Tecnologia do DNA

recombinante: Vetores
de expressão

Prof. Me. Genilson Júnior

Expressão heteróloga

Expressão heteróloga é a expressão um gene ou parte

de um gene em um organismo hospedeiro, a qual
naturalmente não tem este gene ou gene fragmento.

A expressão de proteínas funcionais em hospedeiros heterólogos

é um desafio da biotecnologia
Expressão heteróloga

Proteínas = Essenciais à estrutura, à função, ao

regulamento celular e pela homeostase do organismo

Produção de grande quantidade de proteína recombinante.

Utilização de microrganismos geneticamente modificados = vantagem frente

a processos Clássicos de produção
 Expansão e desafios da
indústria de biotecnologia:

➢ Produção eficiente e
controlada de proteínas
Expressão recombinantes
heteróloga ➢ Diferentes sistemas de
expressão: procariotos e
eucariotos
➢ Finalidades: Diagnóstico,
terapêutico e de
prevenção
 Bactérias: Escherichia coli

Leveduras: Sacharomyces cerevisiae,

Pichia pastoris

Sistemas Células de inseto (infectadas com

baculovirus)
heterólogos
de Células de mamíferos
expressão
Plantas

Animais
Fatores de
seleção do
sistema de • Características do crescimento celular
expressão • Níveis de expressão (intracelular e/ou
extracelular)
• Modificações pós-transducionais
• Atividade biológica da proteína
relevante
• Dificuldades
• Custos
Elementos de um vetor
Elementos de um vetor
Elementos de um vetor
Elementos de um
vetor
Efeitos dos códons em
expressão heteróloga

Codons pouco utilizados E. coli = baixa expressão

Mutagenese dirigida = Alteração do nucleotídeos sem alterar o aa

Coexpressão do gene argU que codifica o tRNA Arg (AGG/AGA)
Interferência de códons raros
Procariontes e eucariontes
processos pós-traducionais
Procariontes e eucariontes
processos pós-traducionais
Escherichia coli

• É o organismo mais comumente utilizado para

expressão heteróloga.
Escherichia coli

• Diversas linhagens
Vantagens:
✓ fácil manipulação;
✓ Rápido crescimento;
✓ Alto rendimento de proteínas;
✓ Custo relativamente baixo;
✓ Otimização da expressão:
- Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de
indução
- Utilização de cepas de bactérias códon plus
Escherichia coli

Desvantagens
❖ Não realiza modificações pós-traducionais e tem
capacidade limitada de formar pontes dissulfídricas
❖ Atividade biológica e imunogenicidade podem diferir
da proteína natural
❖Elevado conteúdo de endotoxinas
❖Falta de um mecanismo de secreção
Escherichia coli

Razões das desvantagens

❖Características estruturais da sequência de
nucleótidos do gene
❖Instabilidade do mRNA
❖Reduzida eficiência traducional
❖Dificuldade de enovelamento da proteína
❖Diferenças de utilização de códons
❖Toxicidade da proteína para o hospedeiro
Escherichia coli - linhagens

Linhagens de expressão deveriam ser deficientes na

maioria das proteases naturais problemáticas e manter
o plasmídeo de expressão estável.

BL21 é o hospedeiro mais comum p/ expressão

recombinante;

É robusta, mas não patogênica;

deficiente em proteases (ompT e lon)
O destino das proteínas
recombinantes
O destino das proteínas
recombinantes
Estresse por expressão

Algumas proteínas recombinantes influenciam diretamente o

metabolismo celular;
Comumente geram um aumento da carga metabólica.

Desviam recursos do metabolismo hospedeiro para manter a

expressão recombinante.

Genes housekeeping podem ser down regulados; Falta de

aminoácidos e/ou cofatores.

Aumento da proteólise in vivo

Rendimento

Varia com: Proteína expressa x sistema usado

➢ Rendimentos usando o PT7 em E. coli variam de

- Dezenas a centenas de mg/litro de cultura.
- A proteína alvo pode consistir de até 60% da proteína total
bacteriana após a indução.
 Leveduras: Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris
• Otimização da expressão:
- Curva dose-resposta do
indutor, tempo e
temperatura de indução
- Otimização do códon:
mutagênese
• Vantagens (Pichia
pastoris): níveis de
expressão, modificações
pós-traducionais
(glicosilação, pontes
dissulfeto), secreção da
proteína.

Expressão em leveduras
 Outras vantagens:
- Organismo unicelular (alternativa
eucariótica de E. coli)
- Genética e fisiologia conhecidas
- Crescimento rápido
Expressão em - Vários promotores fortes (CYC1,
leveduras ADH1, GAL1O)
- Plasmídio natural denominado 2-
µm
- Não patogênico
- Elevada produção protéica •
Produção industrial
Seleção das leveduras
Expressão em leveduras
Expressão em cél. vegetais

-
Expressão em cél. vegetais

-
Expressão em cél. vegetais
Expressão em cultura de células
mamíferos

• Realização de modificações pós-traducionais idênticas às

naturais.
• Expressão transitória – expressão obtida sem integração do vetor
• Expressão estável – expressão resultante da integração do vetor
de expressão em um dos cromossomas do hospedeiro

Promotores utilizados na construção de vetores de células de

mamífero:
PSV40 (Simian Virus)
PRSV-LTR (Rous Sarcoma Virus)
PMSV-LTR (Murine Sarcoma Virus)
PBPV-1 (Bovine Pappilomavirus Type 1)
PCMV (Citomegalovirus)
Vetores em cél. mamíferas
 Leitura complementar
“Expression in Escherichia coli: becoming faster
and more complex” in Current Opinion in
Structural Biology 2013, 23:326–334

ATIVIDADE

Sim, vale nota!

Resenha do que seria um vetor de expressão:

Componentes e sistemas de expressão (bactérias,
leveduras, cultura de células de insetos, células de
mamíferos e células vegetais.)