UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E
BIOLOGIA MOLECULAR

Obtenção de plantas transgênicas

Maximiller Dal-Bianco Lamas Costa

Definição

É a introdução controlada de ácidos

nucléicos em um genoma receptor,
excluindo-se a introdução por
fecundação
A importância do uso de plantas
transformadas geneticamente
Usos da Transformação de Plantas

• A. Testar a função de genes ou partes de genes

• B. Modificar a expressão de genes endógenos

• Desligar genes
• Aumentar a expressão
• Modificar a expressão

• C. Mover genes entre organismos.

 Aplicações
• Resistência a insetos:
• uso de inibidores de proteinases,
• toxinas bacterianas (gene Bt )-Milho, algodão, batata e soja

• Tolerância a herbicidas:
• Soja Roundup Ready ,
• Milho, Cana-de-açúcar e Eucalipto
• Resistência a vírus:
• os gene da capa protéica ou capsídeo do próprio vírus foi
introduzido na planta, funcionando assim como uma espécie
de "vacina".
• Alteração de coloração de flores:
• envolvidos de rotas bioquímicas
• Alteração da qualidade nutricional:
• Empresa Calgene obteve óleos ricos e ácido esteárico, um
ácido graxo saturado,
• arroz que produz beta- caroteno, precursor de vitamina

• Produção de vacinas:
• Batata, tabaco, banana e alface.
• PLANTICORPOS - Cuba
Visão global de transformações de plantas

http://www.ag.ndsu.edu/pubs/plantsci/crops/a1219-2.gif
A.L. Rivera et al. / Physics of Life Reviews 9 (2012) 308–345
 Possíveis Impactos no Meio
Ambiente
 Poluição genética ou contaminação gênica de
espécies silvestres
 Fluxo gênico: transgene  população silvestre
 Cultivos próximos de parentes silvestres 
Cevada, alface, arroz, aveia, batata, sorgo e
trigo
• Reações alérgicas ou de hipersensibilidade
• Reações de intolerância – alterações
fisiológicas, como reações metabólicas
anormais e toxicidade
 Etapas da Produção de Plantas
Transgênicas
- Identificação e isolamento do gene;
- transferência do gene;
- seleção das células que contenham o gene transferido;
- regeneração de plantas;
- expressão do gene nas plantas adultas.
Transient expression, as its name suggests, usually lasts for a
few days only, but occupies a useful niche in such areas as development of
transformation methodology or metabolic studies, since it allows the effects of
experimental manipulations to be seen in a short time

Stable transformation, on the other hand, is often a time-consuming process involving

tissue culture techniques that facilitate the growth of whole plants from treated cells or
tissue explants (3). As a result of stable transformation the introduced DNA is
integrated into the host cell DNA and is thereby eligible to be passed on to succeeding
generations
 Isolamento de genes

• Busca de genes de
interesse em bancos
de dados;
• Construção de
primers e
amplificação por
PCR;
• Quantificação e
sequenciamento.

TGTGAACACACGTGTGGATTGG...
Int. J. Dev. Biol. 57: 483-494 (2013)
Estratégias mais utilizadas de transferência de
DNA para plantas

Vetor biológico:
•Agrobacterium (uma bactéria do solo com duas espécies
importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes)
•Vetores virais: O CaMV permite inserções de no máximo 0.8
Kb. POUCO USADO

Transferência direta:
De protoplastos - A membrana celular é permeabilizada por choques
eléctricos ou agentes permeabilizantes (como o polietilenoglicol) –
eletroporação

Plantas intactas - Bombardeamento com micropartículas, de ouro ou

tungstênio (com cerca de 1 μm de diâmetro)
 Transformação via vetor natural
• Agrobacterium tumefaciens
rhizogenes

Transferência natural
de DNA para plantas
Agente causador da calose (tumor) em
plantas
Plasmídio Ti
http://www.nature.com/nature/journal/v433/n7026/images/433583a-f2.2.jpg
 Representação esquemática da interação Agrobacterium-planta

1) injuriada e liberação de compostos fenólicos pela célula vegetal; 2) ligação de Agrobacterium à superfície da célula, mediada por
proteínas bacterianas e vegetais; 3) interação de composto fenólico com a proteína VirA; 4) fosforilação da proteína VirG; 5) ativação da
transcrição dos genes de virulência (genes vir); 6) formação da fita-T, ligada à proteína VirD2; 7) produção da proteína VirE2; 8) organização
do complexo-T (fita-T, VirD2 e VirE2); 9) transferência do complexo-T para a célula vegetal; 10) entrada do complexo-T no núcleo celular; 11)
integração do T-DNA ao genoma celular. (modificado de Sheng & Citovsky,1996).
AGROBACTERIUM - Desvantagens

Genótipo-específico (planta - bactéria)

Monocot X Dicot

Dependência do sistema de
regeneração
Agroinfiltração
Mergulha floral em Arabidopsis

Zhang et al.,Nature Protocols 1, 641 - 646 (2006)

MÉTODOS DIRETOS DE
TRANSFORMAÇÃO
Dois grupos:
• aqueles que se utilizam de células desprovidas de
parede celular (protoplastos)
• e aqueles que possibilitam a transformação de
células intactas ou tecidos.

Em ambos métodos, o gene de interesse juntamente com o marcador

seletivo e/ou repórter são transferidos como constituintes de um pequeno
plasmídio de E. coli.
Obtenção de protoplastos

Um protoplasto é uma célula "nua": perdeu a parede, mantém a membrana e adquire

aspecto circular. A perda da parede celular é conseguida pelo uso de enzimas capazes
de a degradar (ex.: celulase).
MICROINJEÇÃO
Biobalística

Micro partículas de ouro

Equipamento
Processo
Vantagens
Diversos protocolos de cultura de tecidos
Não exige vetores especializados
Transformação de organelas
Rapidez e simplicidade

Desvantagens
Equipamento especializado
Integração múltipla de transgenes
Variabilidade do processo
Int. J. Dev. Biol. 57: 483-494 (2013)
 Genes de seleção de transformantes
 
Genes marcadores para resistência a antibiótico.
Os mais utilizados são:
•Gene neo: isolado do traposon Tn5 de Escherichia Coli, codifica para
a enzima neomicina fosfotransferase II (NPT II). Resistência a canamicina
•Gene hpt: codifica para a enzima higromicina fosfotransferase (HPT) foi isolado
de Escherichia coli e confere resistência ao antibiótico higromicina.

Resistência a algum herbicida.

Os mais utilizados são:
•Gene csrl: codifica para uma forma alterada da enzima sintase do ácido acetohidroxil
(AHAS), também conhecida como acetato sintase (ALS).
•Gene aroA: foi isolado de Salmonela tyhimurium tratada com mutagênico e seleciona
para a resistência ao herbicida glifosato.
•Gene bar: clonado de Streptomyces hygroscopicus, codifica para a enzima fosfinotrici
acetiltransferase (PAT), que inativa o herbicida fosfinonotricina (PPT).
GENES REPÓRTERES
• genes nos e ocs: foram isolados do T-DNA de Agrobactérium e codificam para a
síntese da neopalina (NOS) e para a síntese de octopina (OCS), respectivamente.
• Gene lacZ: foi isolado de Eschirichia coli e codifica para a B-galactosidase, más é
pouca usado em plantas porque estas possuem uma alta atividade endógena de B-
galactosidase, de difícil quantificação.
• Gene cat: codifica a enzima clorafenicol acetiltransferase (CAT), que não é
encontrada normalmente em plantas. Bastante usado em plantas, apesar da
utilização de radioatividade.
• Gene neo: O NPT II usado também como gene marcador de seleção.
• Gene luc: codifica para luciferase de Photinus pyralis e tem sido usado como gene
repórter em plantas.
• Gene uidA: este gene foi isolado de Escherichia coli e é o gene repórter mais
utilizado atualmente. Ele codifica para a B-glucuronidase GUS.
• Gene gfp: foi isolado de Aequorea victória (medusa) e codifica para a ‘grenn
fluorescent protein’ (GFP).
Epicótilo alongado cocultura

Formação pró-gemas Multiformação de Multibrotação

pró-gemas
Gene uidA
 Principais ensaios moleculares de
caracterização de plantas transgênicas
PCR- Método mais simples e rápido. Pode apresentar problemas
com falsos positivos.

Southern Blot- Confirma a inserção do T-DNA no DNA genômico do

organismo alvo, como também o número de cópias inseridas.

Northern Blot- Confirma a acumulação do transcrito de RNA do

transgene de interesse.

Western Blot- Confirma a presença da proteína produzida pelo

transgene de interesse inserido.

qRT-PCR- Provê o nível de expressão relativa do gene do transgene

de interesse.
Tipos de transgênicos
Primeira geração – Características
agronômicas

• São aqueles que já existem no mercado mundial, obtidos com

o objetivo de melhorar características agronômicas como a
resistência a insetos e doenças e a tolerância a herbicidas.
Estes produtos, na maioria dos casos trazem muitos benefícios
ao produtor, como por exemplo:
• aumento de produtividade;
• diminuição de custos de produção, por meio da redução do
uso de defensivos agrícolas e combustível;
• melhoria da qualidade do produto final, com menores
índices de fungos e micotoxinas;
 Segunda geração – Qualidade
alimentar

• São aqueles que já estão sendo pesquisados e incluem os

alimentos com maior qualidade (maior teor de nutrientes por
exemplo) e que trazem benefícios também ao consumidor, tais
como:
• Alimentos com maior teor de proteínas e minerais (como o ferro);
• Óleos com teores mais elevados de ácidos graxos do tipo ômega 3
(mais saudáveis).
 Terceira geração – Produtos especiais

• Ainda em fase de desenvolvimento, são os produtos

de utilização farmacêutica (vacinas, hormônios,
proteínas humanas, biorretores) e industrial (plásticos
biodegradáveis e lubrificantes).
Alguns exemplos de plantas
geneticamente modificadas
- Tomate longa vida Flavr Savr, produzido pela companhia
norte-americana Calgene, com o objetivo de obter frutos
com maior conservação. Este tomate transgênico foi o
primeiro produto liberado comercialmente para consumo
nos Estados Unidos, em 1994.
- Tomate com maior teor de licopeno, pigmento que dá a cor
avermelhada ao fruto, é uma substancia antioxidante, que
atua no organismo contra vários tipos câncer.
• Arroz dourado, contendo alta concentração de pró-
vitamina A.
• A proeza, realizada por pesquisadores da Suíça e
Alemanha, foi possível pela introdução de três genes
envolvidos na síntese de beta-caroteno (pigmento
vegetal), encontrados em uma flor (o narciso-dos-
prados), em plantas de arroz.
• Arroz contendo maior concentração de ferro nos
grãos, para uso na alimentação humana e animal.
• Soja Roundup Ready (RR) da
Monsanto, resistente ao herbicida
glifosato. Esta soja traz benefícios
ao produtor, pois reduz a aplicação
de herbicidas e mão-de-obra,
elimina as plantas competidoras,
resultando num aumento de
produtividade.
• Milho e algodão Bt, resistentes a insetos (certo tipo de
lagarta). Estas plantas contém um gene proveniente da bactéria
Bacillus thuringiensis, muito comum na natureza, e há muitas
décadas usada como inseticida natural, principalmente na
agricultura orgânica. Os principais benefícios ao agricultor são
a redução do uso de inseticidas, o aumento da produtividade e a
qualidade do produto final.
 Tomate transgênico com altas doses de antioxidantes protegem contra o câncer

• Tomate com mais

licopeno,
• Vacinas,
 Produtos em desenvolvimento
• Quanto aos produtos que estão sendo pesquisados e desenvolvidos no Brasil, ainda
em caráter experimental, tem-se:

• milho com maior teor de metionina no grão (EMBRAPA);

• melão com maior potencial de conservação (UFPEL);
• feijão resistente ao vírus do mosaico dourado (EMBRAPA/CENARGEN);
• laranja resistente ao cancro cítrico (IAPAR);
• batata resistente ao vírus do mosaico PVY (EMBRAPA Hortaliças, CENARGEN e
UFPEL);
• soja brasileira resistente ao herbicida glifosato (Roundup) (EMBRAPA Trigo);
• mamão resistente ao vírus da mancha anelar (EMBRAPA/CENARGEN), o qual foi
recentemente liberado pelo Ministério do meio Ambiente para avaliação a
campo.
Produtos produzidos em plantas
Nem tudo são Flores.....
http://www.ambientebrasil.com.br/
composer.php3?base=./biotecnologia/
index.html&conteudo=./biotecnologia/artigos/
royal.html
Onde está a prova de que os alimentos transgênicos são,
por natureza, inseguros?, pergunta a Royal Society

http://www.ambientebrasil.com.br/
composer.php3?base=./biotecnologia/
index.html&conteudo=./biotecnologia/
artigos/sementes.html
Relatório britânico condena as sementes
transgênicas
 Limitações

• Silenciamento de genes
• Especificidade de promotores
• Número de cópias
• Efeito posicional
• Presença de genes marcadores
• Diferenças entre espécies/genótipos
Silencing of Transgene Expression

Transgenes that are initially expressed in the primary transformants may be subject to
silencing during plant development or in subsequent generations

Induction of silencing can occur in cis, i.e. by processes at the transgene locus, or in trans
by mechanistic pathways that require the presence of sequences with homology to the
transgene locus

Although silencing of transgenes is more frequently observed in plants carrying multiple

transgene copies, there are reports of transgene silencing in single-copy transformants
(e.g. Elmayan and Vaucheret 1996; De Wilde et al. 2001; Meza et al. 2002; De Buck et
al. 2004; Eike et al. 2005). Silencing of single-copy transgenes has been variably
attributed to effects of the chromosomal integration site (“position effects”), or induction
of RNA-mediated processes
Of all phenomena that have been attributed to gene silencing, position effects remain
among the most enigmatic. The term is used to describe effects of the chromosomal
integration site on transgene expression and are thought to be an epigenetic phenomenon
which is mediated by the spreading of transcriptionally inactive chromatin and/or DNA
methylation states from flanking genomic regions into the transgene (Matzke and Matzke
1998).

In a comparative study of transgene expression, single-copy transgenes showed up to

tenfold differences in expression levels between inserts at different chromosomal
positions in the tobacco genome (Day et al. 2000).
5.3.3 Reducing the Risk of Transgene Silencing
Strategies to reduce the occurrence of homology-dependent transgene silencing
include selection of single-copy transformants, site-specific recombination to
remove repeat structures at transgene loci or to target transgenes to pre-selected
integration sites that are favorable to transgene expression, and avoidance of sequence
duplicates (e.g. promoters) within the transgene cassette (reviewed by Butaye et al.
2005).
What are the reasons to choose a transgenic technology for breeding a new variety?
In general, breeding with transgenic plants is only justified when genetic variation for
a trait is lacking within the primary and secondary gene pools of a crop species or
when the period of selection can be shortened (see Sect. 6.1). There are examples
where transgenic plants display a phenotype perfectly matching the requirements for
crop production