos processos
fermentativos a estas inerentes (cervejaria, panificação, etc.).
Mas temos que ver que há outro tipo de produtos que nos são
essenciais e que também provém de uma indústria
biotecnológica. E esses produtos são os de origem vegetal.

Os produtos de origem vegetal são vários e têm diversas finalidades. Podem ser produtos com
destino alimentar (óleos alimentares, alimentos sólidos, bebidas, rações de animais) ou com
destinos técnicos (madeira, cortiça, papel e outras fibras, corantes, fragrâncias, agroquímicos ou
fármacos).

Biotecnologia Vegetal

A biotecnologia vegetal, debruça-se no uso de tecnologias para otimizar a obtenção de produtos

de origem vegetal. As plantas por serem organismos sésseis, evolutivamente tiveram que aumentar
largamente a diversidade de compostos que produzem, exatamente para lidar com as variações
do ambiente onde estão inseridas.

Na biotecnologia, queremos aproveitar esse potencial para nosso benefício. Por exemplo existem
espécies selvagens de plantas que produzem compostos ainda não conhecidos. E esses
compostos se forem estudados, podem trazer ao de cima propriedades anticancerígenas ou
outras propriedades de interesse ao homem. Queremos então aproveitar os recursos vegetais
recorrendo à tecnologia.

Que tipo de produtos e como?

Aumentar a quantidade de um genótipo de uma cultivar. Por exemplo

propagar clonalmente castas com relevância comercial de videiras (por cultura
in vitro) em condições assépticas.

Procurar árvores com fibras de melhor qualidade. Por exemplo, os

programas de melhoramento do eucalipto (recorrendo ao genoma e a
marcadores moleculares que marcam os genes que dão as fibras de melhor
qualidade, seguido de breeding). Poderia-se usar CRISPR mas política de
OGM…

Podemos querer melhorar a resistência abiótica ou biótica de uma

cultivar. Por exemplo, aumentar estes tratos em videiras (Vitis vinífera)
que são bastante suscetíveis e manter a qualidade do vinho no novo
contexto de alterações climáticas

Tornar um processo de produção de fármacos mais eficiente e barato. Por

exemplo, vários compostos anticancerígenos vegetais foram descobertos e
aumentados com uso de cultura in vitro ou cultura de células em suspensão.
Podemos querer uma proteína recombinante. Usando molecular farming (Usar
plantas para produzir anticorpos). Muitos dos anticorpos e fármacos usados na
medicina podem ser produzidos nas plantas (libertando o animal testing).

Ênfase: Produção primária

É importante estudar as plantas por serem a base da cadeia alimentar e pelo

seu enorme potencial e por darem sustento à maioria dos organismos
heterotróficos. Há uma relevância brutal me estudar seres autotróficos.

Como?

Para uma produção eficiente estamos dependentes das

características das plantas. Temos vários genótipos não são
todos eficientes na produção da mesma maneira.

Vamos depender das condições climáticas e também das

práticas agrícolas e silvícola. E com isto vamos aumentar a
produtividade das plantas, por meios de aumento da eficiência.

O foco da cadeira será falar na seleção de plantas, do breeding e da modificação de plantas.

Resumidamente, será isto o sumo da cadeira.

Genomas

A era dos genomas veio revolucionar a área da biotecnologia. Muitos organismos já foram
sequenciadas mas a maioria ainda não se sabe a função. Só nas angiospérmicas temos mais de
80 genomas sequenciados. No entanto, estes variam bastante no seu tamanho, e isto pela
identificação de elementos extra como transposões, duplicação génica etc.

O desafio é encontrar genes que determinam as características que permitem melhorar as culturas
 Caracterização funcional de genes

Com a sequenciação dos genomas aparecem outras tecnologias que vêm criar
info determinante para modelar vias regulatórias e assim surge a Biologia de
Sistemas.

Arranjámos uma função para as ómicas, a genómica (barato sequenciar

genomas e agora até já é pangenoma).

Temos a transcritómica, com sequencia de RNA para termos acesso aos transcritos do genoma.

Proteómica – uso de géis e técnicas como forma de identificar proteínas.

Metabolómica – Várias tecnologias como a GC-MS. Se tivermos

plantas em seca, fazendo análise podemos saber os genes, transcritos
e metabolitos que intervém no processo.

A bioinformática, pega na informação e dá pistas do que é relevante.

Ajudam na modelação ao nível do organismo para saber o processo
inteiro do mais simples ao mais complexo. Tendo isto podemos
descobrir os genes, caracterizá-los funcionalmente e seguir para
melhoramento vegetal

Em certos estudos, estas ómicas são usadas e ainda se vai mais longe,
usando a fenómica (monitorizar o fenótipo). E isto traz ao de cima o
epigenoma, pouco conhecido mas de extrema importância, pois
muitas vezes as características das plantas vêm de mecanismos como a metilação e não do gene
sozinho. (Ainda temos hormonoma e Ionoma).

O objetivo da biotecnologia vegetal, é integrar as tecnologias

disponíveis com o melhoramento de plantas e com os sistemas agrícolas
e com isto conseguimos obter um determinado produto de interesse.

Novas tendências em Agrobiotecnologia

Fisiolómica – Nem sempre o genótipo que observamos corresponde com o genótipo esperado,
tendo que ser novamente estudado para determinar o genótipo correto

Agrobiotecnologia – Cada vez mais nesta área se usa o conhecimento de outras áreas como a
nanotecnologia com o desenvolvimento de nanofertilizantes e nanofungicidas, tornando o
processo mais controlado tendo impacto na saúde humana e ambiente. Agricultura digital, com
recurso a sensores para determinar condições da planta.

New breeding techniques – Edição génica, com recurso a CRISPR-Cas9 e com a sua contribuição
avançar celeremente o melhoramento vegetal.

Tecnologias de sequenciação de cels individualizadas – Usando tecnologias de microfluidos e

laser microdissection para saber como forma de descobrir novos fenómenos de regulação
biológica.

Biologia Sintética – Gerar novas sequências de DNA e/ou organismos ou redesenhar os sistemas
biológicos naturais. Um bom exemplo é a transferência de vias biossintéticas inteiras de uma planta
para outra, expandindo a diversidade de compostos.

Benefícios da Agricultura Biotecnológica

A agricultura tecnológica é capaz de ser a resposta que precisamos para lidar com a procura de
alimento que o futuro trará com o aumento da população e das alterações climáticas. Com elas
podemos ter mais comida (melhor rendimento e características de qualidade), melhor comida
(menor uso de pesticidas e frutos mais nutritivos), melhor saúde (produção mais barata e fácil de
biofarmacêuticos, e proteção ambiental e sustentabilidade.

É o conjunto de tecnologias baseadas no melhoramento de precisão com recursos aos

conhecimentos biomoleculares para a obtenção de variedades vegetais ou sistemas agrícolas
mais adequadas à produção agrícola.

Pequeno exemplo:

Obter cultivares resistentes ao oídio

Devido à domesticação, houve uma perda de biodiversidade com

uma fixação de alelos que dão características do nosso interesse mas
não do interesse da planta, muitas vezes afetando a própria resistência
natural da planta a vários tipos de stress. Aqui faremos melhoramento
vegetal. E podemos ir por duas vias:

Melhoramento moderno convencional – Fazer o screening de germoplasma (do pangenoma –

domesticado e wild), usando marcadores moleculares e QTLs para os genes de interesse e
realizando a introgressão e breeding (usando cruzamentos para inserir os genes).

Engenharia Genética - Usando o estudo de ómicas e de caracterização funcional de genes;

cultura in vitro para regenerar a planta e usando conceitos como gene editing e de novo
domestication.
 - A EG introduz ganhos de função e produz diversidade genética, algo que a domesticação
retirou ao longo do tempo. As suas potencialidades têm que se analisadas caso a caso. Com ela,
a introdução de alterações é muito mais rápida. Temos de ter em conta que EG é dependente
do genótipo. Algo ainda importante, for the love of god, apliquem a mesma regulamentação a
ambos os tipos de melhoramento.

Aula 2 – Biotecnologia Vegetal

Tabaco e Arabidopsis de ciclo rápido e de fácil

transformação em cultura in vitro e transformar
geneticamente.

Temos de transferir para cultivares de interesse.

Ensaios em estufa e no campo.

Continuam os ensaios no campo e na

transformação em larga escala – validação dos
dados concluída - continua a avaliação
agronómica feita durante vários anos.

Começa a geração de info de regulação do processo e a submissão e controlo de qualidade

antes de colocada no mercado. Mínimo de 8 anos e um investimento de 50M no mínimo.

Obviamente hoje em dia temos várias espécies geneticamente modificadas que nem são
transgénicas e que podem ser colocadas no mercado mais facilmente e ser mais aceites
socialmente.

Melhoramento Vegetal

1 – Explorar a Variabilidade Existente

Por métodos tradicionais de seleção, ou QTLs (Loci de características quantitativo) e desequilíbrio

de ligação (algumas combinações de alelos ou marcadores que ocorrem relativamente
frequentemente numa população do que era esperado pela formação aleatória) e exploração
das interações com o microbiota.

2 – Induzir Variabilidade

Por mutagénese não dirigida, haplodização/poliploidização, variação somaclonal ou

modificação genética

Objetivo da biotecnologia de cultivares

O conjunto da EGP com o melhoramento vegetal tem também o nome de engenharia genética
de cultivares. Os objetivos desta estratégia são encontrar e incorporar:

Características de cariz agronómico

- Stress biótico - Resistência a insetos e doenças virais, bacterianas, fúngicas e

de nematodes.

- Tolerância a herbicidas e a plantas parasíticas

- Stress Abiótico - Resistência à seca, Frio, Calor, Salinidade e condições de

solo pobre

Características de Qualidade
- Rendimento - Melhorar a assimilação de N, biossíntese de amido e

assimilação de O2

- Processamento, Tempo de prateleira e reprodução - esterilidade, seedless, etc

- Nutrientes (Nutracêuticos)

- Macro - proteínas, polissacáridos, lípidos, fibra

- Micro - Vitaminas, minerais, antioxidantes etc etc

- Sabor, arquitetura, características de plantas ornamentais

- Óleos, polímeros, biocombustível, ração you fucking name it

Aula 3 – Melhoramento de Plantas

O melhoramento de plantas tem como objetivo manipular a heritabilidade nas plantas, para nosso
benefício. Esta ciência baseia-se na habilidade de identificar nas plantas características de
importância económica e reforçar as características com o recurso ao conhecimento científico
disponível. A variabilidade que procuramos é devido à parte genética e não à parte ambiental

O melhoramento já existe há milénios. Um outro nome para o processo primitivo é a domesticação

Plant Breeding

O breeding de plantas é a seleção artificial em populações geneticamente variáveis de plantas.

No fundo, a manipulação propositada das plantas de modo a criar genótipos e fenótipos de
interesse para fins específicos. Este tipo de manipulação envolve o uso de polinização controlada,
engenharia genética ou ambos, sendo feita depois a seleção artificial da progenia.
Com ela, podemos obter cultivares que respondam às necessidades futuras da humanidade.

Criação de híbridos – possível estratégia

Para fazer a criação de híbridos recorrendo a plantas de

linhas puras (inbred line). Plantas de linhas puras, possuem
genótipos homozigóticos por cruzamentos entre plantas com
homologia e seleção de entre várias gerações. Podem ser
usadas como materiais de breeding que é homozigótico.
Podem ser mantidas durante várias gerações.

Exemplo de uso de EGP

Digamos que uma planta é suscetível para um fungo por ter

um gene de resistência inativo. Por edição génica, podemos introduzir um gene sintético para
ativar a resistência. Outra alternativa é procurar diretamente dentro de plantas resistentes e copiar
os seus genes para a nossa plantas suscetível. Fazer uma transposição de genes.

Melhoramento e Heritabilidade

Para melhor perceber o que podemos fazer com biotecnologia vegetal é importante introduzir
definições para dois conceitos muito importantes:

Melhoramento – A capacidade de reter/introduzir as características fenotípicas desejáveis que

não são afetadas pelas condições ambientais e portanto têm um alto grau de heritabilidade.

E assim chegamos à definição de Heritabilidade – Proporção das diferenças observadas numa

dada característica fenotípica, numa população, que são devidas a diferenças genéticas não
influenciáveis pelo ambiente.

Nós procuramos características com alta heritabilidade

Variação genética, heritabilidade e breeding de plantas

Como vemos, o fenótipo é muito importante no melhoramento, exatamente porque determina se

uma planta é selecionada ou não. O fenótipo de plantas é determinado por:

Composição genética, o ambiente onde a planta está inserida e a interação genótipo/ambiente.

Isto diz diretamente, que os genótipos não interagem todos da mesma forma com o ambiente. O
desafio que existe atualmente é identificar/selecionar plantas que têm genótipos com fenótipos
de interesse, em vez de fenótipos resultantes dos efeitos ambientais. A regra é características com
maior heritabilidade podem ser modificados mais facilmente por seleção e breeding do que
características com baixa heritabilidade.

Porquê fazer melhoramento?

Fazemos melhoramento porque queremos que as plantas canalizem

ainda mais energia para a produção de compostos de interesse ou da
planta em si. Isto implica claro uma otimização das características de
interesse agronómico que resulta em melhoramento das qualidades
nutricionais e nutracêuticas de uma planta.

Domesticação

A domesticação de plantas e animais tem vindo a ser realizada desde há 10 000 anos atrás. Nessa
altura e durante todo o processo de domesticação, os seres humanos apenas selecionavam o
que era para eles necessário para sobreviver.
Este processo no fundo, é o processo pelo qual plantas selvagens são evoluídas/selecionadas
artificialmente para as chamadas cultivares ou crops.

Existem atualmente cerca de 230 culturas domesticadas provenientes de uma grande diversidade
de situações ecológicas e de necessidades humanas.

A domesticação implica a transição de uma espécie do estado selvagem para uma cultivar,
envolvendo alterações ao nível do genótipo e fenotípicas. Durante o processo, apenas as
características que interessavam ao homem foram selecionadas pelo que capacidades de
resiliência foram sendo perdidas, Por esta razão a maioria das culturas não sobrevive in wildo.

Exemplo – Teossinto e Milho

Certos estudos em que se fez a comparação entre o

genoma de teossinto (ramificado com várias espigas)
e 60 variedades de milho (metade das espigas e um só
tronco) demonstrou que a domesticação do teossinto
originou o milho

Síndrome da Domesticação

O que aconteceu às culturas domesticadas? Com o advento da domesticação, culturas

domesticadas em relação aos seus antecessores selvagens têm tipicamente:

- Um aumento do esforço reprodutivo e com isso um aumento dos frutos e sementes (em boas
condições, sementes maiores geram plantas maiores e rendimentos maiores)

- Menor número de sementes e frutos por planta (porque o esforço foi direcionado).

- Perda da dormência das sementes (que prevenia a germinação em anos desfavoráveis)

- Germinação mais rápida e uniforme (pq a dormência foi perdida) e com isso um período de
maturação mais uniforme.

- Os frutos e sementes deixaram de ser deiscentes (necessidade de colheita e semeia pelo

Homem)

- Criou fenómenos no desenvolvimento como, existência de autopolinização, aumento da

dominância apical, sincronização da floração e alteração da coloração

- Levou a um aumento da palatabilidade (redução da toxicidade) e um aumento da adaptação

local

- O mais grave, foi a perda de estruturas defensivas e perda de resistências pois o Homem não
selecionou essas características (o alvo da edição génica atual)

Isto demonstra que muitas das características selecionadas são benéficas para nós, mas muito
prejudiciais para uma planta que queira vincar no ambiente selvagem. Criou-se um mutualismo
com o ser humano e as culturas que domesticou.
No entanto, o paradigma mudou. Hoje em dia tenta-se
encontrar o meio-termo, com muitos dos interesses agronómicos
a passar pelo aumento da resistência a estímulos ambientais
(bióticos ou abióticos). O tal meio-termo é conseguido pelo
melhoramento para aumentar a diversidade.

O milho selvagem, teossinto, origino o milho atual por mutação

espontânea. O que aconteceu foi o descrito acima. Um
aumento do tamanho das sementes e uma perda da deiscência
delas.

Tomate

Olhando para o tomate selvagem face ao tomate domesticado,

não é de estranhar que não seja tentador aumentar a produção
do cultivado. Devido a isso, hoje em dia, temos várias espécies
cultivadas e várias espécies selvagens

Por esta razão temos várias espécies que são cultivadas em apenas
algumas zonas do globo, com características que nos podem interessar
em colocar na cultivar principal de tomate (S. lycopersicum). E visto que
apenas 10% do genoma de tomate cultivado corresponde a cruzamentos
interespecíficos, ainda existem muitas alternativas a explorar.

Pangenoma e Superpangenoma – Caso do Tomate

A sequenciação de várias espécies de tomate cultivadas em zonas isoladas demonstrou que uma
porção do genoma (4000 genes) estava ausente do genoma de referência (tomate da Heinz).
Isto mostra que houve uma perda dramática de genes envolvidos na resistência a doenças
durante a domesticação, o que demonstra que as plantas de tomate selvagem contém
variabilidade genética que foi perdida durante o processo de domesticação

Pangenoma – O pangenoma define o conjunto de genomas de uma espécie e das suas acessões
cultivadas

Superpangenoma – No caso deste, não só temos os dados de uma espécie, mas sim o conjunto
de pangenomas de espécies e suas acessões cultivadas dentro de um dado género.
Um superpangenoma contém duas
componentes:

Core genome – As porções do genoma

que está presente em todos os indivíduos
das várias espécies que constituem o
género

Peripheral genome – Que inclui as

porções do genoma que diferem entre os
vários indivíduos do género. É neste que
nos focamos para o desenvolvimento de
marcadores moleculares.

Exemplo Brassica

Neste exemplo, vemos que a partir de uma única planta

(mostarda selvagem), por seleção de características de
vários órgãos da planta conseguimos diferentes tipos de
cultivares como brócolos, couve-flor, couve-de-bruxelas,
etc.

Centros de domesticação

A ideia dos centros de domesticação passa pela

noção que as plantas domesticadas, sofreram o
processo numa zona onde existem bastantes
parentes próximos.

Isto implica que há um grande nível de diversidade

genética pronta a ser colhida pela biotecnologia
vegetal. Principalmente diversidade em termos à
resistência ao stress.

Por exemplo no tomate, um alelo raro presente em

plantas wild aumentava o aroma e o sabor face às
plantas cultivadas.

Heritabilidade

A heritabilidade é um conceito estatístico, que descreve quanto da variação existente num dado
trato pode ser atribuída a variação genética. Uma estimação da
heritabilidade de um trato é específica para uma população num dado
ambiente e pode mudar com o tempo.
Quando falamos de heritabilidade queremos que seja
bastante elevada e o objetivo é que seja o mais
próximo de 1 possível (max level). Infelizmente a
maioria das espécies cultivadas tem um nível baixo de
heritabilidade ou seja as características provém da
interação com o ambiente e não da variedade
genética.

É um parâmetro populacional que mede a proporção

da variação fenotípica que resulta da expressão de
fatores génicos.

Assim sendo, o grande objetivo do melhoramento de

plantas é maximizar a heritabilidade das cultivares. Com isto, queremos aumentar a produtividade
e qualidade.

Produtividade  Pode ser aumentada melhorando a

adaptação à estação do ano e a tolerância aos fatores
bióticos e abióticos.

Queremos fazer isto devido à quasi inevitabilidade das

alterações climáticas. Estas vão criar condições nefastas que
para além de empobrecer ainda mais os solos e a sua
qualidade, também irá trazer uma temperatura maior global
que dá possibilidade de existirem cada vez mais pragas que
podem dizimar as culturas

Qualidade  Pode ser melhorada face a características organolépticas, químicas (teor em ferro),
mecânicas (qualidade das fibras) e biológicas (valor alimentar ou conteúdo em vitaminas).

Aula 4

Racional do melhoramento vegetal

O racional do melhoramento vegetal passa pelo reconhecimento das características de interesse

e de desenhar formas de as avaliar no material vegetal disponível. Isto passa por encontrar a fonte
dos genes de interesse e a sua combinação em variedades melhoradas. Faz-se uma comparação
entre as novas variedades com as já cultivadas e se os critérios forem cumpridos tornamos
disponíveis as novas cultivares já melhoradas.

Técnicas usadas para melhoramento de plantas

Seleção clássica – sem cruzamentos ou seja seleção da melhor planta

Enxertia

Hibridação clássica – com cruzamentos (abertos ou controlados)

Hibridação inteligente – com recurso a marcadores moleculares

Melhoramento por mutação – Com o uso de químicos ou raios X para induzir mutações random

Di-haploidização – Induzir micrósporos a realizar embriogénese (mais à frente)

Salvamento de embriões – originar híbridos de cruzamentos que iria resultar em aborto de embriões

Variação somaclonal e Engenharia Genética por meios de Gene Editing

Enxertia

Um método comum em árvores de fruto. As camadas de tecido cambial do

caule de uma planta são fundidas às camadas de tecido cambial de outra
planta. As camadas entram em contacto e temos união xilema-xilema e
floema-floema entre as plantas.

Muito usado para combater doenças que se instalam em locais específicos,

visto que ficamos com uma porção resistente e mantemos a qualidade dos
frutos da planta original

Mutagénese

Um método muito usado durante a década de 60-70. Ao usar

radiação e químicos, tenta-se induzir mutações no genoma que são
na maioria dos casos imprevisíveis, e seleciona-se a planta que
demonstrar tratos de interesse. Não está sujeito a regulamentação
como CRISPR por exemplo. Muito usado pela indústria ornamental
para obtenção de novos fenótipos de pigmentação de flores.

Di-haploidização

Neste caso, queremos tirar partido do programa de desenvolvimento embutido em micrósporos.

Ao fazer isto, podemos fazer a
indução (choque de temperatura)
da sua embriogénese em vez da
entrada deste na via normal do
pólen.

Durante a formação do embrião, há

uma estrutura de calose que vai
proteger as estruturas (essencial para
o processo). A camada em si é
osmoprotetora e está associadas a
processos pré-organogénicos.

O embrião tem todas as células iguais e temos divisões coordenadas. Como o genoma é todo
igual, este método é muito usado para obtermos linhas duplas haploides. Estas são muito úteis no
breeding de plantas (fazer backcrosses) e no mapeamento de QTLs. Outros exemplos são os de
uva de mesa (“seedless”)
Variação somaclonal

Neste caso temos o efeito prolongado da cultura in vitro.

Com o constante stress que a cultura in vitro coloca nas
plantas, estas ao fim de algum tempo sofrem variações no
genoma que podem ser benéficas ou causar problemas
na cultura. Quando benéficas são uma boa opção para
ganhar variabilidade

Por exemplo, ter flores de cores diferentes da inicial.

Melhoramento clássico

As técnicas clássicas do melhoramento continuam a ser fundamentais. Sem elas o melhoramento

não existe. São elas:

Hibridação clássica – Fazer cruzamentos entre plantas para tentar obter uma
característica de interesse. Usando o processo de emasculação (passagem
do pólen para um ovário em desenvolvimento na fase de sépalas abertas e
pétalas fechadas), para obter um híbrido.

Introgressão – Passagem de genes de interesse de uma espécie

selvagem para uma espécie domesticada. No fundo uma
tentativa que recorre a constantes cruzamentos e seleções após
cada geração. Inicialmente podemos ter apenas 50/50 de
genes, mas ao cruzar sempre com a variedade domesticada,
acabamos apenas com o genoma de interesse da variedade
selvagem.

Usado para aumentar a quantidade de licopeno no tomate por

exemplo.

Um programa convencional de melhoramento pode começar em 800 cruzamentos com 2 milhões

de plantas e chegar ao fim e termos apenas 1 linha com os tratos do nosso interesse!

Melhoramento de precisão/melhoramento molecular

Conjunto de tecnologias para melhorar as culturas e otimizar a produção e qualidade alimentar.

Tem passos específicos a seguir. Começamos por explorar a variabilidade alélica natural, seguido
da alteração da informação genómica. Fazemos o controlo espacial e temporal da expressão
génica ou tentamos controlar os mecanismos epigenéticos.

Qualquer uma das opções ou conjunto de opções pode funcionar, dependerá da planta. Se for
bem-sucedido teremos um melhoramento com sucesso.

Epigenética para o Melhoramento de Plantas

A epigenética refere as mudanças heriditáveis que ocorrem na expressão génica que não são
mediadas pela modificação da sequência de DNA. Começa-se a debruçar mais sobre este
campo pois descobriu-se que os genes que controlam os tratos agronómicos mão conseguem
explicar toda a diversidade fenotípica observada nas plantas e na proporção significativa de
heritabilidade,
As marcas de cromatina e mecanismos de regulação epigenéticos são essenciais para o controlo
do desenvolvimento das plantas e na formação da plasticidade fenotípica (resposta a stress
ambiental).

Estas marcas de cromatina são a metilação e as PTM que ocorrem ao nível das histonas que
determinam a conformação da cromatina e por sua vez a sua atividade. O DNA genómico de
plantas pode ser metilado nas citosinas por
DNA metiltransferases. No que trata a PTMs,
estas podem incluir acetilação, fosforilação,
metilação e ubiquitinação.

Estas são tão importantes, que se as plantas

forem mutantes para estas PTMs, ficam sem
habilidade para conseguir lidar com stress
proveniente de estímulos ambientais

Por exemplo, para determinar os efeitos que

a domesticação e melhoramento intensivo
fizeram às cultivares, podemos olhar para a
metilação por DNA footprints que
determinam a diminuição de diversidade
genética.

Neste esquema vemos as duas vias de melhoramento por epigenética. Ou exploramos a natural
(métodos da esquerda), ou tentamos aumentar a diversidade genética (direita)

Uma boa maneira de analisar o epigenoma, é estudar o genoma à medida que colocamos
plantas em condições de stress. Por exemplo o tomate
colorless:

Este tomate é o resultado de uma epimutação que retira a

acumulação de carotenos no tomate à medida que
amadurece e que impede o seu verdadeiro
amadurecimento. Podemos fazer a avaliação do metiloma
ou outros intervenientes em PTMs. O tomate foi mutado por
CRISPR numa DNA metilase, o que resultou numa
hipermetilação de um promotor, e daí o não
amadurecimento deste,
Mudança de Paradigma – Domesticação de novo

O paradigma anterior era recolher genes de interesse das variedades selvagens e introduzir na
nossa variedade domesticada. Hoje
em dia olhamos para o processo
completamente no reverso.

Com a domesticação de novo,

olhamos para a variedade selvagem
e tentamos introduzir os genes de
interesse da nossa cultivar (meio de
engenharia genética CRISPR-Cas9)
na variedade selvagem, criando uma
nova cultivar que contém todas as
propriedades comerciais da antiga e
com os tratos agronómicos
necessários para se manter resistente
aos estímulos ambientais.

Aula 5 – Marcadores moleculares e os seus Usos

O que são marcadores moleculares?

Um marcador molecular é uma localização física num cromossoma (por exemplo, um local de
corte para enzimas de restrição, um microssatélite, um polimorfismo) ou uma isoenzima, que
demonstre polimorfismos entre indivíduos, populações ou taxa cuja hereditariedade pode ser
monitorizada.

São herdados de maneira Mendeliana e podem ser usados para identificar indivíduos ou espécies.
Serem herdados de maneira mendeliana significa que seguem as regras de Mendel no sentido em
que os genes podem ter duas versões (dominante ou recessiva).

Sendo assim, os marcadores podem mostrar dois tipos de hereditariedade:

Dominante/Recessivo  Os perfis das bandas dos marcadores dominantes são

avaliados pela presença ou ausência de fragmentos de um determinado
tamanho e não se consegue determinar a heterozigotia (big no no)

Codominância  Os marcadores codominantes são aqueles em que os dois

alelos são expressos quando ocorrem simultaneamente num indivíduo. Se o
padrão dos homozigóticos puder ser distinguido dos heterozigóticos, então
podemos afirmar que o marcador é codominante. São muito mais informativos
e são os preferenciais na biotecnologia vegetal
Polimorfismos

Toda a ideia de usar marcadores moleculares assenta na existência de polimorfismos que ocorrem
naturalmente. Os bp (base pairs) são mais frequentes em grandes rearranjos. A nível do DNA as
diferenças variam de espécie em espécie (humanos 1 a 2 por cada 1000; milho 40 por cada 1000).

Nível de polimorfismo

O poder de resolução dos marcadores moleculares é determinado pelo nível do polimorfismo

detetado, que é afetado pela taxa de mutação nos locais genómicos envolvidos. Isto é
importante pois quando queremos escolher a técnica adequada, é preciso ter em conta que o
nível de polimorfismo detetado tem de estar relacionado com o grau de relação no material
estudado.

No fundo, um maior poder de resolução é necessário quando as amostras são muito próximas uma
da outra. Por exemplo escolher zonas de mutação em loci de micro e minissatélites são estimadas
a ocorrer em maior frequência por meiose.

Acumulação de mutações em plantas

As plantas ao contrário dos humanos por exemplo, passam por obstáculos únicos na integridade
genética a longo termo. Elas não possuem linhas germinativas reservadas, pois os gâmetas
aparecem a partir de células meristemáticas que já sofreram um grande número de divisões

Durante o crescimento meristemáticos e desenvolvimento floral, a integridade do DNA é posta em

causa por múltiplas oportunidades de erros de replicação e danos no DNA por mutagéneos
ambientais dos quais não conseguem escapar como o UV-B e endogenamente pelos radicais de
oxigénio que se originam com a fotossíntese.

Este acumular de acontecimentos, e a falta de linhas germinativas para

repor condições normais, fazem com que as plantas acumulem as
mutações que têm.

Exemplo – Se formos a ver, no caso dos citrinos há mutações

espontâneas. A toranja por exemplo, resultou de uma mutação

Outro exemplo é o das uvas da variedade Tinta Riscadinha, que por mutações e
introgressões acabou por adotar uma pigmentação e padrão riscado na sua uva.

Para podermos considerar marcadores moleculares como sendo robustos, é preciso que estes
preencham determinadas características:

Polimórficos – Um polimorfismo é uma variação detetável e hereditável num locus.

Reprodutíveis – Têm que dar resultados similares em diferentes experiências

Preferência pela Codominância – Pois ambos os alelos serem expressos em heterozigóticos e ajudar
a perceber a diferença entre homozigóticos e heterozigóticos.

E claro, a deteção do marcador tem de ser rápida e barata.

Microssatélites ou Single Sequence Repeats (SSR)

Os microssatélites são repetições no DNA, que ocorrem geralmente en zonas não codificantes do
genoma. Em organismos eucariotas, podemos encontrar entre 1000 a 10 000 loci de SSRs no
genoma.

Para além disso, os seus níveis de mutação são muito altos com valores até 1x10-7/locus/geração.

Usualmente as mutações nos SSRs resultam do deslizamento da DNA polimerase durante a

replicação, seguida de reparação, ou de mutações pontuais.

Podemos classificar os microssatélites de acordo com vários parâmetros:

Estrutura  Mononucleotídicos (Repetições de 1 nucleótido); Dinucleotídico (Repetições de dois

nucleótidos), Trinucleotídico (Repetições de 3 nucleótidos); Tetranucletídico (Repetições de 4
nucleótidos) e por aí em diante.

Número de bases  Entre 10 a 30 bp (Microssatélites); Entre 10 a 100 bp (Minissatélites)

Tipo de sequência repetida  Perfeita (Repetições perfeitas); Imperfeita (Quando as repetições

são interrompidas por nucleótidos não repetidos); Composta (Quando temos dois tipos de
repetições em tandem)

Estas repetições como dito anteriormente, variam de indivíduo para indivíduo. Uma boa maneira
de verificar a sua existência é recorrendo a uma eletroforese em gel (muito usado em casos de
violação, visto que existem SSRs no cromossoma Y dos homens):

Exemplo

Imaginemos que temos dois

indivíduos. Se fizermos uma análise
ao seu DNA para a presença de
polimorfismos e a evidenciarmos em
eletroforese, percebemos que
existem bandas distintas e de
diferentes tamanhos. Isto mostra a
variabilidade dos SSR.

Os SSR são muito usados, por serem herdados de forma codominante, serem abundantes no
genoma, terem alta taxa de mutação, alta taxa de reprodutibilidade e por serem facilmente
verificados quanto à variação na dimensão usando pares de primers para PCR.
Como podemos desenvolver primers para SSR?

Há várias estratégias que podem ser empregues. Uma delas recorre a bibliotecas de cDNA. Estas
foram a base para o início da transcritómica, e é por causa delas que temos acessos a bases de
dados com múltiplas sequências.

Nestas bibliotecas, cada transcrito estava caracterizado por um cDNA clonado em vários vetores.
Amplificando ficávamos com um microarray de cDNA. Como podemos ter SSR codificantes,
surgem os gSSR ou EST (amostras de mRNA purificado) – SSR.

Qunado temos as sequências nas bases de dados, basta fazer a identificação e desenhar primers
para detetar o polimorfismo.

Quando não temos, podemos recorrer a next-generation sequencing para gerar short reads de
sequências genómicas e fazemos de novo a deteção do polimorfismo.

Hoje em dia…

A nova estratégia de desenvolvimento de primers para microssatélites baseia-se no uso de

sequências em bases de dados e next-generation sequencing, ou seja baseado em ferramentas
computacionais que produzem listas completas de SSRs

Identificando SSRs…

Como já vimos, existem variantes alélicas em loci de SSR. Estas podem ser verificadas recorrendo
a:

- Eletroforese em gel de Agarose (fraca resolução)

- Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE, mais trabalhoso mas melhor resolução)

- Por sequenciação, pela síntese de primers com marcadores fluorescentes para SSRs e
genotipagem por eletroforese capllar em sequenciador convencional

Após a análise e genotipagem obtemos a

tabela abaixo. Nesta vemos as diferenças entre
alelos de microssatélites (De acordo com o seu
tamanho

Os SSRs continuam a ser uma opção preferencial como marcadores moleculares. No caso da
análise genómica da videira, têm sido úteis para identificar novas fontes de genes para
melhoramento ou domesticação de novo (exemplo da Vitis vinífera silvestris).

Geralmente os SSRs são considerados seletivamente neutrais e por isso presume-se que tenham
um efeito neutral. O comentário é perigoso exatamente porque ainda não sabemos o suficiente
sobre o funcionamento dos SSRs no genoma!!!!!!!
Single nucleotide polymorphisms (SNPs)

SNPs e Haplótipos

Como o nome indica, os SNPs são polimorfismos que apenas variam num único nucleótido.
Costumam estar intimamente relacionados com haplotipos.

Um haplotipo é um conjunto de variações de DNA ou polimorfismos que tendem a ser herdados

em conjunto. Refere uma combinação de alelos ou de conjunto de SNPs encontrados no mesmo
cromossoma

Na figura temos 4 haplotipos divididos horizontalmente de um gene de

263bp. Foram sequenciados 32 indivíduos que têm um polimorfismo no
mesmo gene.

As colunas verticais identificam 9 sites polimórficos incluindo zonas de

indel (inserção/deleção)

De entre os 4 haplotipos demonstrados podemos detetar SNPs que são

transmitidos hereditariamente.

Face aos SSR, os SNP são vantajosos na medida que são altamente
reprodutíveis (diferenciamos alelos pela sequenciação e não por
tamanho).

São ainda bialélicos, pelo que podemos ter dois tipos de nucleótidos no mesmo alelo.

A realidade é que podemos usar tanto SNPs como SSR e o uso conjunto pode complementar o
conhecimento da diversidade.

Em videiras, a análise do germoplasma determinou que a

diversidade genética média (quantificada pela heterozigotia
expectável) era maior para loci de SSR do que SNPs. A
caracterização molecular deste germoplasma contribui para o
conhecimento dos níveis de distribuição de diversidade no
género Vitis. Usando estes marcadores podemos ver até a
nacionalidade de cada amostra!

Aplicações dos marcadores moleculares

A maioria dos marcadores moleculares são usados para identificação de germoplasma (então
em videira é mais que usado xD). Mas para além disso podem servir outros propósitos:

- Desenvolvimento de estratégias de amostragem, identificação de lacunas em coleções e sua

formação/validação, validação de germoplasma e sua avaliação genética;

- Quantificação de deriva genética, identificação de contaminação genética, análise de

diversidade funcional, distribuição da variação genética e manutenção dos recursos para uso
científico.
Exemplo – Pangenome

Quando queremos fazer o superpangenome, temos

material altamente cultivado, material domesticado mas
pouco usado e parentes selvagens. Ao fazermos a
sequenciação e identificação de variações no genoma
podemos passar à fase de desenvolvimento de
marcadores moleculares para o melhoramento vegetal

Genética Quantitativa e Marcadores Moleculares

Quantitative trait Loci (QTLs)

Os QTLs são um método estatístico que liga dois tipos de informação. A informação fenotípica
(quantificar características como resistência e tamanho da semente) e a informação genotípica
(quantificada usando marcadores moleculares). São identificados por análise bioinformática
integrando os dados genotípicos e fenotípicos.

Muitos tratos economicamente relevantes mostram heritabilidade quantitativa – segregação da

progenia por padrões contínuos de expressão. O contrário desta é a heritabilidade qualitativa que
recorre às classes discretas da genética mendeliana.

Isto deve-se sobretudo à expressão variável de vários genes para a expressão de uma única
característica

O objetivo é determinar a base genética da variação no desenvolvimento de características

complexas como pro exemplo o tamanho da semente (depende de vários genes). Assim a
segregação destes genes dá uma grande variação nesta característica.

Características qualitativas devido ao seu padrão restrito são pouco influenciadas pelo ambiente
e por isso possuem alta heritabilidade. Contudo características quantitativas podem ser muito
influenciadas pelo ambiente e por isso têm baixa heritabilidade (os breeders estão interessados
em melhorar estas)

Assim sendo, os QTL são zonas do cromossoma baseadas nas posições dos marcadores
moleculares em mapas de linkage,

Construir mapas de linkage

Um dos pré-requisitos para podermos fazer seleção baseada em marcadores moleculares é a

identificação dos marcadores intimamente ligados a uma característica de interesse. E isto
pressupõe a criação de mapas de linkage.

O linkage é detetado por cossegregação da característica de interesse com o loci marcado

numa região específica do cromossoma. Claro que um pressuposto disto é que é imperativo a
existência de polimorfismo entre os parentais da descendência.

Exemplo

Imaginemos que temos um cromossoma já com marcadores moleculares

com localização conhecida (SSR e/ou SNP). Há marcadores que pela
proximidade têm tendência a ser herdados em conjunto. Agora pensemos
que vamos analisar resistência na população, e que certos indivíduos têm
mais que outros.

Com os marcadores com localização conhecida, podemos identificar os

genes que são responsáveis pela resistência ao fazer uma análise do mapa
de linkage. Os marcadores polimórficos que forem herdados em conjunto para a nossa
característica de interesse vão identificar os genes responsáveis.
Exemplo prático

No tomate, fizeram a identificação seguida de introgressão e validação

de QTLs voláteis. Os investigadores descobriram que determinadas zonas
dos cromossomas eram responsávei pelo aroma metilsaliçato. E noutra
zona o aroma tropeno. Isto é um bom exemplo que mostra como os QTLs
fazem a relação entre os dados fenotípicos e os marcadores moleculares
usados. São um instrumento importante no melhoramento vegetal

Aula 6 – Uma História da Biotecnologia Vegetal Moderna – Cultura in vitro até à EGP
Cultura in vitro de plantas

Na cultura in vitro, existem duas características inerentes às plantas que estão na base da
possibilidade de empregar este método. São eles a Totipotência e a Diferenciação.

Totipotência – Uma célula pode originar qualquer outra célula por diferenciação. Isto significa que
células de qualquer tecido da planta, desde que tenham um
fornecimento de meio de cultura apropriado e nas
condições de esterilidade necessárias, podem originar a um
novo organismo.

Diferenciação – A capacidade da célula de se especializar

para um objetivo definido. Em plantas, temos a benesse de
qualquer célula poder ser desdiferenciada para voltar a
condições meristemáticas (Adquirindo totipotência)

Estes dois conceitos, são a base e os pilares da possibilidade de fazer propagação clonal de
plantas e usá-las na produção de metabolitos ou de podermos fazer edição génica estável.

História da Biotecnologia Moderna

1838/39 – Teoria Celular de Schleiden e Schwann

O início disto tudo até é relativamente recente face a outras ciências. A

teoria celular diz que todos os organismos têm celulas e que estas são a
unidade básica da vida

A isto, Schwann acrescenta que qualquer célula de um organismo é capaz de desenvolvimento

independente se forem dadas as condições externas necessárias.

Morgan (1901) completa um ponto importante ao dizer que células totipotentes são capazes de
regenerar um organismo inteiro,

1850/90 – Descrição de calli resultantes de ferimentos

Quando os tecidos vegetais era sujeitos a feridas, formavam-se estruturas (calli) que
permitiam a reparação das zonas afetadas. Atualmente sabemos que a divisão celular
é ativada pelas auxinas e citocininas

1892 – Klercker -> Obtenção dos primeiros protoplastos por isolamento mecânico
(plasmólise + corte da parede celular)
1902 – Haberlandt -> Tentou verificar a teórica celular usando células isoladas e meios com
nutrientes (Knops + sacarose)

Consideramos Haberlandt como o pai da cultura in vitro de celulas e tecidos

vegetais

Teorizou que se conseguíssemos cultivar as células com nutrientes adequados,

somos capazes de elicitar processos de desenvolvimento e regeneração. Poder-
se-ia pensar em cultivar embriões artificiais de células vegetativas.

Infelizmente não foi muito bem-sucedido pois não conseguiu perceber que a
desdiferenciação celular para uma fase meristemáticas implica a presença de reguladores de
crescimento.

1923 -> Primeira batata híbrida (resistente a Pythophthora infestans e de

melhor qualidade

1933 -> Primeiro variedade híbrida de milho lançada nos EUA

1928 – Stadler Mutações em cevada -> Temos o 1ºexemplo de melhoramento por

mutagénese aleatória com recurso a raios X.

1928 – Frits Went – Descoberta de regulador de crescimento (não sabiam que eram auxinas)

A típica experiência de remover a ponta do coleóptilo e colocar agar para

verificar a presença do regulador.

1931 – Kogk e Haagen Smit -> Purificação do composto chamado auxina A.

Posteriormente, Kogl isolou outros compostos dos quais o IAA que foi favorecido
como a auxina mais forte e o seu potencial como regulador de crescimento. Em
1946 ainda descobriu o PAA e o IBA.

1931 – White; Gautheret -> White faz a manutenção por tempo indefinido
de raízes de tomateiro in vitro em cultura líquida (sais, sacarose e extrato
de levedura);

Gautheret cultivou o tecido cambial de Padreiro (Acer spp.) e obteve multiplicação

desorganizada de células, com tempo limitado a 18 meses

1939 – Nobecourt, Gautheret e a Obtenção de Callus

Devido a uma escolha afortunada do material vegetal (cenoura e tabaco),

conseguiram obter com relativa facilidade calli em cultura (células
desdiferenciadas em multiplicação desenfreada).

1943 – Braun e White -> Demonstram que a infeção de plantas por Agrobacterium tumefaciens
induz uma transformação “cancerosa”, originando a doença da galha (Crown Gall)
1946 – Ball e a cultura de gomos caulinares

A técnica baseia-se no cultivo de plantas

transplantadas apenas recorrendo às gemas ou
gomos caulinares com primórdios foliares. A
técnica permite a produção estimada de 4 M de
plantas idênticas a partir de um único gomo
caulinar durante um período de 1 ano.

1947 – Levine e 1ª observação embriões somáticos -> Marco importante

da cultura in vitro, observado em cultura de tecidos de cenoura

1948 – Skoog -> Observação que a adição de adenina aumenta a proliferação celular e
diferenciação de meristemas adventícios.

Organogénese e Embriogénese Somática (Direta e

Indireta)

A forma direta consiste no uso de explantes para

crescimento de meristemas caulinares adventícios
para formar a planta inteira – organogénese

A forma direta consiste em induzir embriões somáticos

diretamente a partir do explante sem fase de callus –
embriogénese somática.

A forma indireta consiste na passagem pelo passo de indução de calli tanto na organogénese
como na embriogénese somática,

Os embriões somáticos podem ser diferenciados das gemas adventícias por serem bipolares com
primórdios radiculares e foliares sem conexão vascular ao tecido parental.

1950 – Morel -> 1ª Obtenção de culturas de tecidos de monocots, com uso de leite de coco
(contém auxinas e citocininas tal como outros reguladores de crescimento).

1952 – Morel e Martin -> Conseguiram produzir plantas sem vírus através de cultura de gomos
caulinares de plantas infetadas através da sua excisão. Pensa-
se que isto ocorra devido à dificuldade de vírus se
propagarem em celulas meristemáticas

Também se pode fazer termoterapia ou crioterapia, podendo

destruir os primórdios mas mantendo a viabilidade das celulas meristemáticas – menos
sobrevivência mas estarão saudáveis
Crioterapia – Processo de congelamento de gomos
caulinares em nitrogénio liquido durante um curto
período seguido de regeneração.

As temperaturas baixas são usadas para matar todas

as células que não sejam meristemáticas. Por serem
celulas com grande conteúdo citoplasmático e
poucos vacúolos e por isso menos teor em água, são
capazes de sobreviver nestas temperaturas. Um
processo muito eficiente na erradicação de
patogéneos.

Exemplo de termoterapia, antiviral,

crioterapia

Como se vê o tratamento por crioterapia é

o mais eficiente e é o preferencial para vírus.
Noutros patogéneos como fungos vale mais
usar fungicidas mesmo.

1953 – Tuleck -> 1ª Obtenção de tecidos a partir de cultura de grãos de pólen

(estrutura haploide e plantas haploides)

1954 – Muir -> 1ª Culturas de celulas em suspensão

1954 – Skoog e citocininas

Usando uma amostra antiga de DNA, tentou promover o crescimento de callus em

tabaco e teve um efeito promotor. O componente ativo estava apenas presente
na amostra de DNA antiga ou nas amostras frescas autoclavadas o que apontava
para o componente ativo ser um produto vindo da quebra do DNA

Em 1955 identificou esse componente como sendo uma citocinina e teorizou que
fatores tipo citocinina estavam presentes nas plantas como reguladores de
crescimento natural. Isto foi verificado posteriormente em 1963 com o isolamento da
zeatina.

1957 – Skoog e Miller e os efeitos da razão Aux/Cyt nos meios de cultura

Um marco de extrema importância na cultura in vitro e na

produção de meios de cultura indutores essenciais para o
desenvolvimento de plantas a partir de explantes

Se a razão for 1:1 teremos a formação de Calli

Se for Aux/Cyt > 1 então teremos diferenciação de raízes

Se for Aux/Cyt < 1 então temos o desenvolvimento caulinar

1955 – Indra Vasil e a cultura de anteras para obtenção de plantas haploides

Em vitro, usamos células (cultura de micrósporos) que em condições propícias com açucares e
hormonas, sofrem mudanças de programação para diferenciar estruturas in vitro

A cultura anteras é mais simples e ainda é usada, mas a

cultura de micrósporos tem vantagens por não haver
interferência com as paredes das anteras e porque o
desenvolvimento de embriões pode ser feito diretamente.

Os micrósporos têm uma ótima capacidade de se

desenvolver em plantas haploides in vitro. O método usado é
o tratamento de stress que atua como trigger para a via
esporofítica em vez de passar pela via de desenvolvimento
de pólen fértil.

Os duplos haploides representam uma ferramenta importante na investigação como já

demonstrámos. Estes são produzidos por androgénese e são largamente reconhecidos no
breeding pois encurtam o ciclo de reprodução, corrigem tratos agronómicos no estado
homozigótico e aumentam a eficiência de seleção de tratos agronómicos recessivos.

Uma característica determinante nesta cultura de micrósporos, é a acumulação de calose nos

embriões como vimos anteriormente. A reprogramação da parede celular também é um fator
determinante para a viabilidade deste tipo de embriões.

1958 – Steward et al. -> Demonstram a totipotência celular em plantas através de

embriões somáticos de células de raiz de cenoura em suspensão

1959 – Tulecke e Nickell -> Produção de grandes quantidades (134L) de

tecidos vegetais em cultura submersa. Ótimo para metabolitos
secundários :3

1960 – Morel -> Aplicação de culturas de meristemas à propagação

clonal de orquídeas. Cocking -> obtenção pela primeira vez de protoplastos
usando celulases não purificadas. Os protoplastos são ótimos para hibridação
somática

1961 – Torrey -> Demonstrar da existência de variabilidade no número e na estrutura dos

cromossomas das celulas vegetais em cultura – Há correlação entre a perda da capacidade
regenerativa e o aumento das anormalidades na constituição cromossómica

1962 – Murashige e Skoog e meio de cultura

Definição do meio de cultura mais utilizado na atualidade. Uso de IAA e

citocinina. Com este meio, em 1970 Smith e Murashige conseguiram
desenvolver plantas inteiras a partir dos meristemas apicais (sem qualquer
primórdio foliar) em meio contendo sais minerais e vitaminas, enriquecido com
reguladores de crescimento.

1964 – Nitsch e Nitsch -> Formação de flores de Chicória

1964 – Guha e Maheswari -> Produção de embriões haploides a partir de culturas de grãos pólen
de Datura
Androgénese funciona com cultura de anteras, cultura de micrósporos e/ou cultura de grãos de
pólen. A melhor é a dos micrósporos porque não há interferência de outras estruturas ou barreiras
dos órgãos.

1965 – Teoria celular verificada -> Teoria celular a partir de diferenciação de plantas de tabaco a
partir de uma única célula isolada em microcultura.

1971 – Takebe, Labide e Melchers -> Obtenção de plantas a partir de protoplastos

1972 – Carlson et al. – Obtenção de plantas regeneradas a partir de produtos de fusão de

protoplastos do género Nicotiana.

1974 – Melchers et al. – Obtenção de um híbrido somático entre a batateira e o tomateiro.

Os protoplastos podem ser transformados

geneticamente (biolistica em monocot). Ou então
fazer hibridação somática. Induzir a fusão com
métodos químicos e temos a regeneração
posteriormente – resulta melhor em monocots mas é
bastante complicado e moroso. Só é usado quando
não há outra alternativa.

Engenharia Genética de Plantas

1972 – Berg -> Descoberta das rnzimas de restrição e em 1973 descobre-se a tecnologia do DNA
recombinante.

1974 - Zaenen: Larebeke et al. -> Descobrem que o plasmídeo Ti é o fator

responsável pela indução de tumores produzidos por Agrobacterium. A
região de T-DNA será a de criação de tumores

1977 – Chilton et al. -> Integração do tDNA em plantas

1978 – Genentech Inc. -> Uso da engenharia genética para produzi insulina
humana a partir de E. coli.

1980 – Patentes

A primeira patente sobre um organismo vivo recém criado foi sobre uma bactéria para digerir
petróleo em derrames, Inicialmente a patente foi rejeitada mas depois o tribunal aceitou desde
que o organismo seja criado por engenharia genética. Em 2013 decidiu-se que as sequências de
DNA que ocorrem naturalmente não podem ser patenteadas.

1981 - Shuler e o uso de produção de metabolitos secundários em células vegetais a partir de

biorreatores
1981 – Larkin e Scowcroft

Introdução da expressão – variação somaclonal

A variação somaclonal é causada por cultura in vitro e pode ter

o nome de variação induzida por cultura de tecidos. Pode
envolver diferenças no número e estrutura dos cromossomas,
bem como mutações, alterações no nº de transcritos, ativação
de transposões ou mesmo alterações nos padrões de metilação

O genótipo e as condições de cultura in

vitro (o tipo de explante, meio, duração)
podem influenciar a ocorrência e a
frequência da variação somaclonal

Exemplo -> Em videiras, investigadores em 2008 determinaram os efeitos que a cultura in vitro
estava a ter nas suas culturas de videiras (embriões somáticos a partir de cultura de anteras por
exemplo) e observaram a existência de variação somaclonal que resultou na alteração de
padrões de metilação do DNA.

1982 – Krens et al. -> Realizaram a transformação de protoplastos e no mesmo ano Zimmerman fez
a eletrofusão de protoplastos (modificação genética em que há fusão de núcleos das duas
espécies)

No mesmo ano foi desenvolvido um protocolo para a transformação de protoplastos com o

plasmídeo Ti,

1983 – Kerry Mulis Nobel Prize -> Concebe a ideia de PCR, um método químico para amplificar o
DNA

Também foi nesta altura que surgiram as primeiras plantas transgénicas:

- Chilton, Montagu e Schell com tabaco resistente à kanamicina

- Fraley com plantas de petúnia resistentes à kanamicina

- Kemp e Hall com inserção do gene de faseolina de feijão em girassol

1985 – Fraley et al. -> Desenvolvimento do vetor para transformação de

plantas contendo o Ti desarmado. Fromm esteve envolvido na
transferência de genes para protoplastos de monocot e dicot por
eletroporação

Flores e Filfner -> Produção de “hairy roots” para produção em larga escala de
metabolitos secundários. São a manifestação de infeção causada por
Agrobacterium rhizogenes Não precisa de hormonas vegetais mas limitante para
alguns compostos
1986 – Crossway et al. -> Transformação de protoplastos por microinjeção direta de DNA
Marco dos primeiros ensaios de campo com plantas transgénicas

1987 – Sanford et al e Klein et al -> Desenvolvimento de método por biolística para

transformação de plantas, com Bytebier a realizar a 1ª transformação de monocot
com A. Tumefaciens

1990 – Programa do Genoma Humano

1991 – Huang et al.-> Produção da primeira conífera transgénica Larix decídua

1992 – Dultta et al. -> Criação de arroz resistente a herbicidas por

transformação de protoplastos mediada por PEG

1993 – Calgene Inc -> Primeiro produto geneticamente modificado a

ter licença de comercialização para alimentação humana.
Desenvolvido com uso de tecnologia de RNA antinsense que leva à
não tradução da proteína PG. O resultado é um tomate que demora
mais tempo a amadurecer.

1997 – Blattner et al. -> Sequenciação de genoma da E.coli

2000 -> 1º Esboço da sequência do genoma de A.thaliana; Modificação

de arroz para síntese de beta-caroteno “Golden Rice”

De 2001 a 2012

Temos o consórcio que faz o esboço inicial do genoma humano, a estatística que refere que 64%
da soja e 34% do milho nos EUA são transgénicos e de 2006 a 2012 surgiu a época da
sequenciação, 2007 com a sequenciação do genoma da videira e 2012 com a sequenciação do
genoma do tomate.

2012 – Surge o CRISPR-Cas9 como novo mecanismo para a edição

génica
Cultura de tecidos vegetais para a Biotecnologia

A cultura in vitro para plantas pode ter vários

inícios, no sentido em que qualquer tipo de
célula pode ser usada para crescer uma planta
inteira. Por isso, foram desenvolvidos vários tipos
de cultura de tecidos vegetais, consoante era
necessário:

Por esta mesma razão, as técnicas de cultura in

vitro têm várias aplicações neste ramo, desde a
investigação fundamental à manipulação
genética.
Cultura de protoplastos

Antes de procedermos à explicação detalhada da cultura in vitro e toda a sua importância vou
fazer um pequeno aparte que é importante apesar de não ser muito usado como método
atualmente. Falo claro da cultura de protoplastos.

Os protoplastos são células desprovidas de parede celular. São usados em engenharia genética
e também podem ser usados para a chamada hibridação somática – o processo de isolar e fundir
protoplastos, fazer cultura de células híbridas e regenerar por processos in vitro.

Isolamento

O isolamento de protoplastos pode ser feito pelo método mecânico

ou pelo método enzimático. O método mecânico é o mais agressivo
e menos rentável (1º desenvolvido). O enzimático é o mais usado e
passa por protocolos de degradação parcial da parede celular de
celulas vegetais.

Devido às condições de fragilidade dos protoplastos teremos que

trabalhar em condições de assepsia e que permitam a
sobrevivência dos protoplastos que são muito sensíveis a plasmólise
(usamos oses para acertar a osmolaridade do meio).

Removemos a epiderme, abaxial por ter menos cutículas. Colocado

numa solução enzimática para a degradação da parede celular
(0,5% de maceroenzima e celulases que podem degradar outros
componentes da parede; temos o manitol para estabilizar a solução). Os protoplastos são muito
sensíveis, exatamente por não terem parede celular

Este é um ponto crítico. Para além disto, é preciso ter em conta as percentagens da solução. Este
é o componente diferencial e que tem de ser otimizado mediante o explante usado!

Fusão

Após obtermos os protoplastos podemos fundi-los e isto pode ser feito

espontaneamente ou induzindo. Na fusão induzida podemos fazer por
estimulação química com PEG ou por eletrofusão.

Regeneração

Após os protoplastos recuperarem na íntegra a parede celular, podemos então fazer a

regeneração dos protoplastos de modo a que se desenvolvam em plantas inteiras e capazes.

Vantagens e Desvantagens da Hibridação Somática

Podemos produzir híbridos interespecíficos, ou produzir continuamente plantas consideradas

inférteis.

Podemos fazer a produção de linhas homozigóticas de uma única espécie que não seja
propagável por micropropagação vegetal.

Contudo tem limitações algo complicadas:

Os protoplastos têm uma taxa de regeneração baixíssima

Para além disto há a questão de que pode não haver viabilidade dos produtos de fusão, a falta
de sucesso entre plantas regeneradas, produção de híbridos desfavoráveis e a falta de método
eficiente de seleção dos híbridos sem confirmação de expressão de tratos importantes nos híbridos
somáticos.
Aula 8 – Propagação in vitro de plantas e Embriogénese Somática
A propagação in vitro de plantas consiste na multiplicação
clonal a partir de células ou órgãos cultivados assepticamente
em meio definido e específico, contido em recipientes de
cultura mantidos em condições controladas de luz e
temperatura

Objetivos

- Multiplicação de genótipos e o seu saneamento (De vírus e outros patogéneos)

- Multiplicação de plantas difíceis de propagar e em risco de extinção e preservação do

germoplasma (sementes sintéticas por exemplo).

- Obter órgãos em cultura asséptica e obter variantes somaclonais

Vantagens

É o único método de regeneração de células editadas ou celulas que resultam da fusão de

protoplastos.

Acabamos por ter uma taxa de fecundidade altíssima, pela produção de milhares de propágulos.

E é um método bastante útil na multiplicação de plantas que produzem sementes em quantidades

não económicas ou quando temos plantas estéreis ou não preserváveis. É um método que produz
normalmente planta mais robustas, por levarem ao crescimento acelerado face aos métodos
convencionais

Exemplo

No caso de preservação do germoplasma Vitis leva o primeiro lugar no que trata ao uso da
micropropagação. Em 2015, investigadores tentaram usar esta técnica de micropropagação para
verificar a resposta de 5 videiras selvagens da Geórgia. Escolheram esta zona pois é onde está o
centro de domesticação da Videira.

Ou então a preservação de plantas do género Castanea, que são importantes para madeira e
para a produção de castanhas para venda comercial. Em 2017, investigadores propuseram usar
micropropagação para proceder á conservação a curto, médio e longo termo, sendo esta última
por meios de criopreservação.

Ou ainda para tentar obter variantes resistentes a doenças através da variação somaclonal que
irá aparecer eventualmente devido à necessidade de usar cultura in vitro para micropropagação

Vantagens e Desvantagens – Abridged

Como vantagens temos a possibilidade de manter a juvenilidade e sanidade das plantas

(eliminação de pragas), uma maior facilidade de sub-propagação e redução do tempo de
multiplicação (não temos de esperar pelo ciclo de vida completo) e principalmente uma redução
no espaço e uma independência das condições ambientais, duas vantagens que permitem
economizar o processo.

Contudo, a tecnologia pode ser algo cara, principalmente para espécies lenhosas que são
recalcitrantes. Outra questão é a da assepsia necessária (clones são menos resistentes) e a própria
aclimatação das plantas é um passo determinante e muitas vezes limitante,

Ainda se acrescenta a questão da variação somaclonal, que não é só coisas boas. Temos de ter
em conta que podemos ter variações que causam inviabilidade ou redução do fitness.
Propagação in vitro -> 3 Vias

1 Via do desenvolvimento de meristemas pré existentes (apicais ou axilares)

Recorrendo a cultura de gomos axilares ou cultura de meristemas

2 Formação de meristemas adventícios (Morfogénese ou Organogénese)

Diretamente ou indiretamente se tor a partir de calli

3 Embriogénese Somática (ES)

Diretamente ou indiretamente se for a partir de calli

1 – Cultura de Gomos Axilares (Segmento Nodais - Lenhosas) e Cultura de Meristemas

Cultura de Gomos Axilares e Micropropagação de Segmentos Nodais em plantas Lenhosas

A micropropagação de segmentos nodais é o processo

usado para propagar meristemas axilares em plantas
lenhosas (muitas vezes consideradas recalcitrantes).
Sendo plantas lenhosas têm um vantagem, que é terem
uma grande quantidade destes meristemas, que equivale
a crescimento exponencial de plantas

Com um meio de cultura otimizado (meio MS), temos o desenvolvimento de gomos axilares que
se desenvolvem e formam rebentos. Os rebentos obtidos são posteriormente passado para um
novo meio onde vão enraizar (meio MS com IBA) em condições de assepsia (assegurada pela
desinfeção dos segmentos nodais com álcool e/ou lixivia). Alternativamente podemos enraizar
diretamente em substrato orgânico (com as devidas precauções).

Com este processo conseguimos obter planta durante o ano inteiro e

para além do mais podemos garantir que estas estão ausentes de
qualquer tipo de fungo ou bactérias (vírus é preciso outro tipo de método
de propagação).

Exemplo

Otimização de protocolos

No caso da agricultura portuguesa, a oliveira e a nogueira são plantas lenhosas

com grande interesse comercial e que devido a inúmeros fatores, como a taxa de
20% enraizamento por estacaria natural, têm sido abandonadas como primeira
escolha de plantação de cultivares.

O uso da micropropagação de segmentos nodais, podemos garantir uma alta taxa

de enraizamento e de plantas livres de infeções ou doenças, o que pode ajudar
largamente o setor agronómico.
Cultura de Meristemas Axilares

Neste método, tal como em todos, temos que começar pela desinfeção. Cada nodo que
escolhemos terá gomos axilares e neles terá os meristemas. Os fragmentos são esterilizados
recorrendo a lavagem rápida em etanol a 70%.

Depois desta fase passamos à fase de remoção dos primórdios

foliares para termos acesso aos meristemas. Usando um bisturi
removemos o meristema e colocamos num meio sólido e fechado
em condições controladas de luz e humidade para crescer (meio
MS)

Depois disto o explante terá que passar por todo o processo de multiplicação in vitro que explicarei
mais à frente (crescimento, enraizamento e aclimatação – mais importante)

Pode ser necessário fazer uma desinfeção mais cuidada se estivermos a lidar com vírus e nesse
caso este método é o predileto para nos livrarmos deles. Como se pensa que os vírus têm
dificuldade em se estabelecer em zonas com muitas auxinas, replicações constantes e falta de
vascularização, podemos aplicar crioterapia aos meristemas excisados, desde que sejam apicais.
Podemos posteriormente fazer a verificação com ELISA que usa anticorpos para detetar a
presença de proteínas virais.

Exemplo

A batata-doce é um bom exemplo de como os vírus podem afetar

negativamente uma cultura inteira. Quando culturas estão infetadas podemos
ter uma redução de 50%. Se recorrermos à cultura de meristemas, neste caso
meristemas apicais, podemos não só obter plantas saudáveis para cultura,
como podemos mesmo ter um incremento nas plantações de batata-doce.

Outra cultivar que passa muito pelo uso de cultura de meristemas é a de Fragaria
chiloensis ou o morango chileno

2 – Formação de Meristemas Adventícios – Organogénese

Organogénese in vitro

O processo de organogénese in vitro não é comum, mas acontece para algumas espécies. É um
método de regeneração rápido e pode ser usado nos protocolos de transformação genética.

Explicação usando o caso do Lúpulo

O lúpulo tem várias substâncias com propriedades

medicinais. Se quisermos produzir estes compostos pelo
método natural, precisaríamos de muito terreno e
estaríamos dependentes das condições ambientais.

Para ultrapassar este problema poderemos usar a cultura

de células vegetais em suspensão (que iremos abordar
mais tarde) mas uma outra possibilidade é a cultura de
órgãos. Esta tem vantagens por permitir um controlo estrito
da oferta de produto e questões de segurança/qualidade,
visto que a produção ocorre sob condições controladas e
otimizadas
Organogénese do Lúpulo

Começamos por fazer indução in vitro de entrenós de plantas propagadas (lúpulo têm 1mm). Essa
indução é feita com segmentos de 1cm dos entrenós e colocamos em meio indutor
(auxinas e citocininas; 0,05mg/mL IAA e 2mg/mL BAP), e fazemos algumas feridas
para promover a morfogénese.

Junto aos feixes vasculares temos as células cambiais e as células do córtex, Ao fim
de cinco dias (figura) em meio de cultura vemos divisões a ocorrer nas células
cambiais. Estas divisões são acompanhadas de acumulação de amido (cuz sugar
no meio de cultura).

Ao fim de 7 dias começamos a ver divisões nas células corticais ou

seja no parênquima, e ao fim de 9 dias temos a formação de calli

Ao fim de 15 dias, temos a formação dos pré-nódulos, ou seja

houve diferenciação de feixes vasculares e ao lado deste
vemos coloração rosada, são as celulas cambiais
diferenciadas. Ao fim de 28 dias temos o nódulo semi-
inidividualizado do explante original. Vemos uma
diferenciação muito mais organizada com células
vacuolizadas a delimitar o nódulo.

Temos consumo de amido pelo nódulo e temos

diferenciação de meristemas e há conexão entre os feixes
vasculares do primórdio com os do nódulo. Podemos ainda
ter nódulos secundários se os feixes se individualizam. Todo
o processo demora 45 dias no mesmo meio de cultura
Depois é fazer repicagem dos nódulos para novo meio para regenerar (Explicado mais à frente).

Reprogramação metabólica e molecular durante a organogénese

Para podermos responder a estas questões, podemos recorrer a transcritómica do mRNA e usar
GC-MS para ver quais são os constituintes metabólicos da nova resposta metabólica. Infelizmente
no caso do lúpulo isto foi feito antes da existência destas técnicas e por isso, recorreram a
microarrays de DNA (2008).

O que se percebeu foi que tínhamos alterações a nível da fotossíntese com grande metabolização
de sacarose e grande ativação da glicose e síntese de metabolitos secundários. As cinco grandes
vias determinantes são então defesa e resposta ao stress; metabolismo de hidratos de carbono,
metabolismo secundário e sinalização hormonal

Cada fase do processo é

altamente regulada e temos a
ativação e desativação de vários
enes com dimoinuição ou aumento
de vários compostos, com ação de
ROS, proteínas G, hormonas,
fosfatases e cinases etc.

Os metabolitos secundários
começam logo ao fim de 24h, mas
acabamos por ter uma grande
quantidade na fase nodular.
Regeneração de plantas por organogénese e o papel na cultura in vitro

O processo de organogénese também pode ser usado como método de propagação in vitro, por
capacitar a propagação e regeneração massiva de plantas e por poder ser usado como método
eficiente de regenerar plantas transgénicas, por exemplo podemos transformar os próprios nódulos
com Agrobacterium. O lado mais negativo é possibilitar a formação de quimeras

Regeneração por organogénese

A organogénese é um processo de iniciação e desenvolvimento de órgãos a partir de células

desdiferenciadas por citodiferenciação. Podemos fazer isto a partir de várias zonas das plantas,
que são os explantes. Estes são desinfetados para podermos trabalhar em condições de assepsia
e o processo é o mesmo que para os métodos anteriores.

Após a lavagem, são cortados pedaços de 1cm e estes são inoculados em meio nutritivo (MS)
com nutrientes e os fatores de crescimento necessários (Aux/Cyt < 1 ou seja mais citocinina)

As culturas são então transferidas para sala de cultura onde terão condições ótimas de luz e
temperatura (Leds amarelos e brancos e sala a 25ºC) com um fotoperíodo especifico. Durante
esta fase temos duas vias:

- Ou temos morte celular

- Ou os fitoreguladores funcionaram e vão induzir a desdiferenciação e o ciclo celular para formar

calli. Será nesta fase que as celulas ganham competência.

Mediante o diferente conteúdo de fitoreguladores podemos ter

desenvolvimento de caules ou raízes. Durante o processo
organogénico as células sofrem divisões anticlinais e um
aumento, com determinação da via. O meristema
determinado passa a ter divisões periclinais e
perpendicularidade da parede celular

Temos feixes precambiais que fazem a ligação do novo órgão

ao explante parental. O desenvolvimento é sempre unipolar e
leva ao sucesso do desenvolvimento de órgãos e com isto
temos a regeneração completa por organogénese, visto que
posteriormente os órgãos passam pelos passos de multiplicação
in vitro.

Direta vs indireta

Podemos ter os dois tipos de organogénese. No caso da direta há um

bypass da fase de calli e por isso os primórdios são produzidos a partir do
próprio tecido. Implica que estes tenham altos conteúdos de reguladores
de crescimento e por isso o meio tem de ser pobre nesses reguladores

A indireta é a que temos falado até agora que passa pelo passo de
formação de calli.

A direta é mais rápida mas a nível regenerativo, a indireta permite uma

maior frequência de explantes e para além disso permite que haja
variação nos tecidos (exemplo de como a variação somaclonal pode ser
útil)
Fases de Multiplicação in vitro – Virtual a todos os processos de regeneração que não a ES

Fase 0 -> Seleção das plantas dadoras – temos de ter em conta a fitossanidade da planta (a
saúde), a fase do ciclo de vida (juvenil ou se esta em fase reprodutora ou vegetativa) e o
consequente estado fisiológico da planta

1ªFase -> Início de Indução (1ª fase de possível limitação)

Nesta fase temos de ter em conta o explante que vamos escolher e a sua esterilização (diferentes
tecidos têm diferentes competências e o mesmo para celulas). Também o manuseamento que
fazemos (criação de ferimentos) e claro o mais importante a suplementação com fitoreguladores

2ªFase -> Multiplicação e crescimento (2ª Fase crítica)

Temos de ter em conta o meio de cultura (nutrientes e açucares – suplementação com oses cada
vez mais simples) e ainda de novo a suplementação com fitoreguladores

A questão dos fitoreguladores é importante, pois são estes que limitam o processo porque a sua
concentração no meio de cultura tem de ser restritivamente específico, ao ter de ter em conta o
conteúdo endógeno presente no explante e da própria sinalização e sensibilidade deste

3ªFase -> Enraizamento

Dois tipos:

In vitro -> temos de ter em conta a necessidade de suplementação do meio de

cultura com alta concentração de auxinas e a redução no conteúdo de sais e
açucares

In vivo -> Neste caso a fase 3 está associada à fase 4 de aclimatação.

O caso mais exemplificativo disto é a regeneração in vitro do tomate das aulas práticas onde
vemos a alteração sucessiva da composição do meio de cultura

4ª Fase -> Aclimatação (A fase mais crítica do processo inteiro de multiplicação in vitro)

Nesta fase, as plantas obtidas são muito delicadas e não conseguem

crescer nas condições complicadas e variáveis do exterior devido ao
seu crescimento mais heterotrófico e com muita humidade in vitro. Para
resolver esse problema temos então a fase de aclimatação, a mais
crítica e que pode levar semanas a acabar.

Queremos que as plantas sejam aclimatadas gradualmente ao ambiente de humidade relativa e

níveis de luz diferentes, de modo a facilitar a sobrevivência das plantas in wildo xD

O ponto nº1 da aclimatação é a limpeza de raízes para remover o meio de cultura. Este meio é
nutritivo e se não for removido é um epicentro de infeções fúngicas. Todo o cuidado tem de ser
empregue no manuseamento das nossas plantas para garantir a máxima sobrevivência. O
substrato inicial também tem de ser bem escolhido, pois tem de ser macio para permitir a
facilidade de enraizamento.

A nível da questão da humidade e da luz, as plantas são gradualmente passadas para estufas
para aclimatarem e poderem ser transplantadas para o campo.

O processo pode ser acelerado, se fizermos a diminuição das taxas de respiração recorrendo a
ABA, que vai induzir o fecho estomático para que haja retenção de água. Graças a este efeito
chamamos a compostos como o ABA, antitranspirantes.

Outra coisa que temos de ter em conta é a necessidade de aumentar a fotossíntese das plantas
que está severamente atrofiada de todo o processo heterotrófico durante a cultura in vitro. Isto
pode ser feito recorrendo a altas concentrações de CO2.
Estruturas de Aclimatação

As estruturas de aclimatação são várias e são usadas consoante o

avanço das plantas durante esta fase. Incluem-se as cúpulas de
aclimatização, as tendas de humidade, as estufas de nebulização e
as estufas de nevoeiro.

Exemplos

Este tipo de métodos de regeneração de plantas são muito usados para propagar
plantas. E várias empresas foram construídas e são casos de sucesso exatamente
porque empregam de modo otimizado estas técnicas para a produção dos seus
produtos de interesse.

O caso da Oglesby é um de sucesso entre empresas de plantas ornamentais.

Fundada em 1895, são conhecidos como os principais fornecedores de plantas
ornamentais entre outras. Usam muito a cultura de meristemas.

Outro caso de sucesso é o da Holanda, os pioneiros da biotecnologia vegetal.

Neste caso, descobriram como micropropagar bolbos de túlipa, uma planta
importante nas exportações holandesas. Com a micropropagação,
através de um único bolbo conseguem produzir centenas de
exemplares.

Outro país influente no uso da micropropagação é a Índia. O seu

setor industrial é muito dedicado a este processo, principalmente
pelo custo barato de mão-de-obra. Conseguem produções na
ordem dos milhões de plantas (Sem problemas ultrapassa os 100 milhões de exemplares)

A nível comercial fazem propagação de cultivares de fruta como a banana, citrinos, videira,
papaia. Fazem ainda de cultivares vegetativas e de plantação como a batata, tomate, couve-
flor, cardamomo, baunilha, café, gengibre you name it!

3. Embriogénese Somática (ES)

O que temos visto até agora é os vários métodos de

propagação in vitro.

Dentro destes métodos, dois são muito semelhantes

no que trata à indução e morfogénese. A indução
e formação de nódulos é muito semelhante à
embriogénese somática.

Ambos passam por processos de desdiferenciação

para ter redifirenciação (regeneração por meio
indireto com calli) e ambos dependem da
expressão de determinados genes qu mantém o estado meristemáticos das cels e a sua
sensibilidade a hormonas (auxinas e um numero exorbitante de poliaminas)

O papel celular na alteração para vias de organogénese ou embriogénese somática tem sido
relacionado com mecanismos de controlo rígido de defesa e mecanismos antioxidativos
Desenvolvimento e embriogénese

Como sabemos o desenvolvimento animal termina quando indivíduo

atinge o estado adulto. No caso das plantas é o exato oposto. O
desenvolvimento vegetal nunca termina.

Mas como começa?

A embriogénese de plantas começa com a divisão

assimétrica do zigoto, resultando numa celula de menor, a
celula apical (terminal) e uma célula maior, a célula basal. A
primeira divisão assimétrica dá polaridade ao embrião, com
a maioria do seu desenvolvimento a ocorrer na porção
apical. A célula basal por sua vez dará origem ao suspensor
que funciona como suporte físico e direcionamento de
nutrientes e reguladores à zona apical onde se desenvolve o
embrião.

Depois temos o restante desenvolvimento até chegar à fase globular e à fase de coração onde
temos já a diferenciação das zonas que darão origem aos órgãos da planta ( a interface ou
hipófise dará origem ao RAM)

Exemplo

Vamos falar do método de embriogénese somática que é um

método de produção de embriões somáticos in vitro. Contudo, temos
um caso clássico que pode ocorrer in vivo

Kalanchoe daigremontiana

As plântulas (morfologia semelhante a embriões zigóticos) desenvolvem-se simetricamente ao

longo da folha e assim que há a formação do sistema radicular, desprendem-se do tecido
parental, neste caso a folha-mãe e caem para solo originando novas plantas

Vias de embriogénese em plantas

Para além das clássicas vias da embriogénese

zigótica e da embriogénese somática ainda existem
outras vias possíveis.

In vivo podemos ter a via da Embriogénese

Apomítica, que implica a formação de embriões a
partir de células não fertilizadas do saco
embrionário.
Embriogénese somática – Agora sim bora lá

A Embriogénese Somática ou ES é caracterizada pelo processo de diferenciação de estruturas

idênticas a embriões zigóticos mas resultante de diferenciação e multiplicação de células
somáticas. A sua germinação não depende de uma fase de “dessecação” como no caso dos
embriões zigóticos encerrados em sementes, sendo substituída por uma fase de conversão (uso de
meio MS sem reguladores para simples crescimento)

Algo que nos mostra logo a diferença entre embriões somáticos e embriões zigóticos é não termos
a diferenciação do endosperma e do tecido suspensor.

A nível do processo embrionário, temos a divisão desigual de

uma célula somática numa grande célula vacuolada e uma
com um citoplasma denso. A célula vacuolada acaba por
desaparecer por PCD.

E a partir daqui temos duas vias possíveis:

- Ou temos a divisão irregular e formação do complexo

proembrionário

- Ou temos a divisão altamente organizada e temos a formação do embrião somático

Ambas as vias resultam no embrião somático mas em intervalos de tempo diferentes e na mesma
cultura podemos ter os dois casos a ocorrer. No caso dos embriões somáticos da 1ª via, estes são
conhecidos por fazer divisão assíncrona resultando na presença de diferentes estágios
embrionários em cultura.

A nível de fases embrionárias…

O embrião somático exatamente pelas mesmas

fases que os embriões zigóticos mas simplesmente
não está fecundado. Temos do mesmo modo a
fase globular, a fase de coração ou torpedo e de
germinante ou plântula. Passado isto é converter
em meio sem reguladores e temos a regeneração da planta como se
fosse qualquer outra planta in vitro

Modelo hipotético de eventos celulares regulatórios que ocorrem na Embriogénese Somática

Para termos a formação de embriões

somáticos, as células com potencial têm de
passar por vários processos. Têm de ganhar
competência. Isto é feito com recurso a
auxinas e vamos ter reorganização celular e
alteração fisiológica. Depois disto, precisamos
de fazer com que a célula desdiferenciada
siga a via da ES. Again, por meio de nutrientes
e auxinas. Depois é a fase embriogénica com
atenção ao meio de cultura. As auxinas têm
um papel determinante na embriogénese
somática

Embriogenese direta e indireta

Da mesma maneira que na organogénese, podemos ter
a embriogénese direta ou indireta quando esta passa por
uma fase de calli. No entanto, temos de perceber que a
fase de calli serve apenas para induzir a competência
nas células do explante. Há células que têm
competência natural e por isso podemos induzir a ES
diretamente sem passar pela fase de calli

Vantagens e Desvantagens da Embriogénese Somática

No que trata aos processos de propagação in vitro usados, o da embriogénese somática é sem
dúvida o que tem mais vantagens pela questão de não poder existir a formação de quimeras
genéticas

As principais vantagens incluem a uniformidade genética e a diferenciação dos vários polos da

planta de uma só vez. A nível de produção, permite a produção em larga escala e permite uma
redução no tempo e manipulações aumentando a eficiência e a economização

Contudo, tem algumas desvantagens. Estas incluem que o processo é completamente

dependente do genótipo e do desenvolvimento do explante. Temos ainda uma questão
importante que é a do declínio da capacidade embriogénica das linhagens ao longo do tempo
(principalmente em espécies perenes como gimnospérmicas)

Apesar destas desvantagens…

A ES é importante no caso da propagação de plantas lenhosas que têm um ciclo de vida longo e
que são geralmente difíceis de propagar por métodos convencionais

Para além disso, como método de regeneração pode ter várias vantagens face à organogénese,
como a fiabilidade da origem de uma única célula (sem quimeras) e a possibilidade de
automação da produção de larga escala de embriões em biorreatores e plantação em campo
por uso de sementes sintéticas (explicado à frente).

Isto porque podemos usar o processo como processo de regeneração de plantas transformadas
(cuz no quimeras again) e pelo bypass da fase de enraizamento que é obrigatória na
organogénese.

Exemplo:

Fazer ES a partir de estames e análise da atividade de peroxidases durante a transição de calli

friáveis para calli embriogénico.

Neste caso queriam aproveitar os calli de culturas de células em

suspensão para fazer ES e com isso medir a atividade de
peroxidases. Algo engraçado é a formação de embriões
secundários a partir do embrião primário induzido

Outras aplicações incluem a produção de plantas triploides a

partir do uso do endosperma que resultam em frutos sementes, ou para produção de plantas
resultantes de fusão de protoplastos ou para termos culturas livres de vírus (cuz only one cell that
can be cryoperserved).
Fatores que controlam a Morfogénese in vitro (Organogénese e Embriogénese)

a) Posição e Competência do explante na planta dadora

Temos de ver que diferentes tecidos têm diferentes competências. Um entrenó da raiz terá menos
competência que um do meristema apical (competência difere cuz balanço hormonal difere)

- Tecidos meristemáticos, embrionários e reprodutores são mais capazes de crescer e sofrer

morofogénese -> tecidos menos recalcitrantes

- Tecidos retirados de diferentes órgãos sofrem nas mesmas condições diferentes processos
morogénicos (again o balanço hormonal que tem de ser adaptado). Explantes que não
conseguimos causar a competência são competentes, nós é que não sabemos o meio correto
para induzir isso.

Para além disso a capacidade de resposta ainda varia de célula para célula dentro do tecido. A
posição também é determinante. Por exemplo na organogénese colocar cotilédones (zona
petiolar) na posição abaxial deu melhores resultados

b) Efeito dos Fitoreguladores

Na maioria das plantas os fitoreguladores (Fr) têm um papel chave no controlo do tipo de resposta
na cultura in vitro. Tanto a organogénese como a ES são processos morfogénicos pelos Fr
regulados.

É preciso ter muita atenção na suplementação exógena pois tem de ser complementada com os
níveis internos de Fr do explante. Para além disso é preciso ter em conta a sequência de
suplementação. A ES trabalha muito à base de auxinas e a organogénese com o rácio Aux/Cyt

Tipos de hormonas e seus efeitos

Ácido Abscísico (ABA) -> O ABA está envolvido em processos de resposta ao stress,
desenvolvimento de sementes entre outros. Envolvido no fecho estomático,
abscisão e regulação de resistência. São a escolha predileta como antitranspirantes
na aclimatação.

Auxinas (IAA e IBA) -> Hormonas responsáveis pelo enlogamento celular in vivo entre
outros processos. Levam à organogénese de folhas, flores, órgãos florais e raízes
adventícias. Formam o tecido vascular e fazem a manutenção da identidade dos
meristemas SAM e RAM. São o trigger para diferenciação e formação dos primórdios
das raízes

Citocininas (BAP e Zeatina) -> Hormonas responsáveis pela divisão celular. Envolvidas
na germinação e no desenvolvimento de raízes e caules, senescência e ritmo
circadiano. São o trigger para o desenvolvimento de caules in vitro.

Giberilinas (GA3) -> Hormonas responsáveis pela elongação celular e

germinação. Envolvidas no desenvolvimento da semente, germinação,
floração e expansão foliar
Bons exemplos

No caso da organogénese de uma árvore medicinal (P. amurense), verificaram que a

indução de nódulos era quando tínhamos mais citocinina (BAP) do que auxina (IBA). A
nível do explante usado o hipocótilo e o cotilédone foram os melhores em numero de
meristemas adventícios
 c) Efeito das fontes e da concentração de azoto
Com estudos, verificou-se que níveis altos de azoto e redução de fontes deste (amónia
em vez de nitrato) são benéficos para a produção de meristemas caulinares
(organogénese) e acima de tudo de embriões somáticos (embriogénese somática)
A sequência de suplementação também tem a sua importância

Bons exemplos
No caso do crescimento in vitro de orquídeas, verificou-se que as diferentes
concentrações de azoto proporcionavam resultados diferentes. A concentração mais
baixa (7,5mM) induziu a formação de raízes e que a quantidade original do meio MS
impedia o processo por completo de crescimento.
Outro exemplo (2019) é o de plântulas de Brassicaceae, onde tentaram ver qual era a
melhor fonte de azoto para assimilação. E o descoberto foi que o nitrato era o mais
assimilado. Nesse caso face ao que disse anteriormente a amónia será melhor para induzir
morfogénese.
d) Efeito da tensão osmótica – Fonte de Carbono
Níveis osmóticos elevados beneficiam a produção de embriões e restrigem o seu
desenvolvimento assíncrono. -> importante para ES
Níveis baixos promovem a produção de raízes

e) Efeito do ambiente físico e das condições de cultura

No caso do efeito que o ambiente físico pode ter na morfogénese, isto é mais direcionado
para a fase inicial do processo de propagação, onde temos de ter em conta que as
condições fornecidas serão determinantes para o sucesso ou insucesso. Assim é preciso
ter em conta:
- Luminosidade (Fotoperíodo intensidade e qualidade em comprimento de onda) – Uso
de Leds pode provar-se mais eficiente.

- Temperatura (Normalmente a rondar os 22 a 26ºC) Na organogénese da cevada era

25ºC

- Formas e método de uso dos recipientes de cultura

Se é em recipientes sem agitação (placas de petri e tubos de
ensaio), ou se é agitada (em meio líquido).

Sendo assim temos de ter em conta também as condições do

processo e se este está a ser realizado em bioreator (explicado
mais à frente) e se há a possibilidade de trocas gasosas com
o exterior (selagem)

Mais uma vez refiro que a morfogénese compreende tanto os fatores para a
organogénese como para a Embriogénese Somática
Produção de Sementes Artificiais – O uso aplicado da Embriogénese Somática
Sementes Artificiais

As recentes descobertas na cultura in vitro têm vindo a auxiliar o ultrapassar de desafios

referentes à importância económica das plantas medicinais. Uma das maneiras em que
isto foi feito, foi com a combinação da tecnologia de micropropagação com a tecnologia
de encapsulação para desenvolver as sementes artificiais.

As sementes artificiais são no fundo embriões somáticos, meristemas vegetativos ou outros

propágulos encapsulados em alginatos que podem ser germinadas ou propagadas em
condições in vitro ou in vivo!

Os propágulos por exemplo podem ser usados como forma de transferir material vegetal
em laboratório ou para preservar germoplasma quando são dadas as condições
otimizadas de criopreservação

Um bom exemplo, é o da produção de sementes artificiais

de Tylophora indica para armazenamento e troca de
germoplasma. Neste caso usaram segmentos nodais e
fizeram o seu encapsulamento em alginatos com NaCl no
meio para obter a conformação esférica

As sementes artificiais são assépticas, são valiosas por terem uma camada protetora que
permite uma maior taxa de sucesso em campo e são mais duráveis no transporte e
armazenamento. Para além disto são razoavelmente baratas e permitem a preservação
da uniformidade genética de plantas (cuz sem quimeras cuz ES)

Os propágulos mais usados são por isso os embriões somáticos pelo seu alto nível de
reprodução.
Método de Produção de Sementes Artificiais

O processo de produção de sementes artificiais começa

pela fase de embriogénese somática. Neste caso, o
processo de embriogénese tem um extra a nível de
preocupação, que é a necessidade de sincronização do
desenvolvimento dos embriões.

Depois disso passamos à fase de encapsulação.

Os calli podem ser obtidos por meio sólido ou meio

líquido e são colocados em suspensão com os
próprios alginatos e precipitados para formar a
capsula em cloreto de cálcio

Teremos algum stress

mecânico no processo e
por isso é que podemos ter
outras vantagens
consoante o meio que
utilizamos.
Sementes Naturais vs Sementes Sintéticas
As sementes naturais apresentam uma camada protetora rígida, enquanto que as
sintéticas apenas possuem um cápsula. Claro que isto implica que a proteção nas
sementes naturais é maior, mas no entanto enquanto que nas sementes naturais temos
um período de dormência e dessecação, as sementes artificiais não o têm podendo ser
diretamente plantadas.

E o mais importante e o que vai ser a abertura do conceito de seed priming, é que apesar
das sementes naturais terem tecidos de reserva e as artificiais não os terem, nestas
podemos incorporar misturas químicas e misturas de nutrientes para que estas tenham
uma maior performance face às naturais.

Vantagens e Desvantagens
As vantagens das sementes artificiais resumem-se ao alto volume e escala do método de
propagação, a presença do estado genético uniformizado, a entrega direta dos
explantes ao campo e o custo diminuto por plântula que permite a rápida multiplicação
de plantas a custo mínimo pela ES – ótima na multiplicação
A tecnologia oferece tremendo potencial na conservação e propagação de
germoplasma mas implica ainda muita investigação para poder ser usada à escala
comercial.

Devido a isto temos algumas limitações como, a produção limitada de micropropágulos

viáveis, o desenvolvimento assíncrono da ES que pode levar a maturação imprópria
culminando em germinação e conversão ineficiente. Se calhar a indução da ES em meio
com níveis osmóticos elevados possa resolver este problema.

Exemplo de Comparação entre Métodos

Seed Priming – An overview
Como tinha dito anteriormente, uma das vantagens das sementes artificiais que pode ser
vista como uma desvantagem ao ínicio é a ausência de substâncias de reserva na
cápsula de alginatos. Contudo, isto pode ser a maior vantagem destas sementes!
As sementes são importantes por serem a base da alimentação. Tudo o que comemos
pode ser seguido até às sementes. São estas que dão origem às plantas que nós comemos
e que damos como ração aos animais que comemos.
Em biotecnologia vegetal olhamos para elas como sendo a próxima geração da planta.
São variáveis entre si e tentamos sempre ter boas sementes devido à cada vez maior
procura. Por isso, o mercado de produção de sementes vale cerca de 7 mil milhões de
dólares com a tendência em aumentar. Com tecnologias de sementes queremos
estabelecer plantas melhores, saudáveis e maximizando o seu potencial.
Tenta-se fazer isto por manipulação de dois processos. Upstream para o desenvolvimento
de sementes e Downstream para germinação das sementes. O Upstream resume-se a um
melhor entendimento a nível molecular dos genótipos existentes e fazer a caracterização
funcional dos genes que atuam nas várias fases do desenvolvimento
O Seed Priming acontece no processo Downstream e por
isso na germinação.

Em sentido estrito, a germinação começa com o Uptake

da água pela semente e termina com a emergência do
eixo embrionário. O seed priming é usado antes da
embebição controlada, que dá início à germinação, para
que haja a hidratação controlada com os compostos
úteis,
Caso do arroz

Por estudos anteriores, sabemos que o Se é um

nutriente importante e que o acido salicílico
como hormona auxilia na resposta ao stress
biótico. O que vamos fazer aqui é o priming
com estas duas substâncias e vemos logo
diferenças.

Temos 70% de germinação em vez de 50% e

com o priming aceleramos a germinação
para 8 dias em vez de 9 a 10, o que impulsiona
o lucro.

Temos claro que ter em conta o vigor (ou a qualidade das sementes) em conta claro.
Existem outros tipode priming como o bio-priming que recorre a incubação com
microrganismos do microbiota.

Depois disto temos a questão do revestimento que podem ser por

pellets, encrustante ou por filme. O caso dos filmes é o mais
importante porque ainda há a necessidade de encontrar filmes
que permitam um BioPriming eficiente. Tudo isto é feito para
garantir a qualidade das sementes de empresas delas produtoras.
Aula 10 – Cultura de Células Vegetais e Produção de Metabolitos
Como sabemos, à face da Terra as plantas são sem
dúvida os organismos mais versáteis a nível de
diversidade de metabolitos. Isto claro, advém do seu
estado séssil e por isso necessitarem de uma grande
capacidade de adaptação ao ambiente que as
rodeia.

Devido a isto, as plantas têm imensos metabolitos

secundários. Alguns destes, estão incluídos num
grupo artificialmente criado, as chrestomoléculas.

Estas são moléculas com interesse económico

significante, como por exemplo enzimas para o
processamento de alimentos ou agar para
gelificante e amido para espessantes.

O que podemos ver nesta tabela, é que muitos dos

compostos com interesse comercial têm a sua origem
em plantas!

Por que razão há tantos?

Eficientemente as plantas têm bastantes

metabolitos secundários, e isto deve-se à
panóplia de funções que estes têm:

- Podem ser pigmentos que auxiliem a dispersão

de sementes, ou fitoalexinas (substâncias
antimicrobianas) ou ainda fitoanticipinas
(presentes antes da infeção).

- Podem estar envolvidas na proteção contra os UV ou captadores de ROS. Ou sinalizadores entre

plantas e o seu microbiota. Podem providenciar estruturas para evapotranspiração (lenhina) ou
de proteção contra perda de água (cutina e suberina). Ou como reservas de nitrogénio entre
muitos outros

Metabolismo Secundário em plantas

Os metabolitos primários são absolutamente

necessários para o desenvolvimento e manutenção
celular e os secundários para “funções menos
essenciais”.

Os metabolitos primários é que dão os precursores do

metabolismo secundário. Aqui no esquema temos a
ativação de vias que nos dão os metabolitos
secundários e existem várias.

Via da lenhina, flavonas, antocianinas, cumarinas etc

Exemplos de metabolitos secundários com interesse

comercial
Alcalóides

Metabolitos secundários compostos principalmente por nitrogénio e muito usados

na medicina.

A morfina foi o primeiro a ser descoberto. Provém da papoila do ópio

e é usado como um analgésico. Outro muito conhecido é a cafeína.

Terpenóides

São metabolitos secundários formados por unidades isoprenos e existem em todas

as plantas. São o maior grupo de metabolitos secundários e são muito voláteis.

O taxol é um terpenóide usado no tratamento de cancros e é obtido por cultura

in vitro. Outro exemplo é a borracha (400 unidades isoprenóides).

Fenóis

Outro tipo de metabolitos secundários com grande impacto na saúde. O acido

salicílico é um fenol que existe nas plantas como hormona de resposta ao stress
biótico. É usada como analgésico, na cosmética. Outro fenol importante é a
lenhina (cmon todos sabemos esta xD)

Benzenóides

Benzenóides e outros fenilpropanoides constituem a maioria dos compostos

orgânicos voláteis em planta e especialmente na flor de petúnia.

Alguns estão envolvidos no aroma de frutas tropicais como o kiwi

Stilbenos e Flavonóides

Os stilbenos e flavonoides têm recebido frnde atenção comercial pelo seu papel
na saúde humana. O resveratrol de videira por exemplo, tem atividade antioxidante
e está presente em uvas e no vinho. Durante o ataque por patogéneos, é o
composto que mais acumula (Fitoalexina).

(A edição deste gene em outras plantas aumentou a resistência a fungos patogénicos)

Exemplo – Bago de Uva

Existem várias classes de fenóis, desde taninos

(sabor amargo), a flavonóis (amargo),
antocianinas, stilbenos, etc. Com estudos de
GC-MS é possível determinar os compostos
com base na sua volatilidade.

Realizado em estudo de progiling metabólico

em 3 variedades portuguesas de videira

Funcionamento do GC-MS para efeitos de

Metabolómica
Uma técnica que combina a cromatografia gasosa e a espetrometria de
massa. Há outras plataformas como por exemplo a NMR. Mas o GC-MS é
mais sensível, apenas não permitindo a elucidação da estrutura dos
metabolitos. Também pode ser usado em aplicações mais comerciais
como a alimentar e agricultura.

Esta técnica combina duas estratégias, a cromatografia

gasosa (GC) que separa os componentes, e a
espetrometria e massa (MS) que caracteriza cada um
desses componentes. A nível técnico:

A GC usa uma coluna caplar que depende das dimensões

e fases dos compostos. Passando pela coluna, os
compostos são detetados pela MS e por ela ionizada. A MS
faz isto ao quebrar cada molécula em fragmentos
ionizados e depois deteta-os usando um rácio
massa/carga elétrica.

Os fragmentos acabam por sair com tempos de retenção

diferentes e a análise dos fragmentos por PC será feita com
bases em bibliotecas de fragmentos.

A fonte de iões atira eletrões à fuça das moléculas e o filtro vai

filtrar os iões usados por massa.

Após isso, o detetor conta o nº de iões

com massa específica e envia a
informação a um computador para fazer
um espetro de massa. Este será um
gráfico (cromatograma)

Complexidade de metabolitos secundários – A Solução

Devido à complexidade inerente dos metabolitos secundários, não se torna

eficiente ou rentável produzi-los por síntese química nem por extração da
planta em si. E temos ainda um problema recorrente que será o do aumento
da demanda destes compostos.

Compostos de metabolitos secundários anticancerígenos em uso

Vincristina e Vinblastina. São obtidos de C. roseus e são muito usados no

combate à leucemia e tratamento do linfoma de Hodgkins.

Taxol. Este compostos é muito usado no tratamento de cancros, mas tem um

baixo rendimento e não conseguimos produzir o necessário (3 árvores
equivalem a 1g e são necessários kilos de produto).

E assim entramos na solução para aumento de escala – Cultura in vitro

Como podemos aproveitar a cultura in vitro? Recorrendo a biorreatores, com celulas em
suspensão. A vantagem está na produção mais controlada e com menos impacto no ecossistema
e sem necessidade de pesticidas ou herbicidas porque estamos a trabalhar em assepsia e temos
maior aumento de escala com produção em grande quantidade de que antes.

O caso típico é o do Taxol. Este foi considerado um passo importante na cultura de celulas, pois
com a produção do composto em biorreatores de 75m3, conseguimos valores na ordem dos
500Kg por ano. Muito melhor face aos valores de 1g por cada 3 árvores.

Vantagens potenciais da produção in vitro

Temos as condições ambientais controladas (sem implicações externas :3), podemos manusear o
material facilmente e com isto podemos ter um maior controlo no volume de produção e na
redução do espaço de produção,

Poderemos ter maior rendimento e melhor qualidade do produto (tirando os subprodutos ou

contaminantes) e facilmente podemos recuperar/seprar/purificar os produtos. É uma boa
alternativa à produção cara de
compostos por síntese química.

Temos uma separação claro

entra fase de crescimento e
fase de reprodução e a
libertação de terrenos para
outros tipos de cultivo, Para
além disso a cultura in vitro
pode ainda possibilitar o
reconhecimento de novos
compostos, a descoberta de
novas vias e a possibilidade de
biotransformação de substratos
naturais e sintéticos.

Exemplos práticos mostram que estas vantagens são reais, com um valor muito
maior em cultura do que em cultivo da planta.

Produção de células em suspensão

Com explantes, vamos induzir a desdiferenciação de celulas para obter

calli. Estes continuam a proliferar e depois fazemos a sua transferência para
Erlenmeyers com agitação. Queremos ao máximo evitar agregados de calli
e por isso temos de optar por estratégias de o evitar para ser fácil fazer a
separação da suspensão:

- Usando calli friável, ou seja, transferimos os calli para meio liquido com
agitação e aproveitamos a friabilidade do calli para que este se quebre.

- Usar calli não friável, ou seja, transferência para meio liquido com agitação e subculturas
sucessivas até termos a friabilidade desejada

- Usar enzimas, ou seja, adicionar celulases e pectinases até obtermos uma suspensão autêntica.

Com o aumentar da cultura in vitro podemos ter acumulação de células com variação
somaclonal que pode levar a diminuição ou inviabilidade de produção do produto de interesse.
Isto significa que não podemos estar sempre a usar a mesma cultura over and over. Assim sendo,
usamos algo semelhante ao que se usa na organogénese -> células cambiais meristemáticas
Ao fim de 5 dias começamos a observar divisões e usamos as celulas nas nossa culturas por terem
vacúolos pequenos e serem fisiologicamente e morfologicamente mais estáveis sendo facilmente
criopreservadas

Para cultura de celulas em suspensão faz a diferença se a célula veio de um processo de

desdiferenciação (explante) ou se já estava previamente indiferenciada (cambial). Estas são
naturalmente meristemáticas e com elas conseguimos melhores produções. De início as cels de
suspensão vinham de cels desdiferenciadas e depois então começaram a usar cels nunca antes
diferenciadas

Assim sendo, as células cambiais podem ser usadas para biotransformação e estes estudo podem
revelar potencial de produção de:

- Produção de novos químicos; químicos conhecidos mas de forma mais económica

- Investigação do destino metabólico de xenobóticos e elucidar vias metabólicas.

Exemplo

Em 2019, investigadores tentaram fazer biotransformação com celulas cambiais meristemáticas

em cultura em meio liquido. Foram colocando substratos, até que as metilcumarinas fossem
transformadas e com isso existisse um aumento da diversidade. Podemos então usar isto para
analisar reações bioquímicas de biotransformação em celulas vegetais.

No fundo fizeram bioconversão com substratos exógenos.

Crescimento de células em Suspensão (Cinética all over again as per usual -_-)

O crescimento de células vegetais em suspensão, segue o modelo típico do quimiostato em

sistema fechado. Inicialmente procedemos à inoculação das celulas vegetais e temos uma fase
inicial sem crescimento (lag phase).

Após a adaptação das celulas, temos uma fase de crescimento exponencial com aumento de
biomassa e produção constante de
metabolitos primários para auxiliar o
crescimento. Quando esta termina (8 a 12
dias), entramos na fase mais importante, fase
estacionária, onde teremos a maior produção
de metabolitos secundários. O objetivo será
manter a cultura nesta fase, mas tal como
todas as culturas, eventualmente teremos a
fase de declínio com a morte celular

Características de linhas celulares para cultura de celulas em suspensão

Altamente freáveis (quebram facilmente em pedaços isolados), homogéneas e isodiamétricas. O

seu conteúdo interno é maioritariamente citoplasmático, com boa distinção entre núcleos e
presença de grãos de amido de grandes dimensões.
A citodiferenciação destas é limitada (alguns pigmentos mas pouco mais que isso).

Têm uma taxa de crescimento elevada (divisões a cada 24-72h) e sem capacidade regenerativa
aparente. São auxotróficas para vários metabolitos comuns e são facilmente convertíveis à
independência de hormonas. O crescimento é promovido por aumento da concentração de
CO2, mas são bastante sensíveis a etileno. Se forem feitas culturas sucessivas por demasiado
tempo, as celulas começam a acumular alterações que podem levar a níveis de ploidia anormal
e mesmo aneuploidia (normalmente ao fim de 3 anos)

4Otimizar a produção usando cultura de celulas em suspensão

Na produção in vitro deste tipo de células vários fatores influenciam o resultado final, sendo que a
produção depende essencialmente de:

- Do genótipo original, da linha de celulas selecionadas (diferentes tecidos diferentes

características)

- Do meio de cultura e sua manipulação (Fitoreguladores; nutrientes, elicitadores e substratos

específicos)

- Da fase de acumulação do produto (ter em conta os sistemas de feedback), do grau de

diferenciação das células (celulas/tecidular), do tipo de bioreator empregue (Agitação
mecânica, Air-Lift, etc) e claramente do tipo de bioreação (contínuo, descontínuo, com
alimentação escalonada, com perfusão)

Elicitação e Elicitadores – Uma forma de induzir a produção

O nosso objetivo com a Elicitação é aumentar a

produção de certos compostos de interesse.

Neste caso ao lado, estavam a usar calli desta planta

para produzir triterpernóides. E o que verificaram foi, com
o aumento dos níveis de metiljasmonato (MeJA), a
produção do composto de interesse era muito maior.

Isto ocorre, pois certos metabolitos secundários são

acumulados nas plantas após a infeção por microrganismos. É uma estratégia de sobrevivência
da planta. O que estamos a fazer aqui no fundo é enganar as celulas para que produzam mais
do compostos de interesse ao fazê-las “pensar” que estão a ser atacadas.

Assim sendo, surgem os Elicitadores, compostos libertados por patogéneos ou partes das paredes
celulares de patogéneos que podem gerar uma resposta similar à acima descrita. Todo o processo
de indução dessa resposta foi então chamado de Elicitação

O caso típico é o do uso de Elicitadores para produção de fitoalexinas. Neste caso o elicitador é
reconhecido, há síntese de enzimas por parte das celulas vegetais e a produção de fitoalexinas.

Existe todo um range de Elicitadores:

- Abióticos  Físico - UV, stress osmótico, salinidade, seca e calor; Quimicos – Metais pesados
toxinas e hormonas

- Bióticos  Polissacáridos, extrato de leveduras, fúngicos e os bacterianos

Os mais comuns são a nível de hormonas ou compostos produzidos por patogéneos

Uso eficiente de elicitadores “Os elicitadores apenas estão presentes em certas fases do processo
e não durante o processo inteiro”

O uso eficiente de elicitadores para produção de compostos depende essencialmente:

- A especificidade do elicitador, da sua concentração, da duração de contacto;

- Do elicitador da linha celular, do tempo de Elicitação e ao nível da cultura, do seu estágio de

crescimento e da regulação do crescimento e composição de nutrientes.

Nesta tabela temos alguns exemplos de culturas de celulas em suspensão, do seu elicitador e do
produto.

O que vemos geralmente é o uso de compostos de

patogéneos, nomeadamente fungos, e hormonas como o
ácido jasmónico para a produção de vários compostos.

O que é de notar é o claro aumento da produção de

produtos em condições com Elicitação face a condições
de controlo, verificando a eficiência do uso de elicitadores
em culturas de celulas vegetais em suspensão

Exemplo do uso de Elicitação

Em 2008, investigadores quiseram perceber o efeito do uso

da Elicitação em culturas de celulas em suspensão de
videiras Monastrell para a produção de resveratrol.

O que verificaram foi que com a adição de

metiljasmonato e ciclodextrina (ocorrem naturalmente e
são derivados do amido), estas tinham um efeito
sinergístico na acumulação do resveratrol nas celulas de
videira

Otimizar o processo de obtenção de culturas viáveis para produção

Começamos com a amostragem de plantas selvagens ou

cultivadas. Nestas procuramos as plantas consideradas
hiperprodutoras, Fazemos a indução de calli (calli primário) e
fazemos a sua seleção clonal e screening em função da
estabilidade.

Obtemos as linhagens hiperprodutoras estabilizadas e com a

otimização das condições de produção, obtemos as linhagens em
condições ótimas para fazer o scalling-up para cultura maciça em
Biorreatores

Exemplos

Graças a estes avanços, hoje em dia temos a produção de compostos em larga escala incluindo
ácido rosmarínico (42L de meio, em duas fases e produção de 100g/14dias), como xiconina e
outros compostos.

O exemplo nato é o do taxol. Este é um dos composto da casca de uma árvore

pequena. E sendo difícil sintetizar quimicamente devido aos 10 estereocentros, as
populações naturais também não são opção devido à procura de mercado.
Solução? Cultura de células para produzir taxol em maior quantidade tornando-
se um processo viável de produção
Chocolate a partir de cultura de células em suspensão de cacao.
Investigadores fizeram a indução de calli da planta de cacao, e
colocaram a crescer em erlenmeyer. Liofilização das células e
temos chocolate. O conteúdo deste até é maior em polifenois
que os grãos naturais. Os alcaloides foram reduzidos (amargo) e
tinham aumento em alguns aminoácidos

Biorreatores para produção de metabolitos secundários em plantas

Bioreator

O bioreator que temos aqui é muito usado na cultura de

leveduras por exemplo. Nesse caso específico é útil,
exatamente porque as leveduras não possuem vacúolos de
grandes dimensões e uma parede com dinâmica diferente.

No caso de cultura de células vegetais, o processo fica

dificultado devido às questões do vacúolo e parede celular
celulósica. Esta questão torna as celulas vegetais mais sensíveis
a stress mecânico, e por isso manter friabilidade, otimização e
produção é complicado com este tipo de bioreator.

Apesar destas dificuldades, a cultura de células vegetais em

bioreator continua a ser um processo predileto na produção de compostos bioativos. É um método
que surge como alternativa à coleção de exemplares selvagens ou cultivo e é útil e vantajoso:

- Pois contribui para a preservação da biodiversidade global e alivia questões ecológicas e ao

mesmo tempo inclui a produção controlada de acordo com a procura e uma redução na mão-
de-obra.

Mas claro, não podemos simplesmente pensar no melhor sem falar no que as dificuldades causam
verdadeiramente ao processo inteiro:

- Como foi dito anteriormente os sistemas de agitação são um problema e mesmo as condições
de esterilização podem afetar negativamente o processo

- Para além disto temos a questão da atmosfera gasosa, suprimento de O2, trocas de CO2, pH,
minerais, hidratos de carbono, reguladores de crescimento, o meio líquido e a densidade celular.

Devido a esta enormidade de fatores que podem influenciar a cultura de celulas vegetais em
suspensão, apenas alguns tipos de biorreatores podem funcionar. Alguns casos até foram de
sucesso mediante a alteração ao nível do sistema de arejamento e do fornecimento de nutrientes.

E são estes casos de sucesso que levam a que a cultura de celulas vegetais em suspensão continue
a ser largamente usada para a produção de metabolitos secundários com interesse comercial
Alguns exemplos de biorreatores e suas vantagens globais

Biorreatores de bancada – Muito usados em laboratório no processo de

otimização das culturas e para verificação de qualidade e estado da
cultura.

Minibiorreator para micropropagação, Consegue fazer a produção in vitro

de plantas a baixo custo e mão-de-obra.

Exemplo - Vantagens do reator face à cultura em agar

O uso de biorreatores aumenta a produtividade e eficiência

da propagação de plantas.

Neste caso, usamos um bioreator de 20L e cultura de agar

em 500mL. Temos uma vantagem a nível do tempo
operacional e ao nível de uso de lâmpadas fluorescentes, o
que se traduz em economização.

Podemos obter um grande número de plantas num espaço limitado. Estamos a estimular o
contacto com os nutrientes através dos reatores e fornecemos condições ótimas de arejamento
para otimizar o processo. Temos a perda de dominância apical por isso temos mais plantas.

Outra coisa que facilita o aumento do nº de plantas é o fornecimento de O2 direto que aumenta
a biomassa final.

O lado complicado deste método é que temos meio líquido e por isso podemos ter excesso de
água que leva a uma aclimatação mais complexa (uso de antitranspirantes). Também torna as
plantas mais propensas a serem infetadas. E ainda o problema das espécies recalcitrantes que
para propagar em reator é quase impossível

Mas fique claro que geralmente as plataformas de microprogaçao industrial funcionam bem!

Três casos específicos de culturas de células vegetais e produção de metabolitos

Imobilização de Células

Como o nome sugere, com este método conseguimos reter um biocatalisador

(celulas vegetais ou enzimas) mas mantendo a capacidade de produzir
determinado produto em gel ou matriz sólida, o que permite estabilizar possíveis
enzimas com uso em produção industrial (objetivo inicial deste método).

A partir de meio líquido após indução de calli ou com protoplasto,

conseguimos ter as células em matriz estavelmente. Quando funciona é
altamente rentável. Damos o substrato e elas produzem o composto.

Relativamente a biorreatores tem vantagens, ao manter as celulas

viáveis durante mais tempo, pois não há stress mecânico e uma maior
densidade de celulas.

Desvantagens -> A biomassa tem de ser cultivada em suspensão, a excreção para o exterior é
imperativa e podemos ter problemas na integridade dos produtos excretados e na dificuldade
adicional de difundir oxigénio e nutrientes na matriz sólida.
Método das “Hairy Roots”

Estas são geradas após infeção de raízes de plantas por

Agrobacterium rhizogenes pelo mesmo modo que A.
Tumefaciens com o T-DNA mas desta vez no plasmídeo Ri

Podemos então dizer que A. rhizogenes causa a doença das

hairy roots.

Temos inoculação do explante com a bactéria. Consegue

causar a formação de raízes nesse explante (folha por
exemplo). E o que resulta é uma proliferação massiva de raízes
que adotam um formato “cabeludo”. Podemos depois
transferir para bioreator com agitação e podemos fazer
produção de metabolitos secundários. Até podemos elicitar a
cultura.

A vantagem é que as raízes se formam sem qualquer auxílio de hormonas ou reguladores de

crescimento, o que reduz bastante o custo do meio de cultura. Por esta razão as raízes são
mantidas em meios de propagação sem hormonas e acabam por ter mais estabilidade genética
que as culturas normais de células em suspensão. Principalmente porque evitamos a formação de
calli.

Mas claro, têm desvantagens. Podem ter crescimentos exagerados e tremendos, compactando
bastante e causando problemas na distribuição do oxigénio pela cultura. E normalmente está
limitada à produção de produtos que tenham origem em raízes de plantas

Exemplo da soja

Investigadores quiseram perceber se era possível produzir soja in vitro

usando hairy roots.

Os resultados foram positivos, visto que inocularam cotilédones em

meios com a bactéria com diferentes construções do plasmídeo (GUS,
Cherry e GFP). E conseguiram verificar que realmente havia a
formação de várias raízes e todas elas a expressar a construção
colocada.

Noutro estudo (2007) também com soja, quiseram fazer este tipo de
transformação mas com GUS e para fazer o estudo fundamental das raízes
da planta, o que comprova uma possibilidade adicional de aplicação para
este método.

Alguns exemplos de produção de metabolitos com base no método de hairy roots

Na tabela seguinte temos informação de alguns compostos

produzidos por este método de cultura de celulas vegetais.
São exemplos o taxol com a sua atividade anticancerígena
ou betalainas com a sua atividade antioxidante ou ainda as
antemisininas com a sua atividade antimalária.

A maioria dos compostos produzidos são compostos com

atividade relevante na saúde, exatamente por serem
necessários em grandes quantidades e não se conseguir
fazer síntese eficiente e rentável por outros métodos.
Molecular Pharming ou Molecular Farming

O conceito surge em 1989, com o aparecimento do artigo impulsionador em 1989 na capa da

Nature. Esse artigo refere a produção de anticorpos de rato em plantas transgénicas de tabaco e
no fundo o molecular farming resume-se a isto.

O objetivo é usar plantas para produzir vários compostos, como por exemplo produzir anticorpos
mesmo ou compostos para a alimentação. Podemos dizer que se trata da produção de proteínas
recombinantes em plantas à larga escala em plantas

Isto implica usar as plantas como sendo o sistema de expressão de proteínas recombinantes. E
como sistemas de expressão as plantas têm inúmeras vantagens face a outros sistemas:

Têm benefícios económicos, por serem mais económicas que sistemas de biorreatores e
fermentadores. O impacto da contaminação com patogéneos é reduzido face a se acontecesse
noutros sistemas. Comparativamente têm altos rendimentos, ao nível da escala industrial.

Têm ainda a vantagem ao nível biológico, pois existem menos diferenças a nível de PTMs entre
animais e plantas, pela purificação poder ser eliminada se o tecido usado for comestível e
podemos armazenar proteínas recombinantes em organitos mais estáveis como os cloroplastos

Assim sendo, um dos fatores importantes é a escolha da cultivar a usar como sistema de expressão.
Variáveis importantes incluem:

. Custo do sistema de produção, custo do processamento, valor comercial do produto, o tamanho

do mercado e as aplicações que se pretende. No fundo são variáveis empresariais sobretudo.

Exemplo

Produção de vacina com plantas transgénicas para a COVID-19 pela empresa Medicago.

Neste caso o uso de plantas de tabaco é o preferível. As células

de tabaco BY são particularmente apelativas devido à sua taxa
de crescimento altíssima e devido à facilidade de
transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Aprofundando um pouco mais este tópico do Molecular Farming

No molecular farming queremos usar sistemas vegetais para produzir

compostos de alto rendimento. Um dos tipos de sistemas vegetais são
os heterólogos que implicam o uso de sistemas vegetais como se
fossem biorreatores para a produção de compostos de outros
organismos (recorrendo a edição génica claro).

O próprio mercado de proteínas recombinantes está a aumentar e em 2022 pensa-se que atinja
os 2,8 mil milhões de dólares.

Um dos grandes desafios atuais para além de todas as questões comerciais acima descritas passa
pelo conceito de plantas imunizadas. No caso da produção de farmacêuticos, os glicanos
específicos de plantas podem causar problemas. Portanto um dos progresso com mais interesse é
o de humanizar as plantas nos padroes de glicosilação humana.

Pode-se fazer ao manter-se as proteinas no ER (similar a humanos), modificar a maquinaria do

Golgi por knockout de genes e adição de novas glicotransferases para proceder a uma
modificação correta.
Um bom exemplo do molecular farming é o da empresa Protalix de Israel. Eles
com celulas de cenoura em suspensão usam o sistema Porcelex com
tubos que fazem a renovação contínua. Uma das suas produções e
glucocerebrosidase, uma enzima essencial do corpo humano e que pode
ser sintetizada em cultura em suspensão. Têm acordo com a Pfiser

Aqui temos exemplos de

recipientes e métodos para
podermos fazer um molecular
farming eficiente ^^