Pós-Graduação em

A produção de insulina humana por Microbiologia Geral

Disciplina: Tecnologia do DNA
ENGENHARIA GENÉTICA recombinante
Docentes: Kerollen Runa e
Leissandra Nascimento
Beatriz Dolabela de Lima – Profa Adjunta – Dep. De Biologia Celular – Universidade de Brasília. Discentes: Maria Cláudia e
Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. Nº 23 – Nov/Dez 2001. Sarah Caroline
A Engenharia genética e a biotecnologia moderna
Definição
 Ato de modificar a constituição genética de
um organismo por meio da Biotecnologia.
 Método utilizado: TDR

Vantagens
 Econômica;
 Menor tempo de produção;
 Menor índice de rejeição;
 Produção de análogos
A Engenharia genética e a biotecnologia moderna
Insulina Humana

Diabetes mellitus
Juvenil Adulto

Consequências fisiológicas Tratamento

 Glicosúria Terapia com

 Hiperglicemia; insulina
 Acidose do plasma
sanguíneo;
 Diminuição da produção
de glicogênio;
 Fonte de energia:
proteínas
Insulina Humana
Insulina Humana
Insulina Humana
Construção do gene sintético para a insulina humana
Vantagens da síntese química para a expressão de genes eucarióticos em
procariotos:
 Fornece diretamente a sequência exata desejada;
 As sequências codificadoras e não codificadoras podem ser desenhadas
para a expressão procariótica;
 Sítios de restrição podem ser removidos ou adicionados, íntrons retirados;
 Não há necessidade da etapa de isolamento do mRNA ou DNA genômico e
permite a alteração do gene de forma mais simples.
Construção do gene sintético para a insulina humana

Quantidade de bases substituídas

1º base dos códons 2º base dos códons 3º base dos códons TOTAL
1,16% 1,16% 16,27% 18,6%
Construção do gene sintético para a insulina humana
Construção de um vetor de hiper-expressão para E. coli
Características que otimizam a utilização de vetores:
 Uma região para replicação estável e controle
do número de cópias;
 Um marcador seletivo, como um gene conferindo
resistência a antibiótico para a hospedeira;
 Um promotor para iniciação da transcrição e
seu controle;
 Uma região terminadora da transcrição;
 Um sítio de ligação de ribossomos para a
iniciação da tradução em uma trinca ATG
apropriada;
 Uma região de sítios apropriados para enzimas
de restrição, para utilização nas clonagens dos
genes a serem expressos.
Construção de um vetor de hiper-expressão para E. coli
UTILIZADO:
 Origem de replicação do
plasmídeo pUC8;
 Gene de resistência à
tetraciclina RP4;
 Promotor pL isolado do fago
Lambda;
 Região Shine Dalgarno
sintética do fago T7;
 Terminador de transcrição
Rho-independente sintético;
 Região de múltiplos sítios
únicos para enzimas de
restrição.
Construção de um vetor de hiper-expressão para E. coli
Iniciação da Transcrição

PROMOTOR PARTICULARIDADES
pL Promotor forte e é regulado negativamente pelo A mutação cI857 tornou o repressor
repressor codificado pelo gene cI sensível a temperatura.
TERMINADORES
Rho- Um estrutura em forma de grampo, gerada por Contém uma região de seis resíduos de
independentes pareamento entre repetições investidas, contendo uridina no final da unidade.
uma região rica em pares G-C na base do grampo.
Rho-
dependentes
Construção de um vetor de hiper-expressão para E. coli
Síntese protéica
Para um aumento da
expressão de um gene
clonado é necessário que a
quantidade de ribossomos
seja maior do que a de
mensageiros presentes.
Construção de um vetor de hiper-expressão para E. coli
Síntese protéica: Características dos mRNAs de E. coli
 Códon de iniciação (AUG ou GUG);
 Região Shine Dalgarno (SD) ou sítio de ligação
de ribossomas (RBS):
 Tam: 3 a 6 nucleotídeos;
 Localização 4 a 15 nucleotídeos antes do códon de
iniciação.

Região adicionada:
 Região de sítios únicos para enzimas de
restrição.
Produção da pró-insulina humana
Vetor de
expressão:
pLMT8.5

Plasmídeo
recombinante: CONTROLE:
pPTA1 Cultura da cepa
contendo o plasmídeo
pLMT8.5 sem o gene
Transformação da
cepa E. coli N4830- clonado.
1 (repressor cI)

Indução térmica da
pró-insulina
Considerações finais

Esse trabalho foi realizado dentro do Projeto “Produção de insulina humana

através de precursores recombinantes em Escherichia coli”, coordenado pelo
Prof. Spartaco Astolfi Filho, com financiamento da Biobrás e PADCT/FINEP,
dentro do convênio UnB/Biobrás. Esse sistema de produção de insulina está
patenteado nos Estados Unidos (patente nº 6068993, 30/05/2000, e
6281329B1, 28/08/2001) e com pedido de patente no INPI, Brasil.