Resumos Da 1 Frequência

Engenharia Genética F1
I- IMPORTÂNCIA DA ENGENHARIA GENÉTICA
A engenharia genética baseia-se em:
 Manipulação genética
 Clonagem de genes
 Tecnologia de DNA recombinante
 Biotecnologia
Historicamente, são datas importantes para a engenharia genética:
1900 – Leis de Mendel da hereditariedade

1903 – Genes nos cromossomas Watson e Crick descobriram a
1940 – DNA como material genético estrutura do DNA, tendo
1953 – Estrutura do DNA de dupla hélice
contestado a empresa Rosaline
1966 – Código genético (empresa responsável pelo
1967 – DNA ligase estudo do DNA na época) na
1970 – Enzimas de restrição revista Nature e afirmando que
1973 – Primeiro DNA recombinante (de E. coli) o DNA tinha dupla hélice.
1985 – PCR Valeu-lhes o prémio Nobel.
1990 – Sequenciação de genes
2000 – Sequenciação do genoma humano
ENGENHARIA GENÉTICA VS BIOTECNOLOGIA
Na Engenharia Genética existe todo um processo laboratorial de recombinação do material

genético em que o único objetivo é obter e conservar um recombinante cuidadosamente
selecionado obtido originalmente através da ligação covalente entre um fragmento de DNA e um
vetor, que depois é colocado e reproduzido dentro de um organismo hospedeiro. O produto
resultante, para ser comercializado, precisa de ser submetidos a outros processos industriais.
 Diz-se ser importante ter em mente a “Lei de Murphy” que pode ser culturalmente citada
como “Qualquer coisa que possa correr mal, vai correr mal”, sendo uma analogia ao
cuidado laboratorial que deve ser tido nesta área.
Noutras palavras, a Engenharia Genética é a aplicação dos conceitos de funcionamento

molecular das células (Biologia Molecular) e das tecnologias do DNA recombinante para a
obtenção de produtos e/ou serviços com significativa mais valia económica.
Por sua vez, a área da Biotecnologia vai além desta engenharia, e centra-se em processos
industriais que podem ou não apoiar-se na engenharia genética, mas que, regra geral, seguem
o padrão de começar com uma matéria-prima e obter um produto por fermentação, o qual tem
depois de ser purificado.
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OS 5 FFS – APLICAÇÕES
“Food”: alimentação humana e animal; engloba animais mutificados, alimentos transgénicos

(GM), etc.. Os alimentos transgénicos, ao contrário do que se pensa, têm várias vantagens
económicas, pois há menos desperdício alimentar devido à maior resistência do produto a
ataques de pragas e herbicidas.
 O milho transgénico é o alimento mais relevante neste meio. Ele possui uma toxina de
bactéria que permite o controlo de infestação por larvas. Todo o milho doce
comercializado atualmente é transgénico, pois só assim pode haver tão grande resposta
ao consumo.
 Outro exemplo é a soja (possui gene de resistência a herbicidas), a batata (relevante
devido ao elevado consumo; o OGM é resistente a infetantes virais), mandioca (alimento
rico em cianeto que pode ser tóxico para o ser humano que, por ser muito usado em
África, é importante a obtenção de um GM com menor teor em cianeto).
 A modificação de animais consiste em organismos maiores, com características de
interesse mais acentuadas, etc.. Estes animais ainda não se encontram no mercado por
não serem rentáveis, uma vez que o seu crescimento não é normal e alguns acabam
mesmo por morrer a meio do processo por causa da inadaptação do seu corpo às
circunstâncias a que são submetidos.
“Fiber”: vestuário; engloba fibras não sintéticas (biológicas) como a seda, existindo uma
intervenção sobre os animais/plantas para que estes produzam fibras mais vantajosas, a nível
da qualidade e do custo monetário.
 O algodão transgénico possui um gene de resistência a infestação de larvas.

 Existem ovelhas transgénicas às quais são administradas genes adicionais de síntese
da cisteína (aminoácido que devido à sua pouca disponibilidade limita o crescimento do
pelo) levando a uma produção mais significativa de lã.
 Fibras de celulose são usadas ainda no vestuário. Este açúcar está presente na parede
das células vegetais, sendo possível manipula-las. O ser humano não tem as enzimas
necessárias para digerir a celulose (como a glucose no amido), mas os ruminantes sim
porque têm bactérias celulásicas na flora estomacal. Essas mesmas bactérias podem
ser usadas na degradação da celulose a nível industrial neste mercado, havendo fibras
de celulose revestidas com fungos.
“Fuel”: os combustíveis fósseis são limitados e um dia esgotarão. O uso destes combustíveis
resulta na libertação de CO2, processo que também ocorre em vários seres vivos. Neste
seguimento já há estudos que levam a pensar que as células, que conseguem fazer esse mesmo
processo biológico, poderão ser uma alternativa aos combustíveis fósseis. Contudo, para a
evolução deste mercado tem de haver uma maior carência de combustíveis devido a questões
económicas e sociais, o que ainda não se verifica, levando, por enquanto, a uma estagnação
nesta área.
 Etanol: gasolina + etanol (90:10).

 Metano: resíduos orgânicos do processo fermentativo em anaerobiose levado a cabo por
microrganismos.
 Glucose < Celulose: a celulose é degradada em glucose por celulases, a qual é depois
transformada em etanol.
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 Hidrogénio: as hidrogenases bacterianas retiram o hidrogénio da água, ou seja, a

energia, a qual pode ser canalizada como “combustível”.
“Feedstock”: aplicações ambientais e de biorremediação, no âmbito em que a biotecnologia

pode fornecer métodos de biorremediação no tratamento da poluição que, atualmente, satura o
meio ambiente.
 EnviropigTM: processo de eliminação do fósforo das fezes dos porcos por criação de
animais transgénicos, permitindo fazer cultura de porcos em meio urbano sem incômodo
para a população devido aos maus odores. Não está ainda a ser implementado por
questões económicas.
 Bio-lixiviação e bio-oxigenação, bem como tratamento de efluentes são processos que
atualmente são químicos mas que, com recurso à engenharia genética, podem ser
tornados biológicos. No primeiro caso consistirá na extração não química de minérios,
enquanto o segundo trata a degradação aeróbia e anaeróbia de águas residuais, gases
e óleos.
“Pharmaceuticals”: engloba terapias humanas, medicamentos/ vacinas e diagnósticos. É o

mais relevante dos dias de hoje, sendo que 9/10 medicamentos mais vendidos são de origem
biotecnológica. Existem atualmente mais de 150 medicamentos autorizados e em uso clínico e
cerca de 500 em fases terminais de desenvolvimento.
 Medicamentos: os biológicos vão interferir com o sistema imunitário. Consistem em:

 Substâncias para controlo das respostas imunes (novidades absolutas);
 Drogas anti-virais e anti-tumurais (os tumores/ cancros consistem num
crescimento incontrolável de células que o sistema imunitário não consegue
restringir, sendo que os medicamentos vão mesmo atuar nele, ajudando-o). Só
são viáveis enquanto a vida humana valer mais que o tratamento, pois são
métodos muito dispendiosos (ex.: para a Hepatite C, 2 semanas de tratamento
custam 70 mil euros).
 Novas vacinas (a vacina para a Hepatite B só é possível devido à engenharia
genética).
 Meios de diagnósticos precoces, a nível da genética.
 Terapias genéticas: corrigem situações anómalas para que não nasçam crianças com
deficiências (que “impedem” a evolução da espécie). Esta técnica vai contraria a
natureza humana e utiliza proteínas de substituição e “transgénese” de células
somáticas, havendo ainda muita controvérsia ética.
 Clonagens xenogénicas: crescimento de órgãos e tecidos em animais para transplante
humano, que elimina o problema de escassez de oferta por dadores humanos.
 Produtos individualizados: por exemplo, se alguém tiver um cancro extrai-se as células
desse individuo que se “curam” por recombinação genética e voltam a ser administradas.
São métodos que são únicos para o individuo doente em questão e não generalizados
para uma certa doença. Este processo ainda não é viável atualmente.
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CLONAGEM DE ANIMAIS
Na 2ª Guerra Mundial houve várias tentativas secretas de melhorar a espécie humana, com
propósitos militares. Neste âmbito surgiu a clonagem da famosa ovelha Dolly, com o objetivo de
proceder analogamente com o ser humano.
Foi isolada uma célula mamária de uma ovelha, da qual se utilizou o núcleo com o material
genético (a célula foi colocada em meio com baixa concentração de nutrientes para entrar em
estado de latência), e um óvulo não fertilizado de outra, do qual foi removido o núcleo. Por
eletrofusão juntou-se o núcleo da célula somática ao óvulo, havendo depois sucessivas divisões
celulares até ao blastocisto que foi colocado no útero de uma outra ovelha que funcionou como
“barriga de aluguer”.
Conseguiu-se assim quebrar o tabu da clonagem de animais, bem como disponibilizar tecnologia
para o fazer. Mostrou-se ainda que células somáticas diferenciadas podem tornar-se totipotentes
(com capacidade para se diferenciar em qualquer célula) em determinadas condições de
engenharia genética.
Atualmente o que existe é clonagem de animais. Clonagem humana talvez seja possível um dia,
embora um tópico bastante controverso, para, por exemplo, “substituir” um filho que morre.
TRANSGÉNESE VEGETAL
Consiste em recombinar células vegetais com genes de microrganismos (ou até de animais,
possivelmente) que codifiquem proteínas com características vantajosas para a planta e para a
comunidade humana, a nível social e económico.
ENGENHARIA GENÉTICA NO FUTURO
A vida começa aos poucos a ser manipulada a prazer económico e social do Homem, podendo
em breve ter produtos que achamos bizarros mas que de alguma forma são vantajosos a esses
níveis. Algumas questões são, contudo, ética e moralmente controversas.
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II - CONCEITOS BÁSICOS
TIPOS DE CÉLULAS
As células podem ser procariotas ou eucariotas, sendo a principal diferença entre elas o núcleo
diferenciado, onde se encontra o material genético. No primeiro caso não existe um núcleo
diferenciado e o DNA atua, é processado e armazenado no mesmo local, enquanto no caso dos
eucariotas este é processado e armazenado no núcleo, mas atua fora dele.
Célula procariota Célula eucariota

De menores dimensões; o tamanho pode ser Tem uma organização mais complexa e um
limitante da sua atividade metabólica funcionamento mais eficiente e rentável.
Não tem núcleo individualizado (ausência de
invólucro nuclear) e o DNA está disperso no Tem núcleo organizado, rodeado por um
citoplasma, sendo um filamento duplo que pode invólucro nuclear.
ter uma forma circular.
Tem duas membranas: uma plasmática e uma
Tem uma membrana que pode ou não estar
esquelética que pode funcionar como uma
rodeada por uma parede.
parede.
Citoplasma complexo e compartimentado, com
Não tem sistema membranar interno nem
endomembranas, citoesqueleto e organitos com
citoesqueleto. Só tem ribossomas.
membrana.
Pode ter cápsula e flagelo. Pode ter flagelo
Podem ser gram positivas ou gram negativas Podem ser animais ou vegetais
Os métodos de Engenharia Genética a que se recorrem podem exigir um tipo específico de célula
devido a estas características que as especificam.
Temos de operar em função do tipo de células que temos, sendo o primeiro aspeto a ponderar
as células serem procariotas e eucariotas, pois além de todas as diferenças entre elas de que já
falámos, a mais importante é sem dúvida a ausência ou presença de uma barreira física entre o
material genético e o citoplasma.
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FUNCIONAMENTO DAS CÉLULAS
Apenas células vivas possibilitam o uso da Engenharia Genética, pois atualmente ainda não é
possível gerar vida sem essas células.
 A polémica que surgiu da criação de uma bactéria artificial baseou-se em colocar um

genoma artificial (feito em laboratório) a replicar numa bactéria, dando origem a uma
bactéria nova “artificial”. Precisou-se na mesma de células vivas.
As células funcionais movimentam, no seu

metabolismo, moléculas de água, o que gera
energia que vai ser aproveitada na síntese e
degradação constante de componentes.
Este movimento permite não só a existência
de ciclos de vida (ciclos de
multiplicação/divisão das células que
ajudam na preservação da informação
genética) como a expressão da própria
informação genética.
SISTEMAS EM FUNCIONAMENTO
Para um sistema funcionar têm de ocorrer nas células os processos de replicação, transcrição e
tradução que resultam na formação de um péptido (que tem ainda de ser processado), o qual
queremos fora da célula. Para isso temos ainda de proceder a processos de extração e
purificação. Todos estes passos são sujeitos a regulação, a qual é importante ser manipulada
em laboratório.
 Replicação: ocorre em células quando estas adquirem condições específicas, sendo um

sistema extremamente importante na Engenharia Genética.
 Transcrição: processamento de RNA.
 Tradução: processamento da proteína.
 Secreção da proteína: recuperação e purificação da proteína. É um processo muito
significativo pois implica transpor a membrana celular, sendo um passo importante para
extrair o produto que se quer das células, o qual tem depois de ser purificado.
Tudo o que é de origem recombinante é “contranatura” e por isso é considerado pela célula
algo estranho a destruir. Para impedir isso temos de atuar a nível da regulação destes
mecanismos.
Ex.: Se uma E. coli exprimir uma determinada proteína que nós queremos poderá morrer,
pelo que temos de atuar a nível da regulação da expressão e impedir que isso aconteça.
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A CONSTRUÇÃO DAS CÉLULAS Moléculas inorgânicas (CO2, NH2, H2O)

“A biologia molecular é a Monómeros (nucleótidos, aminoácidos,
interpretação das propriedades dos glúcidos, ácidos gordos)
organismos pelo conhecimento da
Complexidade
estrutura dos seus componentes” – Macromoléculas (ácidos nucleicos,
François Jacob (1973) proteínas, polissacáridos, lípidos)
Esta quote não é totalmente Sistemas supra-moleculares (membranas,

verdadeira pois, por exemplo, todas complexos enzimáticos)
as células têm o mesmo genoma mas
não são iguais. Organelos (núcleo, mitocôndria,
ribossoma, flagelo)
Célula (bactérias, algas, fungos,

protozoários)
As macromoléculas são somatórios de monómeros e não funcionariam umas sem as outras

devido às suas vias de síntese e degradação.
 As proteínas (como enzimas) são somatórios de aminoácidos;

 Os ácidos nucleicos (RNA, DNA) são somatórios de nucleótidos (ribonucleótidos,
desoxiribonucleótidos);
 Polissacáridos (amido, glicogénio) são somatórios de glúcidos (glucose, frutose);
 Lípidos (triglicéridos, colesterol) são somatórios de ácidos gordos.
Existem ainda macromoléculas complexas que compreendem as nucleoproteínas,

glicoproteínas, glicolípidos, etc..
As proteínas
Os aminoácidos são monómeros com 2 grupos radicais distintos ligados ao átomo de carbono
(amina, NH2, e carboxilo, COOH) e grupos ionizáveis (parte variável que distingue os
aminoácidos entre si).
 Conhecem-se 150, mas apenas 20 entram na biossíntese proteica, qualquer que seja a
célula.
 É a cadeia lateral dos a.a. que lhes confere propriedades diferentes e,
consequentemente, a funções das proteínas diferentes.
 Todos os aminoácidos são hidrofílicos, mas algumas proteínas são hidrofóbicas.
As proteínas resultam da condensação de aminoácidos em que existe uma ligação peptídica

entre um grupo carboxilo de um aminoácido e um grupo amina de outro (grupos radicais com
cargas elétricas opostas).
 Moléculas constituídas por 2-10 aminoácidos são chamadas de péptidos. As proteínas

têm mais de 100.
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Estrutura das proteínas
A diferenciação das proteínas faz-se pelo nº, tipo e sequência de aminoácidos, que vão
determinar a sua forma/ estrutura tridimensional bem como a sua função.
Para ser uma proteína funcional esta tem de ter uma estrutura (tridimensional) e configuração.
Nesse sentido, as proteínas podem ter formas e estruturas:
FORMAS ESTRUTURAS
 Globulares  Primária: sequência linear de aminoácidos
 Fibrosas: colagénios caracterizada exclusivamente por ligações peptídicas;
 Secundária: é determinada a forma da cadeia por
dobramento da cadeia e formação de pontes de H (hélice
α, folha plissada/ pregueada β);
 Terciária: enrolamento da estrutura secundária entre si
através de vários tipos de ligações entre os aminoácidos,
conferindo uma forma globosa (em novelo);
 Quaternária: junção de várias cadeias polipeptídicas
terciárias e junção de grupos prostéticos (componente
não proteica).
Funções das proteínas
As proteínas têm diversas funções (exceto a informacional, ou seja, não passam informação à
descendência), tais como:
 Estrutural (colagénio, queratina)

 Enzimática (enzimas como as lípases)
 Recetora (CD4)
 Transporte (hemoglobina)
 Armazenamento (ferritina)
 Nutricional/ Reserva (caseína, albumina)
 Anti-infeciosa/ Imunológica (imunoglobina, anticorpos)
 Reguladora (fatores)
 Hormonal (insulina, adrenalina, neurotransmissores)
 Motora (miosina, actina)
O material genético – DNA
Os ácidos nucleicos, no geral, são compostos por 4 nucleótidos

As bases situam-se dentro da
(timina/ uracilo, adenina, citocina e guanina), os quais são
dupla hélice, na parte central, em
compostos por 3 elementos cada:
planos paralelos entre si, e
1) Base púrica com 2 anéis (adenina ou guanina) ou perpendiculares ao eixo da hélice.
pirimídica com 1 anel benzénico (citosina ou timina). A A pentose (molécula de açúcar) e
complementaridade entre bases é feita através de o ácido fosfórico (grupo fosfato)
pontes de hidrogénio e: localizam-se na periferia da dupla
 Adenina=Timina/ Uracilo (ligação dupla) hélice, ou seja, no exterior.
 Citocina-Guanina (ligação tripla)
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2) Ose (açúcar, pentose que no caso do DNA é uma desoxirribose, e no RNA uma ribose)
3) Grupo fosfato (mono, di ou tri).
NOTA: Os nucleótidos podem considerar-se ésteres fosfatados de nucleósidos, que são

constituídos apenas pela pentose e base azotada.
O DNA é formado por duas cadeias polinucleotidicas enroladas (estrutura secundária) em dupla
hélice e antiparalelas – estrutura helicoidal –, podendo adquirir várias estruturas.
 Forma : é a mais frequente, sendo helicoidal para a

direita.
 Forma A: é também helicoidal para a direita, mas apenas
existe no estado desidratado – pode ocorrer quando se
coloca o DNA numa solução com maior concentração
salina ou com álcool.
 Forma Z: helicoidal para a esquerda, ao contrário da
forma   Não é reconhecido pelas proteínas, pelo que
não se expressa. É mais estável do que a forma  com a
hélice para a direita.
 DNA em tripla hélice: possui duas cadeias de DNA e uma
de RNA, representando o DNA funcional que é usado.
Foi o conhecimento da
estrutura tridimensional do
DNA que permitiu
compreender a passagem
de informação genética
entre indivíduos.
O DNA pode ainda ter várias formas: linear, circular ou de super-enrolamento (supercoiling).
Os eucariotas adotaram a estratégia de ter o seu genoma “partido em pedaços” em

cromossomas, para facilitar a replicação e torná-la mais rápida, pois caso contrário seria um
processo muito lento devido à grande extensão do genoma.
Dentro do núcleo dos eucariotas, nos cromossomas, o DNA

encontra-se compactado na cromatina para diminuir o tamanho
da molécula de DNA, localizando-se preferencialmente na
periferia do núcleo. A unidade básica da cromatina é o
nucleossoma, que é formado por um segmento de DNA (pares
de bases) enrolado num octâmero de proteínas – histonas.
Esta estrutura é extremamente exata e dinâmica (alterando
consoante a fase do ciclo celular em que se encontra).
 Primeiramente as proteínas formam dímeros entre si e

só depois é que se associam ao DNA: o DNA tem carga
negativa, pelo que as proteínas vão ter carga positiva
(são básicas).
 A ligação das proteínas é feita em zonas muito
específicas de DNA ricas em A e T.
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Propriedades físico-químicas do DNA
 Viscosidade: propriedade intrínseca ao DNA que se deve à abertura e fecho do mesmo,

acabando por imobilizar a solução. Decorre da funcionalidade biológica do DNA.
 Absorção UV (260nm): o Sol emite radiação essencial à vida e por isso é importante
que o DNA absorva radiação, permitindo a ocorrência de mutações que se forem
benéfica ajudam na evolução da espécie (adaptação à situação ambiental), embora
possam ser prejudiciais.
Esta característica é crucial em laboratório pois permite visualizar e manipular o DNA e
ainda doseá-lo por espectrofotometria, isto devido à libertação da radiação que
absorveu, a qual provoca fluorescência.
 Desnaturação/ Renaturação térmica: qualquer produto biológico desnatura quando é
aquecido até um determinado ponto porque absorve energia que quebra as ligações.
Contudo, é característico do DNA renaturar quando arrefecido.
Funções do DNA
Sequência única Sequências repetitivas

Codificante Gene rRNA
Não codificante Intrão Satélites, Alu
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
1) Replicação/ Duplicação do material genético (DNA ou RNA)

2) Transcrição: DNA  mRNA
3) Tradução: mRNA  Proteína
4) Transcrição reversa: mRNA  DNA. Síntese de DNA a partir do mRNA. In vitro pode
ser favorável para saber, a partir de uma proteína, o RNA e DNA correspondente (é bom
para a investigação). Contudo, in vivo, não é favorável, pois a enzima que possibilita este
processo só existe em retrovírus (patogénicos) que usam o nosso DNA para proliferar,
ou seja, dá-se através de enzimas de origem viral.
5) Regulação: as proteínas sintetizadas vão regular todos os outros processos.
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III - PRESERVAÇÃO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA

1. REPLICAÇÃO
No final da fase G1 a célula morre (fase G0) ou duplica (fase S). A replicação é a primeira etapa
do fluxo da informação genética, ocorrendo na fase S do ciclo celular (antes da divisão celular),
e apenas quando há sinais nesse sentido (não está sempre a ocorrer).
 Para passar à fase S, as células são sujeitas a vários

mecanismos de regulação. Neste sentido, quando as
células sofrem mutações tendem para G0.
 Assim que passa à fase S a célula perde a sua estrutura,
citoesqueleto e funcionalidade, e concentra-se apenas na
replicação.
 Por exemplo, as células neurais, mesmo não tendo
mutações, não se replicam. Contrariamente, os glóbulos
brancos (linfócitos) replicam-se muito.
A replicação é um mecanismo que permite a O processo de duplicação de DNA e

variabilidade genética e a passagem de das células resume-se a:
características para a geração seguinte (ou seja,
permite manter a informação genética ao longo das 1) Ordem para duplicar
várias gerações). 2) Abertura das cadeias
3) Instalação do equipamento
 Permite a duplicação do material genético 4) Síntese das novas cadeias
antes de ocorrer meiose, em que a partir de 5) Separação das cópias
uma célula-mãe se foram duas células-filha. 6) Separação das células
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
A helicase abre quimicamente a cadeia molde de DNA, quebrando as pontes de H entre as

bases complementares e formando duas forcas de replicação ou garfo replicativo (porque a
replicação é bidirecional).
 A girase só ocorre nos procariontes, cujo DNA está organizado na forma circular, e atua
também na separação das cadeias.
As proteínas SSB (“Single-stranded DNA binding proteins”) ligam-se às cadeias molde

separadas, impedindo que estas se voltem a ligar (ligam-se ao DNA de cadeia simples) – são
também essenciais na reparação e recombinação de DNA.
As topoisomerases são enzimas que aliviam as tensões que surgem nas cadeias de DNA
enquanto estão afastadas – à medida que a helicase atua vai sendo cada vez mais difícil separar
as cadeias devido às forças de tensão. Esta enzima facilita o processo.
 Durante a replicação, a separação das cadeias de dupla hélice pode formar estruturas
enroladas, como superenrolamentos ou catenanes. A função das topoisomerases é
desfazer estes enrolamentos que originam tensões. Neste sentido elas cortam as
cadeias, passam umas por dentro de outras e voltam a fecha-las.
 Estas enzimas alteram o enrolamento das cadeias (tanto desenrolam como compactam).
 A DNA girase (e helicase) é uma topoisomerase.
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Em seguida, a RNA primase liga-se à cadeia de DNA e sintetiza 1 primer ou iniciador

(oligonucleótido de RNA) complementar à cadeia de DNA, que consiste numa sequência de
bases de RNA que iniciam a síntese.
 Os primers são sempre pequenas moléculas de RNA (5-12 nucleótidos); só em

laboratório é que são de DNA.
A DNA polimerase III vai continuar o processo, fixando-se na

extremidade 3’-OH da cadeia molde e sintetizando a nova cadeia
de direção 5’3’ (percorre a cadeia molde na direção 3’5’),
acrescentando nucleótidos livres a essa extremidade, por
complementaridade de bases à cadeia de DNA original e pontes de
H (ligação tripla G-C e ligação dupla A-T).
 A DNA polimerase III só replica no sentido 5’3’ (sentido

da nova cadeia), assim como todas as DNA polimerases.
 Esta enzima não sintetiza DNA de novo, tem de
acrescentar sempre nucleótidos à extremidade 3’-OH do A extremidade 5’-fosfato é onde
nucleótido anterior, pelo que o primeiro nucleótido que ela está “guardada” a energia do
coloca liga ao primer de RNA – é uma limitação da enzima. nucleótido, e é onde ocorre uma
ligação trifosfato. Para um
 Esta enzima também tem função de exonuclease.
nucleótido ser utilizado tem de
estar fosforilado.
Formam-se bolhas de replicação nas cadeias de DNA. Estas bolhas de replicação vão-se
alargando e acabam por fundir umas com as outras  Os cromossomas são todos replicados,
mas têm diversas origens de replicação. Nas bactérias o DNA é circular e por isso só há uma
origem de replicação.
NOTA: Os fragmentos vermelhos

da imagem correspondem aos
primers.
Cada cópia da molécula de

DNA contém uma das cadeias
da molécula de DNA original e
uma cadeia que se formou de
novo  Replicação Semi-
conservativa. (a cadeia nova é
teoricamente complementar à
cadeia molde) Este modelo foi
proposto por Watson e Crick.
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Como as cadeias são antiparalelas, a sua síntese é feita em sentidos opostos e de diferentes
formas.
A cadeia de síntese contínua (cadeia molde) com direção 5’3’ (desde a forca de replicação)
que permite a formação de uma cadeia nova 5’3’, que é replicada linearmente e sem
interrupções a partir da extremidade 3’-OH da cadeia original (extremidade de fora).
 Só necessita do primeiro primer para começar a replicação e depois ela continua sem
problemas.
 A replicação é feita de fora para dentro. A DNA polimerase começa a atuar na
extremidade de fora e vai replicando à medida que a cadeia abre.
A cadeia de síntese descontínua (“cadeia atrasada”) com

direção 3’5’ (desde a forca de replicação) que não permite
uma replicação linear (de fora para dentro), pois a polimerase
III só replica no sentido 5’3’ (e assim teria de replicar no
sentido 3’5’). A nova cadeia tem de ser sintetizada em
pequenos fragmentos.
1) A RNA primase vai sintetizar primers de RNA (complementares à cadeia de DNA) na

direção 5’3’, que vão servir de indicadores para o inicio da polimerização pela DNA
polimerase III.
2) A DNA polimerase III vai colocar novo DNA nos espaços vazios entre os primers de
RNA. Esta síntese vai ser feita à medida que a cadeia vai abrindo: as enzimas sintetizam
um pouco e quando a cadeia abre mais, elas recuam e sintetizam mais um bocado, e
assim sucessivamente – impedimento estereoquímico.
3) A DNA polimerase I (exonuclease) vai remover os primers de RNA e substitui-los por
DNA (atuando sempre desde a extremidade 3’ e formando as cadeias com sentido
5’3’) – ficamos com fragmentos desconectados  Fragmentos de Okasaki
 Como esta enzima não consegue estabelecer a ligação entre os nucleótidos de
DNA substituídos e os que já tinham sido sintetizados, formam-se lacunas entre
o grupo fosfato de um nucleótido e o carbono 3 de outro nucleótido.
 A polimerase I replica mais devagar do que a polimerase III.
 Os fragmentos de Okasaki são mais pequenos nos eucariontes.
 Diz-se que a polimerase I tem atividade exonuclease (enzimas que destroem
primers).
4) A DNA ligase une os fragmentos de Okasaki, com consumo de energia à célula (as
lacunas, deixadas pela polimerase I) – une o extremo 3’-OH de um fragmento com o
fosfato 5’ do fragmento adjacente.
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É importante que as polimerases leiam bem a cadeia e sintetizem a cadeia complementar com
a máxima correção possível e sem erros. As primases, por sua vez, não precisam de ler bem a
cadeia, apenas é necessário que sintetizem o nº de nucleótidos correspondentes à cadeia
original (têm de saber contar), uma vez que, no final, a sequencia que elas sintetizaram vai ser
destruída e substituída por uma cadeia formada de novo por uma polimerase, que a sintetiza
complementar à cadeia original e não ao primer.
A polimerase III trabalha muito rapidamente e por isso comete muitos erros, existem vários
mecanismos de rastreio e reparação, nomeadamente a polimerase I. Na cadeia contínua,
contudo, os erros podem não ser reparados.
A EXTREMIDADE 5’ E OS TELÓMEROS
Quando a DNA polimerase I atua, a parte final da cadeia (extremidade 5’) fica com uma falha e
não é replicada (porque ela destrói o último primer, mas não tem mais nenhum primer por onde
começar a replicar), tornando o cromossoma, ao longo de sucessivas replicações, mais curto
(fator que leva ao envelhecimento, pois chega a um ponto em que o DNA deixa de conseguir
produzir proteínas). Para resolver este problema de replicação, as pontas do cromossoma
contêm sequências repetidas de nucleótidos que são reconhecidas pela telomerase. Esta
enzima contém um molde de RNA que vai sintetizar uma parte extra de DNA no telómero (parte
a vermelho) – Transcriptase reversa –, à qual se vai associar um primer de RNA (que depois
se perde), permitindo a replicação da extremidade da cadeia original.
 O telómero de cromossomas humano é composto por uma sequencia de DNA TTAGGG

repetido em tandem. A telomerase vai conter uma sequência de RNA complementar à
sequencia repetida-molde, para a síntese de DNA.
 Nos procariontes (como a E. coli), como têm DNA circular, não têm telómeros e, por isso,
não têm este problema.
 Os telómeros são importantes nos eucariotas, pois evitam fusão dos cromossomas uns
com os outros.
 Em células jovens os telómeros são muito longos. Em células mais velhas os telómeros
ficam mais pequenos devido à diminuição da atividade enzimática das telomerases.
 Se fornecermos telomerases às células elas têm um tempo de vida maior.
Contudo, o envelhecimento das células não se deve apenas a este fator –
depende também, por exemplo, do acumular de mutações.
NOTA: A DNA polimerase I também atua na cadeia contínua,

eliminando o primeiro (e único) primer lá colocado, pelo que esta 14
cadeia também terá o “problema” dos telómeros.

ORIGENS DE REPLICAÇÃO
Existem vários tipos de origens de replicação, tal como mostra a imagem.
Os locais onde se inicia a replicação são ricos em A e T, pois as suas ligações envolvem menos
pontes de H e é mais fácil separar as duas cadeias (mais fácil de desnaturar). A esta região
chama-se OBP (origin binding protein).
 Nos eucariotas existem ainda regiões de

consenso que são reconhecidas por
proteínas que atraem as helicases.
Alguns organismos, principalmente os vírus, fazem

a replicação em cadeia simples (no caso dos vírus
são poucos os que fazem em cadeia dupla). Isto
deve-se ao facto do seu método de atuação presidir
em mutações e, dessa forma, apenas precisam da
cadeia em que a polimerase cometa mais erros que
não são reparados. As elevadas taxas de mutação
levam a que não haja preservação do património
genético e a que estes organismos estejam em
constante mudança, o que favorece o seu método
de ataque a outros organismos.
15
2. MUTAÇÕES
As mutações são um aspeto importantíssimo a nível da Engenharia Genética, pois ocorrem em

todas as replicações (processo crítico nesta área) tornando-as um sistema instável, quando esta
área de trabalho requer muitas vezes sistemas estáveis e controlados. No “nosso” recombinante
o objetivo é não ter qualquer mutação, pelo que vamos ter de controlar este processo.
As mutações podem ser:
 Génicas ou pontuais: são mutações pequenas que envolvem apenas alguns nucleótido
(são menos abrangentes) – substituição, deleção ou inserção de nucleótido.
 Cromossomais (não pontuais): mutações grandes que envolvem muito DNA.
CÓDIGO GENÉTICO
É o código de correspondência entre os diferentes tripletos codificantes da proteína (codões do

mRNA) com os 20 aminácidos que intervêm na síntese proteica (embora se conheçam mais).
Este código tem várias características:
 Tripleto nucleotídico: é necessária uma sequência de 3 bases (codão) para especificar

um aminoácido.
 Universal (mas com limitações): a universalidade do código genético é limitada. Ele é
comum a todos os organismos (vírus, procariotas e eucariotas), mas não se aplica, por
exemplo, às mitocôndrias (só abrange o DNA do núcleo)  Temos um código genético
que chamamos standard, mas que pode sofrer pequenos ajustes dependendo do
organismo em causa.
 Alguns organismos não usam alguns codões.
 Alguns codões são usados preferencialmente em detrimento de outros,
dependendo do organismo em questão (ou seja, os codões não são usados na
mesma proporção/ probabilidade).
 Degenerado (redundante): a maior parte dos aminoácidos são especificados por mais
do que um codão.
 Sequencial/ Contíguo: não há espaçamento entre os codões, ou seja, é lido
sequencialmente.
 Não ambíguo: um codão codifica apenas um aminoácido.
 Não pontuado: sem interrupções.
 O 3º nucleótido de cada codão não é específico como os dois primeiros.
 O codão AUG tem dupla função: codifica o aminoácido metionina e é um codão de
iniciação.
 Os tripletos UAA, UAG, UGA são codões de finalização ou codões “stop”.
16
MUTAÇÕES GÉNICAS OU PONTUAIS Todas as mutações podem ser hereditárias. No

entanto, os óvulos e espermatozoides são
Estas mutações podem ser:
protegidos e por isso geralmente não são afetados
Espontâneas: são mutações que ocorrem (até porque os óvulos ficam logo formados à
aleatoriamente devido a diversos fatores (abaixo nascença). Desta forma podemos dizer que sim, a
indicados), sendo necessárias para a evolução das hereditariedade de mutações existe, mas tem
espécies. Quando a mutação é negativa geralmente diferentes particularidades quando se fala a nível
as células são eliminadas, pelo que as mutações de uma célula ou de organismos completos.
visíveis são, na maioria, as favoráveis.
As taxas de mutação espontânea são muito baixas, pelo que do ponto de vista estatístico
considera-se um acontecimento raro, embora aconteçam constantemente e sejam
indispensáveis à evolução.
 Erros na replicação: as enzimas DNA polimerases não são infalíveis na colocação do
nucleótido. Mesmo existindo mecanismos de reparação na célula que ajudam a
diminuir estas mutações, estas são as mutações que existem em maior quantidade,
ocorrendo em todos os processos de replicação.
 Embora a replicação seja semi-conservativa, nenhuma das cadeias, no final,
vai ser igual entre si nem à cadeia-mãe devido às mutações.
 Não é o erro na sequência nucleotídica provocado pela deficiente replicação
do DNA pela polimerase que origina a mutação, mas sim a deficiente
correção desse mesmo erro.
 Durante a abertura e fecho das cadeias, feita pelas topoisomerases, podem
surgir mutações por atuação de:
» Nucleases que degradam o DNA aberto e sem proteção.
» Moléculas que inserem nucleótidos, alterando a proteína final.
 Agentes mutagénicos: após o término da replicação os mecanismos de reparação

não atuam, pelo que se ocorrer uma mutação (ex.: devido à radiação UV, agentes
químicos e/ou carcinogénicos, etc.), e o DNA já não pode ser reparado.
 A luz UV é absorvida pela pele e muda a ligação das cadeias de DNA nas
suas células, as quais têm depois de ir para sistemas de reparação que, caso
falhem, dão origem a uma mutação.
 Modificações químicas dos nucleótidos: citosinas em genes inativos estão

geralmente metiladas para suprimir a sua expressão, ou seja, para não serem
transcritos.
Elementos infeciosos: vírus podem causar cortes e deleções pois libertam nucleases.
Induzidas (mutagénese): é induzida pelo homem em laboratório para estudar as mutações

em organismos. Existem vários métodos de indução de mutações, tais como raios X, raios
UV, etc.. Estas mutações podem ser:
 Aleatórias
 Induzidas: virais (chamam-se dirigidas) e hotspots (locais prováveis para ocorrência
de mutação por predisposição da célula (ou seja, é vantajoso para ela para ser
mutada nesse local).
 Ex.: existem proteínas que têm de ser alteradas em pontos específicos –
hotspots – para se tornarem funcionais.
17
 Os hotspots podem ocorrer no “nosso”

fermentador de Engenharia Genética,
podendo ser vantajosas para o
recombinante, mas indesejáveis a nível do
processo.
 A imagem mostra que o gene 200 tem uma
série de mutações – é um hotspot –,
concluindo-se que estas são vantajosas
para a célula e por isso foram preservadas.
As mutações pontuais podem ter duas principais consequências:
 Se ocorrerem na região codificante de um gene que origina uma proteína, a sequência

de aminoácidos altera-se e, consequentemente, também a proteína.
 Se ocorrer a nível de um transdutor de sinal, provoca cancro e pode ser fatal.
 Se ocorrerem em regiões não codificantes (ocorrem a montante ou a jusante da parte

codificante), há alterações na regulação do produto do gene, ou seja, alterações no
controlo da expressão genética, que pode levar a diferentes consequências
 Se ocorrer na região promotora, a RNA polimerase pode deixar de reconhecer
esta zona, não se dando a transcrição.
 Se ocorrer na região reguladora, vai haver um descontrolo no processo de
transcrição.
A percentagem de DNA codificante (que se expressa em

proteínas) é de 1%, pelo que apenas 1/100 mutações será
realmente relevante ao fenótipo (99% ocorrem em DNA
não codificante, embora algumas possam ter relevância).
O Homem tem cerca de 20-25 mil genes mas só 1% é que

é codificante!
18
“Exon Skipping”
Podem ocorrer mutações em exões ou em intrões, sendo mais grave no exão pois é codificante,
ao contrário do intrão.
Todavia, mutações nos intrões também podem ser

importantes, nomeadamente se ocorrerem nos seus
extremos, nas sequências imediatamente antes ou
depois de começar um exão: para haver remoção de
intrões, os seus extremos têm de ser reconhecidos,
sabendo-se assim que as sequências seguintes já
não é para serem removidas. Se houver alteração da
sequência dos extremos dos intrões esse
reconhecimento é dificultado.
No exemplo existe uma substituição que leva ao não reconhecimento do extremo do intrão e,
como consequência, a proteína vai ficar com uma região maior do que era suposto, levando
mesmo à não transcrição de um exão.
NOTA: Genes mais pequenos tendem a ser 100% exões (como os codificadores de tRNA).
Quanto maior for o gene, mais teor em intrões terá, e menos em exões.
MUTAÇÕES NUMA ZONA CODIFICANTE
“Mismatch” (de substituição): substitui-se erradamente apenas uma base da sequência

nucleotídica. Estas mutações podem ser:
Mutação Silenciosa: AGG (Arg)  CGG (Arg)

 Como a substituição resulta num codão que codifica o mesmo aminoácido, não
tem qualquer efeito no fenótipo.
Mutação Neutra: AAA (Lys)  AGA (Arg)
 O aminoácido resultante desta mutação é quimicamente semelhante ao
aminoácido que seria originalmente codificado, tendo um efeito semelhante à
mutação silenciosa, sem afetar o fenótipo.
Mutação com perda de sentido (“missense”): UCC (Ser)  UGC (Cys)
 Há substituição de um aminoácido por outro diferente na proteína resultante,
podendo alterar a conformação da mesma.
 São muito problemáticas pois podem alterar a proteína final.
 Ex.: anemia falciforme.
Mutação sem sentido (“nonsense”): CAG (Gln)  UAG (stop)
 O codão passa a ser de STOP em vez de codificar um aminoácido, ou vice-
versa, originando uma proteína mais curta ou mais longa do que o normal,
alterando a sua funcionalidade.
Transição: pirimidina (C ou T) substituída por outra pirimidina; ou purina (A ou G)

substituída por outra purina.
Transversão: substituição de uma pirimidina para uma purina ou vice-versa; é muito mais
grave pois os tipos de bases são diferentes, nomeadamente a nível do nº de pontes de H
que estabelecem.
19
“Frameshift” (alteração do nº de bases): alteração da grelha de leitura por inserção ou deleção

de bases em nº diferente de múltiplos de 3, que vai alterar completamente a mensagem do gene,
resultando numa proteína diferente, que pode não ser funcional  São muito drásticas, embora
possam ser atenuadas porque a grelha se repete.
Deleção: CAT.CAT.CAT  CAA.TCA.TCA.T

 Remoção de uma ou mais bases do DNA.
Inserção: CAT.CAT.CAT  CTC.ATC.AT
 Adição de uma ou mais bases do DNA.
 Quando é inserida uma sequência igual a outra já existente na cadeia, ocorre
duplicação.
 Se houver uma inserção sem haver mudança de grelha, por vezes também pode
causar doenças.
Só uma das grelhas é que é lida. Todas as

T A C G T A T G C A T A A G grelhas vão dar origem a proteínas diferentes.
T
Na cadeia complementar também vai haver 3
A T G C A T A C G T A T T C grelhas de leitura possíveis e diferentes entre si,
A e das outras 3 grelhas da cadeia complementar.
Vamos então ter 6 possibilidades de leitura de grelha.

Contudo, apenas uma delas é biologicamente relevante!
Reversão/ Supressão
 Reversão verdadeira: existe nova mutação que repõe o codão anterior à 1ª mutação.
 AAA (Lys)  GAA (Glu)  AAA (Lys)
 Reversão equivalente: ocorre nova mutação que forma um codão (diferente do anterior
à 1ª mutação) que codifica um aminoácido com características físico-químicas
semelhantes ao aminoácido que era suposto ser codificado, pelo que a proteína adquire
uma funcionalidade semelhante ou igual.
 UCC (Ser)  UGC (Cys)  AGC (Ser)
 CGC (Arg)  CCC (Pro)  CAC (His)
 Supressão intragénica (2ª mutação): há inserção ou deleção dentro do mesmo gene

que leva à correção da mutação e, consequentemente, à viabilidade da proteína.
 CAT.CAT.CAT.CAT.CAT  CAT.XCA.TCA.^CAT.CAT
 Supressão extragénica: há alteração noutro gene. A mutação é corrigida através de

vários mecanismos extragénicos como o recurso a um supressor fisiológico que leva a
uma via metabólica alternativa.
 tRNA supressor de nonsense UAG (stop)  UAG (Tyr)
 Supressor fisiológico = via metabólica alternativa.
Na reversão a 1ª mutação é corrigida por uma 2ª mutação do

mesmo nucleótido. Na supressão ocorre uma 2ª mutação
noutra parte do mesmo gene ou noutro gene que anula as
consequências da 1ª mutação, sem a alterar concretamente.
20
IV - EXPRESSÃO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA

1. TRANSCRIÇÃO
A transcrição consiste na síntese de moléculas intermediárias de mRNA, portadoras da

informação necessária para a biossíntese das cadeias proteicas  A informação do genoma
está contida nas bases do DNA, e vai ser utilizada indiretamente na síntese de proteínas.
 As enzimas responsáveis pela biossíntese de mRNA são RNA polimerases e DNA

transcriptases.
O processo de transcrição resume-se a:
Um processo de transcrição divide-se em 3 etapas
principais: iniciação (em que há ligação da RNA 1) Sinal para transcrever
polimerase na sequência de DNA do inicio da 2) Abertura das cadeias
transcrição – promotor – e desenrolar/desnaturar 3) Instalação do equipamento
da dupla hélice de DNA), elongação (em que há 4) Síntese da nova molécula
síntese de RNA com NTPs) e terminação. 5) Libertação da cópia
INICIAÇÃO
O início da transcrição é controlado por ligações O reconhecimento do promotor

específicas – há um sinal que indica quando deve iniciar implica rutura das pontes de H e
(as células não estão sempre em transcrição). desenrolamento das cadeias de
DNA, havendo formação de uma
É o passo mais complexo da transcrição, pois exige o
bolha de transcrição.
reconhecimento da região promotora do gene (TATA
box) pela enzima RNA polimerase (enzima responsável A RNA polimerase liga-se ao
pela transcrição). Este processo é diferente em extremo 3’-OH.
procariotas e eucariotas:
 Em procariotas: a polimerase tem, acoplado ao core (constituído por 2 subunidades α

e 2 β), um fator sigma (σ) que reconhece o promotor e desnatura a dupla hélice de DNA
(tem atividade de helicase). Após isto, a polimerase core (’) liga-se à cadeia e inicia
a síntese de RNA, sendo o fator sigma libertado (após polimerização de 10
ribonucleótidos).
 O promotor deve ser rico em A e T cuja ligação é de apenas 2 pontes de H e,
por isso, é mais fácil de desnaturar.
 A polimerase só começa mesmo a transcrever depois de o fator σ sair.
 Em eucariotas: existem diversas polimerases diferentes mas nenhuma tem fator σ, e

por isso o reconhecimento do promotor e o desenrolar do DNA é feito por um aglomerado
de proteínas específicas – fatores de transcrição gerais (TF) – que ajudam a polimerase
a ligar-se à cadeia.
 O mecanismo ainda não é muito conhecido e por isso não temos muito controlo
sobre estas proteínas FT.
21
ELONGAÇÃO
A RNA polimerase percorre a cadeia molde

e continua a polimerização de
ribonucleótidos no terminal 3’, e a nova
cadeia desenrola-se no sentido 5’3’.
Estas enzimas podem sintetizar nova
cadeia (não precisam dos primers), sendo
para isso necessário:
 Trifosfatos de ribonucleósidos NTP;

 Dois grupos fosfato libertados como pirofosfato (PP);
 Primeiro nucleótido em 5’ retém grupo trifosfato (é sempre a energia do trifosfato que
permite a ligação entre os nucleótidos).
NOTA: A nova cadeia de RNA sintetizada que é complementar à cadeia molde (mas em vez de
T tem U).
TERMINAÇÃO
Inicia-se por paragens da RNA polimerase, sendo controlado por sequências específicas –
regiões de consenso, as quais são diferentes entre eucariotas e procariotas.
 Em procariotas: a polimerase reconhece a terminação através de dois mecanismos…

 Rho-independente: o sinal de terminação é uma sequência em forma de hairpin
com vários resíduos GC seguidos por uma série de T (U no RNA transcrito),
após a qual a enzima se solta das cadeias de DNA.
 Rho-dependente: 6 proteínas Rho formam um hexâmero e ligam-se à parte final
do gene para terminar a transcrição.
 Em eucariotas: a polimerase reconhece o local de terminação como sendo uma

sequência de nucleótidos específica (AAUAAA) que funciona como uma mensagem.
NOTA: Como podemos verificar a transcrição não acaba no final da cadeia de DNA mas sim
quando a região for rica em A e/ou T, embora o comprimento da cadeia seja importante para não
esgotar a célula energeticamente.
PROCESSAMENTO DE RNAs (EUCARIOTAS)
Os genes procariotas e eucariotas são diferentes [ver em “Regulação da Expressão Genética”]

e por isso, consequentemente, também as cadeias de RNA obtidas na transcrição serão
diferentes. Enquanto no 1º caso o RNA é maduro e pode seguir para a tradução, no caso dos
eucariotas este ainda não é funcional e precisa de sofrer algumas modificações pós-
transcricionais primeiro. Consoante as modificações que forem feitas, gera-se mRNA maduro
(gene de proteínas), tRNA ou rRNA (genes de RNA).
Estas modificações podem ocorrer em simultâneo. Por exemplo, o capping e o início do splicing
ocorrem tipicamente antes do transcrito primário estar completo.
22
MODIFICAÇÕES DE PRÉ-mRNA
Capping do mRNA
Este processo ocorre logo após o início da transcrição e consiste numa ligação trifosfato entre a
extremidade 5’ do mRNA e um nucleótido alterado – são fundidas duas extremidades 5’ e forma-
se uma espécie de uma bola.
A estrutura criada protege o mRNA contra a ação de ribonucleases e fosfatases (contra a ação
de exonucleases), e promove a interação com complexos proteicos que processam e exportam
o mRNA para o citoplasma, e ainda formam ligação deste com os ribossomas.
 A bola é ainda reconhecida pelo ribossoma.
Poliadenilação
Adição, ao extremo 3’ do mRNA, de uma cauda poli-A

(conjunto de AAA…), catalisada pela polimerase poli-A que
se liga a uma zona específica da extremidade. Esta cauda
contribui para a estabilidade do mRNA, protegendo-o (contra
a ação de exonucleases) e sendo importante para a
terminação da transcrição e exportação do mRNA para o
citoplasma.
O processo necessita de muita energia, pelo que a célula

precisa de ter uma capacidade energética grande para
aguentar o RNA, sendo que mais energia equivale a uma
cadeia de poli-A maior.
NOTA: Alguns RNAs de procariotas também são poliadenilados, mas a cauda tem funções
diferentes.
Splicing
Apesar da informação genética estar armazenada no

DNA, nem todas as sequencias de bases são
codificantes: o DNA é constituído por regiões
reguladoras que flanqueiam as regiões codificantes e
por sequências intercalares que as interrompem.
Após a transcrição o pré-mRNA inclui regiões

codificantes (exões) e não codificantes (intrões).
Estes últimos têm de ser removidos antes da
tradução do mRNA e os exões unidos, processo que
tem o nome de splicing.
Este processo só ocorre nos eucariotas, pois o seu DNA está organizado na forma de
cromossomas e possui intrões e exões, ao passo que os procariotas não têm intrões.
23
Os intrões geralmente têm um sinal para splicing: sequência inicial Pu (rica em A ou G) e uma
sequência final Py (rica em C ou U) – sequências consensus que ocorrem em todos os intrões
(GU---A---AG). Entre essas sequências forma-se o spliceosoma que é um grande complexo
(60S) de 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 e U6) e 100 proteínas associadas. Estes snRNAs contêm
sequências complementares às sequências do RNA envolvidas no splicing e conduzem a uma
reação enzimática na qual há quebra de ligações e formação de novas ligações.
 Quando maior for o gene, maior a proporção de intrões nele.

 A célula sofre um grande gasto de energia para conseguir manter a fidelidade do gene
aquando da saída dos exões.
 É um processo que facilita a passagem do mRNA para o citoplasma. O transporte para
o citoplasma é mais eficiente quanto mais intrões existirem na cadeia, embora a uma
maior quantidade de intrões esteja associada uma maior taxa de erro. Isto porque o
mRNA precisa de atravessar as fibras do citoesqueleto, um processo que necessita de
energia a qual é libertada pelo splicing.
 O spliceosoma é um auxílio em laboratório para inserir intrões no gene.
 U5 e U3 representam regiões não traduzidas.
Self-splicing: Caso em que a remoção dos intrões não envolve as proteínas (nem os snRNAs)
presentes no spliceosoma, pois o próprio mRNA tem atividade catalítica e excisa os intrões
espontaneamente. Temos de ter cuidado para esta situação não ocorrer no nosso recombinante.
Splicing alternativo: Um sinal de splicing pode ser mascarado por proteínas reguladoras,
resultando em splicing alternativo. Em casos raros o pré-mRNA pode conter vários sinais de
splicing ambíguos, resultando em vários mRNAs distintos alternativos.
 Para “fazer” um ser humano são necessários 600 mil genes sendo que, no entanto,
funcionamos apenas com 20-25 mil genes. Isto é possível devido ao splicing alternativo
que permite formar várias proteínas a partir de um mesmo gene devido à excisão de
intrões não se efetuar sempre da mesma forma.
 É um processo essencial à vida mas inconveniente em laboratório de Engenharia
Genética.
PROCESSAMENTO DE tRNAs
O tRNA corresponde a pequenas moléculas de RNA que transportam os anticodões que têm
sequências de 3 aminoácidos complementares aos codões (presentes no mRNA), transportando
o respetivo aminoácido ligado ao extremo 3’ – aminoacil-tRNA e transferindo-o para as posições
corretas nas cadeias polipeptídicas.
 Apenas um aminoácido específico pode ser ligado ao

extremo 3’ de determinado tRNA.
 O reconhecimento do código genético é feito por enzimas que

correspondem o anticodão do tRNA ao aminoácido
compatível (ligam o aminoácido ao tRNA). Estas enzimas são
essenciais para a viabilidade das células e não podem
cometer erros (porque são fatais).
24
Existem cerca de 20 aminoacil-tRNA sintetases diferentes, sendo que cada uma adiciona apenas
um dos 20 aminoácidos a um tRNA
Existe uma molécula que sintetiza vários tRNAs simultaneamente. Existe um RNA percursor com
múltiplas cópias para poupar energia à célula, ocorrendo hidrólises na extremidades 5’-P e
modificações diversas, como metilações. Estes tRNAs transcritos têm de adquirir forma.
Vai ser a enzima aminoácil-tRNA transferase que faz um reconhecimento do tRNA específico e
liga-o ao aminoácido correspondente. A regulação deste processo é controlada através do
processamento regular dos ribossomas.
PROCESSAMENTO DE rRNAs
O rRNA entra na síntese de ribossomas que é feita da seguinte forma: síntese de moléculas de
RNA, transporte para citoplasma (no caso dos eucariotas) e associação com proteína
ribossomais (Ls e Ss). Os RNAs transcritos resultantes são cadeias longas que têm de ser
cortadas em classes de tamanho apropriado (ex.: 18S, 23S, etc.).
 ‘S’ relaciona-se com a dimensão do RNA ou dos ribossomas (em nº de bases).
A sua função é traduzir o mRNA. É diferente consoante se trate de eucariotas ou procariotas,

divergindo na composição e no reconhecimento da ligação:
Nos procariotas os ribossomas são 70S, com duas subunidades: 50S – que contém RNA
23S e 5S, além de 31 proteínas – e 30S – que contém RNA 16S e 21 proteínas.
Nos eucariotas os ribossomas são 80S, com duas subunidades: 60S – que contém RNA
28S, 5.8S e 5S, bem como 49 proteínas – e 40S – que contém RNA 18S e 33 proteínas.
NOTA: O rRNA 5S é semelhante em todos os organismos (procariotas e eucariotas), mas a

sequência é suficientemente diferente para, a partir dela, se puder distinguir bactérias Archea e
Eucarya – a sua distinção é muitas vezes feita por análise desta sequência. É usada para
construir árvores filogenéticas.
25
O percursor dos rRNAs tem duas cadeias, sendo que cada uma vai para cada subunidade do
ribossoma (não faz sentido ter nº diferente de subunidades grandes e pequenas – vamos ter o
mesmo número de RNAs da subunidade grande, pequena e dos pequenos ss).
A cadeia simples do RNA dobra-se sobre si mesma e forma dupla cadeia. Esta formação de
dupla cadeia funciona como um sinal que avisa que o RNA é para ser destruído.
 NOTA: Os mRNAs também ganham estrutura de dupla cadeia.
26
2. TRADUÇÃO
A tradução é o processo que leva à conversão da sequência de ribonucleótidos do mRNA em

sequência de aminoácidos de péptido, de acordo com o código genético. Este processo pode
ser conduzido por vários ribossomas simultaneamente.
INICIAÇÃO
Esta é a etapa mais complexa do processo de tradução. Inicia-se pela associação de fatores de
iniciação à subunidade menor do ribossoma (com consumo de GTP), que se vão ligar à
extremidade 5’ do mRNA e procurar pelo codão de iniciação (AUG). Este codão codifica a
metionina (formil-metionina em procariotas), e por isso esse aminoácido será sempre o primeiro
em qualquer proteína.
 Os primeiros aminoácidos são importantes na localização da proteína na célula, mas

poderão ser eliminados pelas proteínas enzimáticas signal peptidases (clivagem no
terminal N) e, nesse caso, o 1º aminoácido na proteína final pode não ser a metionina.
 ORF (Open Reading Frame): sequência de DNA desde o codão de iniciação até ao
codão STOP que provavelmente, mas não necessariamente, codifica polipéptido.
 Em algumas bactérias a metionina do aminoacil-tRNA inicial é modificada pela adição
de um grupo formil (HCO) no grupo amino – fMet. Esta metionina só surge em
procariotas e por isso desencadeia uma resposta imune nos eucariotas.
Contudo, também existem codões AUG no meio da sequência e que, por isso, não são de
iniciação. Os procariotas e eucariotas têm diferentes mecanismos para distinguir entre o codão
de iniciação e codões internos à sequência.
 Em procariotas: existem mRNA monocistrónico (que codificam para apenas uma

proteína) que apresentam um só codão de iniciação, e mRNA policistrónico (que codifica
para mais do que uma proteína, sendo transcritos a partir de um operão) que apresenta
um codão de iniciação para cada péptido.
O reconhecimento do codão de iniciação é feito (na extremidade 5’) através da leitura de
uma sequência específica localizada 5-10 bases a montante do codão de iniciação
(UAAGGAGG) – sequência de Shine-Dalgarno – com a qual emparelha uma sequência
presente na molécula de rRNA 16S do ribossoma, o que permite a ligação do ribossoma
ao mRNA (com ajuda de cofatores).
 Em eucariotas: o mecanismo ainda não é muito claro, mas pensa-se que o ribossoma
reconhece o capping – sequência análoga à Shine-Dalgarno, chamada sequência de
Kozak, embora sejam ambas sequências RBS – e faz um scanning até ao primeiro
codão AUG. Contudo, alguns mRNA virais são policistrónicos ou não têm 5’cap.
 Se o codão AUG estiver muito afastado do capping o ribossoma não chega lá.
Contrariamente, se estiver muito perto o ribossoma pode não o reconhecer. Por
isto, em laboratório temos de ter cuidado para fazer o capping num local
adequado.
 Como os genes são monocistrónicos apenas a 1ª proteína é expressa.
O primeiro aminoacil-tRNA fixa-se e, por último, associa-se ainda a subunidade maior do

ribossoma, ficando assim formado o complexo de iniciação 70S nos procariotas e 80S nos
eucariotas (mRNA + 2 subunidades ribossomais + (f)met-tRNA) [ver em ‘Processamento de
rRNAs’].
27
ELONGAÇÃO
O ribossoma desloca-se ao longo da cadeia de mRNA no sentido 5’3’, fixando em cada etapa
um aminoacil-tRNA. Deste processo decorre um elevado gasto de energia.
1) O primeiro tRNA entra no local P do complexo

ribossomal. Ao entrar um novo tRNA, este vai ligar-
se ao local A do complexo ribossomal, forma-se uma
ligação peptídica entre os aminoácidos que ficam
ligados ao 2º tRNA que havia chegado, formando um
“peptidil-tRNA” por ação da peptidil transferase.
 A entrada do novo tRNA é catalisada por
fatores de elongação que são diferentes
entre procariotas (Tu e Ts) e eucariotas (EF1
e EF1).
 O grupo -NH2 do 2º aminoácido ataca a
ligação éster que liga o 1º aminoácido ao seu
tRNA.
2) O dipeptidil-tRNA gerado no local A vai ocupar o local
P do complexo ribossomal, deixando livre o local A
para um novo tRNA e passando o 1º tRNA para o
local de ejeção, E. Este processo é também
catalisado por fatores de elongação (G em
procariotas e EF em eucariotas), requerendo o
consumo de GTP.
3) O ribossoma avança 3 nucleótido (1 codão) na cadeia
de mRNA e o processo repete-se de forma contínua
na direção 5’3’, até chegar a um tripleto de
terminação.
Polisoma ou Polirribossoma: conjunto de ribossomas ligados por um filamento de mRNA.

Desta forma, o mRNA pode ser traduzidos em várias proteínas, sendo o processo mais eficiente
quando se realiza em ciclo (como acontece no RER).
NOTA: Em laboratório, devido à frequência de utilização dos codões ser diferente de organismo
para organismo, temos de adaptar a disponibilidade de aminoacil-tRNAs às células com que
trabalhamos.
É de notar ainda que para um tripleto originar sempre o mesmo aminoácido é preciso muita
energia por parte da célula por serem usados dois adaptadores – tRNAs aminoacil-transferases
exclusivas que permitem esta ligação exclusiva do mesmo aminoácido sempre ao mesmo codão
e ainda a ligação entre codão e anticodão.
 Isto é geralmente assegurado pelo ribossoma e, quando falha, a sequência tem de ser
degradada.
 O ribossoma vai garantir a hibridação codão-anticodão e verificar todas as ligações que,
caso não estejam corretas, vão ser eliminadas.
Embora os processos
requeiram muita energia, se
fornecermos energia em
demasia à célula esta cansa-se.
28
TERMINAÇÃO
Existem proteínas que funcionam como fatores de

terminação, que reconhecem codões de finalização e
estimulam a paragem do ribossoma e a libertação de peptidil-
tRNA do mesmo. O peptidil-tRNA separa-se depois em tRNA
e na nova cadeia peptídica sintetizada.
 Os codões STOP são: UAA, UAG e UGA.

 Os codões STOP não codificam aminoácidos nem
são reconhecidos pelo tRNA – são codões “non-
sense”.
Sem mais mRNA para trabalhar, o ribossoma divide-se nas

suas duas subunidades, maior e menor, as quais ficam livres
para iniciar um novo processo de tradução.
PROCESSAMENTO DE PROTEÍNAS
A proteína sintetizada na tradução não é funcional, sendo importante que adquiram a sua forma
e função e que sejam completadas com outras moléculas – as proteínas sofrem modificações
pós-traducionais.
LOCALIZAÇÃO – TRANSPORTE E ENCAMINHAMENTO DE PROTEÍNAS (“TARGETTING”

OU “SORTING”)
As proteínas são sintetizadas no citoplasma e depois têm de ser transportadas para os locais da
célula apropriados, onde vão exercer a sua função. Ou seja, têm de sofrer uma deslocalização e
sair do seu local de síntese para o local de atuação. Este processo, contudo, pode ter algumas
consequências.
As proteínas têm alguns aminoácidos no terminal-N que funcionam como sinais que têm uma
sequência específica que direciona as proteínas. A sequência sinal chama-se KDEL e é: Lys-
Asp-Glu-Leu.
Tradução no Retículo
Nos eucariotas: algumas proteínas são feitas para integrar o lisossoma, a membrana celular ou
para serem excretadas da célula. Estas proteínas adquirem, durante a sua síntese no citoplasma,
uma região hidrofóbica – peptidosinal –, que torna a proteína instável no citoplasma e a qual é
depois reconhecida pelas proteínas SRP (também hidrofóbicas) que se ligam a ela.
As SRP (Signal Recognition Particle) ligam-se assim que as proteínas começam a ser
sintetizadas nos ribossomas livres do RER e param o processo de tradução, o que vai permitir
que as SRP sejam captadas pelos recetores de SRP existentes na membrana do RER.
29
O complexo SRP-ribossoma vai ligar-se

a uma proteína transportadora presente
na membrana, onde prossegue a
tradução da proteína, a qual no final é
libertada no lúmen do RER.
As proteínas são depois incorporadas

em vesículas que vão sair do RER,
passar pelo Complexo de Golgi (onde as
proteínas são fosforiladas) e fundir com
a membrana celular ou dos lisossomas.
Nos procariotas: embora não possuam retículo endoplasmático nem complexo de Golgi, as
proteínas que vão incorporar a membrana celular ou ser excretadas também possuem o
péptidosinal, sendo reconhecidas diretamente por recetores da membrana celular.
 No caso das Gram -, como têm duas membranas, as proteínas ainda têm um “passo
intermédio”.
 No caso das Gram +, as proteínas só têm de transpor uma membrana.
Gram negativas Gram positivas
ENROLAMENTO (“FOLDING”)
Para a proteína recém-sintetizada ser funcional é necessário que adquira uma estrutura
tridimensional correta, a qual é conseguida através de enrolamentos por auxílio de proteínas –
chapperones (chaperoninas no caso da E. coli) – as quais impedem foldings incorretos.
 Antes do péptido estar completamente sintetizado pode enrolar prematuramente. Esse

folding incorreto da proteína precisa de ser pevenido.
 As chapperones ocorre não só no final da tradução, mas também quando as proteínas
desnauram e precisam de recuperar a sua forma correta.
30
Este processo é ainda auxiliado pelas proteínas de choque térmico HSP (proteínas expressas
para proteger outras proteínas aquando de um aumento de T, para elas não desnaturarem).
Estas proteínas HSP dependem do tipo de célula.
NOTA: Cada anticorpo é constituído por 4 cadeias (2 pequenas e 2 grandes) arranjadas de uma
maneira específica. Esta estrutura é conseguida apenas durante a sua síntese, sendo impossível
adquiri-la depois.
GLICOSILAÇÃO: Processo que ocorre logo assim que a proteína sai do RER, no qual se
adicionam sacarídeos às proteínas, originando proteínas de membrana. Esta modificação não
ocorre, contudo, em procariotas.
“SPLICING”: Processo no qual são removidos fragmento internos da proteína, sendo necessário
para que esta se torne funcional.
HIDRÓLISE
As proteínas depois de serem sintetizadas não duram para sempre, havendo uma altura no seu
“ciclo de vida” em que são degradas pela via da Ubiquitina/Proteassoma. Existem proteínas
que sofrem desnaturação e tornam-se instáveis, proteínas que já cumpriram a sua função e
deixam de ser necessárias ou proteínas que são estranhas ao organismo, sendo por isso
importante a sua degradação (em α-aminoácidos), e reutilização dos seus componentes.
Estas proteínas são identificadas por uma enzima que as marca, por ligação a ubiquitina, ficando
assim sinalizadas para serem posteriormente destruídas pelo proteassoma. O proteassoma é
um grande complexo constituído por proteínas com atividade de protéase e de ubiquitinação.
31
 É um processo importante de controlar no laboratório.

 No Homem, ocorre no estômago e no pâncreas.
 Algumas proteínas têm uma vida muito curta – proteínas efémeras.
 Consoante o aminoácido final na cadeia, a proteína é mais ou menos estável e por isso
degrada-se mais lenta ou mais rapidamente, respetivamente.
Nos procariotas o mRNA que se obtém é mais simples e por isso não necessita de
maturação, podendo ser traduzido assim que é transcrito. Por este motivo, e pelo facto de
ambos os processos ocorrem no mesmo compartimento (devido à ausência de membrana
nuclear), é possível que se façam em simultâneo, isto é, a tradução pode começar antes da
transcrição estar completa (isto não acontece nos eucariotas, pois os processos são
separados fisicamente).
Como não tem qualquer proteção, após a sua transcrição, o RNA pode começar a ser
degradado pelas nucleases.
32
V- REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA
Dizer que um gene é expresso significa que o gene está a ser transcrito e, no caso de codificar
proteínas, traduzido. Como já vimos, todos os mecanismos de preservação e expressão da
informação genética estão sujeitos a regulação. Apesar das células possuírem os mesmos genes
no seu genoma, estes são expressos de formas distintas, resultando na diferenciação celular.
 Em laboratório podemos obter diversas variações que só são possíveis através do

controlo da expressão genética. Para este controlo ser eficiente é preciso saber quanto
produto em proteína se produz a partir de um gene e quando e onde é que esse gene é
expresso.
 Não há nenhum componente recombinante que não seja rejeitado pelo hospedeiro em
que se coloca, e para prevenir essa rejeição é preciso atuar a nível da regulação.
Os níveis de regulação são diferentes consoante se trate de um organismo procariota (única

regulação é a nível da transcrição dos genes) ou eucariota (vários pontos de regulação), devido
à diferença existente entre os genes.
 É por este motivo que existem estratégias diferentes quando se quer fazer clonagem em
procariotas ou eucariotas, devido aos mecanismos de regulação.
Pontos possíveis de regulação da expressão de genes são:
1) A nível do gene: na sua organização, nível de compactação, metilação, rearranjos,

etc.;
2) A nível da transcrição: presença de promotores (que condicionam a célula e/ou
No núcleo
momento em que o gene é expresso), fatores de transcrição, repressores,
proteínas específicas, etc.;
3) A nível do produto de transcrição: ocorrência de modificações pós-transcricionais;
4) Antes da tradução: o mRNA pode ser degradado ou sofrer modificações e, nestes

casos, já não passa para a tradução.
5) A nível da tradução: regulações que ocorrem na ligação ao ribossoma e no produto
final. No citosol
6) A nível do produto de tradução: para formar uma proteína ativa ocorrem
modificações pós-traducionais, que não podem falhar.
7) A nível de proteínas inativas: são degradadas
NOTA: Na maioria dos genes, o principal ponto de controlo é o 2º, a nível da transcrição. Sendo
um ponto de controlo tão cedo na expressão genética, permite que a célula não dispense energia
e nutrientes desnecessariamente.
A regulação dos procariotas ocorre apenas a nível da transcrição e da

tradução, embora seja maioritariamente na transcrição porque ambos os
processos são acoplados e fica difícil de regular a nível da tradução.
33
A NÍVEL DO GENE
METILAÇÃO
Quando o DNA está metilado a entrada da polimerase é mais difícil de ocorrer e por isso há
menos expressão. Este é um mecanismo de regulação que ocorre após a replicação.
NOTA: Durante a reparação de DNA, se a cadeia estiver metilada a polimerase consegue

identifica-la como sendo a cadeia nova e corrige a mutação na cadeia correta.
A NÍVEL DA TRANSCRIÇÃO
ACETILAÇÃO
A acetilação traduz-se numa relação que ocorre entre uma histona e um ácido nucleico a qual
promove a ligação de fatores de transcrição, sendo que o grau de acetilação das histonas leva a
diferentes relações com os promotores.
UTILIZAÇÃO DOS GENES
Se o DNA estiver em forma C, a polimerase não consegue atuar e o gene não é usado. A
regulação a este nível é a mais significativa, embora pouco relevante na área da Engenharia
Genética, porque nunca se quer “não usar” um gene.
 A regulação a nível da transcrição é a mais usada para controlar a expressão genética.

 Quanto maior a taxa de transcrição, mais RNA existe.
Perda e ganho de genes
Consiste na degradação ou amplificação seletiva dos genes, não sendo um mecanismo normal.
Embora não tiremos partido da perda de genes (perde-se expressão genética), tiramos do ganho
de genes que leva ao aumento da expressão genética.
34
Rearranjo de genes
Há genes que num tecido têm um promotor

e noutro tecido têm outro promotor, sendo
que o momento e o local onde são
expressos depende desse mesmo
promotor. Isto promove expressão
diferencial de um mesmo gene.
 Este rearranjo por vezes acontece

de forma fisiologicamente natural
nas células, sendo sempre uma
alteração definitiva.
 Também se pode alterar o
promotor do gene em laboratório.
REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL E PÓS-TRANSCRICIONAL – EXPRESSÃO DIFERENCIAL
Cada célula exprime de maneira diferente o mesmo conteúdo genético.
 Transcricional: O DNA pode existir no núcleo ou não, dependendo do tecido.

 Pós-transcricional: Existe mRNA nuclear em ambos os tecidos, mas deixa de haver RNA
citoplasmático num dos tecidos.
Diferentes combinações de algumas proteínas reguladoras de genes resultam em muitos tipos

diferentes de células durante o desenvolvimento embrionário, durante o qual o controlo da
regulação da expressão genética é importante.
Inicialmente temos uma única célula com uma proteína reguladora que, por existir em pouca
quantidade, apenas uma das células-filha a vai herdar. Ao longo das sucessivas divisões
celulares vão surgindo outras proteínas reguladoras que podem interferir umas com as outras,
levando à expressão diferencial dos vários genes, tendo como consequência a formação de
diferentes tipos de células, com diferentes funções (neurónios, células do fígado, etc.). A
diferenciação celular é, então, um exemplo de consequência da expressão diferencial dos genes
por mecanismos de regulação.
35
Ex.: Se uma bactéria que se suicida quando produz uma proteína que nós queremos obter, temos
de atuar a nível da regulação para a fazer crescer sem proteína e começar a sintetiza-la só num
momento específico que queiramos (e aí pode morrer).
TRANSCRIÇÃO DIFERENCIAL
Relaciona-se com a taxa de transcrição

que ocorre. Se for transcrito muito RNA
temos muita proteína, enquanto se for
transcrito pouco RNA temos pouca ou
mesmo nenhuma proteína.
REGULAÇÃO EM TRANS
Os genes que codificam os fatores de regulação trans localizam-se numa molécula de DNA
diferente da qual em que atuam e por isso têm de migrar. Geralmente atuam sobre os fatores de
regulação cis.
No caso dos procariotas existem os operões e os genes são policistrónicos, enquanto nos
eucariotas isso não acontece. Na região promotora dos eucariotas há regiões que são alvo do
mesmo regulador, ou seja, vários genes são regulados pelo mesmo regulador, possibilitando
uma expressão coordenada dos mesmos.
Repressores/ Ativadores
Moléculas que reprimem ou ativam a

expressão genética, estando geralmente em
equilíbrio entre si. Contudo, se um deles
tiver em maior quantidade do que outro, é
ele que atua.
a) O que tem maior força liga-se.

b) Ligam-se os dois e o resultado vai
depender se a polimerase se
consegue ou não ligar.
c) O ativador promove a entrada na
polimerase.
36
REGULAÇÃO EM CIS
Os genes que codificam os fatores de regulação cis localizam-se na mesma molécula de DNA
em que atuam. São exemplos destes fatores as regiões reguladores e promotoras dos genes,
que podem “ligar ou desligar” a expressão do gene.
 Existem nos genes sequência de consenso que são sequências ideais no gene para
interação com proteínas de regulação (sejam elas fatores de transcrição ou fatores
sigma) que correspondem ao fatores de regulação trans.
Promotores de Genes Procariotas
Contrariamente aos eucariotas, nos procariotas o promotor é reconhecido pelo fator sigma,
 da RNA polimerase.
Fazendo o alinhamento de várias sequências de genes da E. coli, podemos confirmar que as

zonas em que há maior nº de nucleótidos em comum são as regiões -35 (TTGACAT) e -10
(TATAAT). Essas regiões são então chamadas de regiões de consenso.
NOTA: Podemos ver na imagem que a sequência codificante do gene é a parte a azul (que só
começará com o codão ATG), mas a transcrição inicia-se antes (em +1), numa região que
permite a ligação ao mRNA (região 5’-UTR), que embora depois não seja traduzida, é bastante
importante para a ligação aos ribossomas.
Os genes dos procariotas são maioritariamente policistrónicos (podem atuar vários ribossomas
simultaneamente e do mesmo gene podem surgir diferentes proteínas) e a sua regulação é feita
de forma conjugada por operões, sendo um processo mais simples e apenas a nível da
transcrição e da tradução.
Operões (cluster): controlam a expressão de vários genes (que não façam sentido ser
expressos uns sem os outros) – genes policistrónicos – de modo a que esta seja apenas
“ativada” quando o produto do gene é necessário à célula.
São constituídos por um gene promotor, um gene operador e os genes estruturais. A estes
liga-se um 4º gene, o gene regulador, que não faz parte da constituição do operão, mas funciona
em parceria com.
37
 O gene promotor ou promotor próximal é a região onde a enzima RNA polimerase,

responsável pela transcrição dos genes estruturais, se liga.
 O gene operador é o que controla o acesso da RNA polimerase aos genes estruturais,
regulando a sua transcrição.
 Os genes estruturais são onde se encontra codificada a informação genética
necessária para a formação de certas proteínas.
 O gene regulador vai ser constantemente transcrito e traduzido, produzindo
continuamente pequenas quantidades de uma enzima proteica, o repressor. Esta
enzima pode ser codificada na forma ativa (na qual se vai ligar ao gene operador,
impedindo a passagem da RNA polimerase proveniente do gene promotor e,
consequentemente, impedindo a transcrição dos genes estruturais) ou na fase inativa
(na qual não se liga ao gene promotor, permitindo, assim, a passagem da RNA
polimerase e a transcrição dos genes estruturais). A cada operão está associado um
gene regulador que só produz repressores numa das formas, ativa ou inativa, nunca
alternando entre elas.
Operão da lactose em E. Coli
A lactose é um açúcar usado pelas bactérias

para obter energia. A E. coli necessita de
sintetizar três enzimas (proteínas) que ajudem
no processamento da lactose, para que esta
possa atravessar a membrana citoplasmática.
Na ausência de lactose, o gene regulador

produz um repressor na forma ativa, que se
liga ao gene operador, impedindo a passagem
da RNA polimerase (que estava associada ao
gene promotor) e, consequentemente, a
transcrição dos genes estruturais.
Na presença de lactose, esta liga-se ao

repressor, originando uma alteração
conformacional que o torna inativo, o que
vai levar à sua desconexão do gene
operador, permitindo, deste modo, a
passagem da RNA polimerase e a
transcrição dos genes estruturais, após a
tradução dos quais serão produzidas as
enzimas necessárias ao metabolismo da
lactose, ou seja, para a sua degradação
em glucose.
 Quando é adicionada ao meio, a lactose ativa a expressão dos genes – regulação

positiva.
 A ligação da RNA polimerase ao promotor lac é fraca e requer frequentemente ativação
pela CAP (Catabolite Activator Protein).
38
Quando a concentração de lactose começa a baixar drasticamente, devido à ação catalítica das
enzimas, a lactose desliga-se do repressor, que, ao voltar à forma ativa, liga-se novamente ao
operador, bloqueando a transcrição do operão, garantindo uma poupança de recursos que não
são necessários na ausência de lactose.
É uma via catabólica em que há produção de energia, e os genes catabólicos são sempre
regulados pelos níveis energéticos, ou seja, pelos níveis de concentração de ATP e AMP
cíclico (que são inversamente proporcionais). Assim, como o aumento da glucose leva ao
aumento de ATP, na presença de muita glucose expressão dos genes é inibida porque há
demasiada energia.
NOTA: A célula precisa de um nível de energia elevado para expressar o recombinante, mas
se for muito elevado não o vai expressar porque não precisa. Por outro lado, se os níveis
forem muito baixos a célula definha. É por isto preciso encontrar um nível intermediário
adequado às condições experimentais em que trabalhamos.
A lactose funciona como um indutor, pois a sua presença ativa o operão. É também por isso
que se dá o nome de operão indutível.
Se houver tanto lactose como glucose no meio a bactéria não precisa degradar a lactose e por
isso a expressão dos genes não é ativada – há portanto um duplo controlo do operão lac:
 Quando há glucose e lactose no meio, a CAP não se liga e por isso não há expressão.
 Quando há glucose e não há lactose no meio, o operão está inativo porque há ligação
do repressor ao gene operador e ainda porque a CAP não se liga.
 Quando não há nem glucose nem lactose no meio, a CAP liga-se mas também o
repressor se liga, pelo que continua sem haver expressão dos genes estruturais.
 Quando não há glucose mas há lactose, há ligação da CAP e da RNA polimerase porque
o repressor é inativado pela lactose.
39
Operão do triptofano
Os genes estruturais deste operão, quando transcritos e traduzidos, originam enzimas

necessárias à produção do aminoácido triptofano, sendo que o gene regulador deste operão,
contrariamente ao que acontecia no operão lac, codifica um repressor na forma inativa.
Desta forma, quando as concentrações intracelulares deste aminoácido são baixas, o repressor
inativo, não podendo ligar-se ao gene operador, vai deixar o operão ativo, permitindo a passagem
da RNA polimerase até aos genes estruturais e a produção das enzimas, levando, assim, ao
aumento da concentração de triptofano.
Quando a concentração deste aminoácido é elevada,

algumas moléculas deste aminoácido ligam-se ao
repressor, modificando a sua conformação e tornando-
o ativo, pelo que ele se liga ao operador, bloqueando a
transcrição dos genes estruturais do operão.
 Se houver cerca de 50% de triptofano no meio

intracelular há uma atenuação da expressão
dos genes, sendo que vai haver alguns
fragmentos de RNA muito pequenos e
algumas proteínas que não são expressas. Ou
seja, em alguns casos a transcrição termina
antes de atingir a sequência em hairpin.
 Como quando está no meio, o triptofano inibe a expressão dos genes estruturais deste
operão diz-se que faz uma regulação negativa.
A via anabólica consome energia, sendo uma via que está sempre ativa em contínua
síntese, e que só para quando não é necessária devido à presença excessiva do seu próprio
produto.
A expressão destes genes é constitutiva, ou seja, contante, sendo que o triptofano atua como
co-repressor.
40
Promotores de Genes Eucariotas
Nos eucariotas os tecidos têm de receber sinais extracelulares nos recetores da membrana para
que os mecanismos de regulação intracelulares a nível dos genes ocorram, sendo por isso a
regulação da expressão mais complexa do que nos procariontes, ocorrendo não só a nível da
transcrição e da tradução mas também em todos os níveis de processamento intermediário.
A imagem abaixo é alusiva a uma região promotora eucariótica (mais complexa e maior que a
procariótica), com várias regiões de sequências específicas (representadas a azul) que são
reconhecidas por proteínas de diferentes funcionalidades (círculos) que contribuem positiva ou
negativamente para a transcrição, induzindo ou reprimindo o processo, respetivamente – o
promotor é reconhecido por fatores de transcrição específicos (fatores de regulação trans).
A região promotora tem uma região core, uma região proximal (da core) e uma região distal.
Alguns promotores podem não ter a sequência TATA box, mas têm outras sequências
correspondentes.
Para fazer um recombinante

eucariótica é necessário:
região TATA box, regiões
promotoras distal e
proximal, intrões e exões e
local de reconhecimento da
poli-A polimerase.
Como podemos então perceber, a regulação dos promotores nos eucariotas é muito mais
complexa do que nos operões dos procariotas.
Na zona promotora estão contidas a zona de consenso TATA e

o iniciador (estando a TATA mais próxima do enhancer).
Enhancers e silenciadores
 Enhancers ou promotor distal: São elementos de regulação

positivos, localizados a montante (a maioria) ou a jusante do local
de início da transcrição, sendo que a região enhancer pode conter
um ou mais elementos reconhecidos por ativadores de
transcrição.
 Nos eucariotas esta região pode estar distante do
promotor.
 Nos procariotas esta região está próxima do promotor.
Se houver a ligação de uma proteína reguladora ao enhancer, esta vai interagir com o
fator de transcrição específico que, associado à RNA polimerase vai ativar a transcrição.
 Silenciadores: são elementos de DNA que interagem com repressores (proteínas) –

são reconhecidos por elas – e inibem a transcrição.
 Nos procariotas correspondem ao genes operadores/silenciadores dos operões.
NOTA: Por vezes um elemento de DNA pode atuar como enhancer ou silenciador, dependendo
da proteína que se liga.
Promotor distal: foram encontrados nos vírus e proporcionam uma maior expressão
genética permitindo que o vírus, mesmo sendo um organismo estranho, consiga infetar 41
a célula-alvo. Contudo, a capacidade regulatória é menor que no promotor proximal.
A NÍVEL DO PRODUTO DA TRANSCRIÇÃO
 Ocorrem várias modificações pós-transcricionais nos eucariotas.
ESTABILIDADE DO mRNA
É um ponto crítico para a ocorrência ou não de expressão genética, uma vez que o mRNA é
rapidamente destruído se não for estável.
 Para promover a estabilidade: caudas poli-A que permitem a ligação aos ribossomas.
 Para promover a instabilidade: usa-se um antisenso que promove a destruição do mRNA
– RNA de interferência (iRNA), um dsRNA (RNA de dupla cadeia sintetizado na célula)
que suprime parcial ou totalmente a atividade de genes através de um processo que
depende da homologia de RNAs e sem haver participação de proteínas, tendo um papel-
chave em muito processos celulares essenciais. Este dsRNA transforma-se em
pequenos pedaços (siRNA) que corta o mRNA em pedaços que são depois degradados,
sendo impossível ocorrer tradução.
 Quanto mais estável for o RNA mais ciclos de tradução pode ser submetido a, e mais
proteínas são formadas. Desta maneira, quanto maior o nível de nutrientes a célula tiver
disponível, maior serão os níveis energéticos (ATP) que permitem a formação de caudas
poli-A e, consequentemente, a estabilidade dos mRNAs.
No ciclo celular algumas células auto destroem-se – apoptose ou morte celular programada.
Este é um processo controlado que leva a que num determinado momento e condições celulares,
durante o desenvolvimento normal do organismo, determinada célula cometa suicídio.
PROCESSAMENTO/ TRANSPORTE mRNA
O processamento e transporte do mRNA ocorre quer se tenha muito ou pouco RNA. Para sair
do núcleo para o citoplasma é preciso que o mRNA seja estável, o que não se verifica muitas
vezes, levando a uma grande quantidade de RNA que não sai para o citoplasma e nem valia a
pena ser transcrito.
42
Edição de mRNAs
A sequência do mRNA vai depender do tecido onde se encontra, embora o gene de onde foi
transcrito seja igual em qualquer situação. Isto acontece devido à edição do mRNA na qual os
codões são alterados, passando a expressar um aminoácido diferente, um codão stop, etc..
 É inconveniente a nível da Engenharia Genética.

 Não ocorre muito frequentemente.
Splicing alternativo
É fundamental à vida e à sua diversidade, embora seja inconveniente no nosso fermentador de

recombinação genética. Para contornar isto é necessário que o recombinante tenha o menor
número de intrões possível.
No entanto, sem intrões e sem splicing não ocorre processamento do mRNA e este não migra
(pelo menos não tão eficientemente) do núcleo para o citoplasma.
 Possibilita a formação de proteínas completamente diferentes a partir de um só gene

(por exemplo, pode ser a diferença entre ter uma proteína de membrana ou uma proteína
de secreção).
A NÍVEL DA TRADUÇÃO
A frequência da tradução é condicionada pela frequência dos codões mais usados e pela
concentração de mRNA disponível para o processo.
A NÍVEL DO PRODUTO DA TRADUÇÃO
 Ocorrem diversas modificações pós-traducionais nos eucariotas.
HIDRÓLISE: Proteínas que não são muito estáveis são destruídas (hidrolisadas) muito
facilmente, havendo várias proteínas assim nas células. Na área da recombinação genética
raramente as proteínas são estáveis porque não são próprias da célula em que são inseridas, e
por isso é necessário regular a este nível.
INDUÇÃO DA EXPRESSÃO
- Se não tivermos proteína  Síntese de proteínas

- Se tivermos uma proteína inativa  Fosforilação da proteína, desfosforilação da
proteína, ligação de um ligando, clivagem para libertar o fator ativo, libertação do inibidor
ou mudança de parceiro (de um inativo, para um ativo).
43
CONCEITOS-BASE EM RESUMO
PRINCÍPIOS GERAIS
 Expressão constitutiva: taxas de expressão constantes dos genes (ex.: operão trp).
 Expressão modulada: taxas de expressão dos genes são reguladas.
TIPOS DE REGULAÇÃO
 Elementos em cis: são dominantes e fazem uma regulação a nível das sequências de
DNA.
 Elementos em trans: são recessivos e fazem uma regulação a nível dos RNAs ou
proteínas difusíveis.
ÂMBITO DA REGULAÇÃO
 Global: estrutura da cromatina regula a expressão dos genes. Por exemplo, em mitose
e em meiose esta está condensada e não permite a ocorrência de transcrição.
 Banda larga ou co-regulação: a regulação é ainda condicionada pelos níveis energéticos
da célula, ou seja, pelos níveis de ATP e AMP cíclico que são inversos. Por exemplo,
elevados níveis de AMP cíclico ou baixos níveis de ATP levam à ativação das vias
catabólicas para que haja produção de energia.
 Banda estreita: regulação que é feita a genes individuais. Por exemplo, a concentração
de lactose e triptofano só vão influenciar os genes que se referem ao seu metabolismo.
44
MODOS DE REGULAÇÃO
 Regulação positiva: ativadores aumentam a expressão dos genes.

 Regulação negativa: repressores diminuem a expressão dos genes por ligação ao gene
operador que impede a ligação da RNA polimerase.
GENES
 Genes indutíveis: baixos níveis de expressão por presença de repressor ou falta de

indutor. Geralmente estão associados a reações catabólicas relacionadas com glúcidos.
Ex.: operão lac.
 Genes reprimíveis: altos níveis de expressão por falta de repressor ou presença de
indutor. Geralmente associados a reação anabólicas associadas a substâncias
essenciais à célula, como os aminoácidos. Ex.: operão trp.
45
46
VI - SISTEMAS BIOLÓGICOS
Na Engenharia Genética temos de começar com uma matéria-prima que vai ser o organismo que
queremos recombinar/ modificar – sendo esse o nosso sistema biológico –, e com um gene de
interesse que queremos exprimir nesse mesmo organismo. Para tal, é preciso estudar e
conhecer as tecnologias de recombinação que se apliquem ao organismo produtor e ao
recombinante em questão. Vamos ter ainda de fornecer a esse sistema biológico os nutrientes
necessários à sua sobrevivência que vão ser convertidos no nosso produto por parte dos
microrganismos.
Juntando todos estes conceitos básicos vamos desenvolver um sistema de produção do nosso
recombinante e ainda um sistema de extração e purificação do nosso produto.
Vamos então ver os organismos que podemos usar como sistemas biológicos num processo de
Engenharia Genética, os quais podem ser procariotas, eucariotas ou tecidos eucariotas.
PROCARIOTAS
E. COLI
É o microrganismo mais utilizado na área da recombinação genética e é a primeira escolha para

o processo de transformação, isto porque possui várias características que a tornam vantajosa:
 Rápido crescimento
 Não é patogénico, embora antigamente se considerasse o contrário pois, sendo
característica do intestino humano – é um organismo comensal do nosso corpo –, pode
provocar doenças e até a morte se migrar para outros locais do corpo. Atualmente só
poderá ser patogénico se houverem más práticas laboratoriais.
 É aeróbio e por isso o rendimento energético é maior, mas também é anaeróbio
facultativo o que possibilita que a cultura continue viável em laboratório mesmo se
houver um erro, por exemplo, na agitação do meio (embora as células à superfície
cresçam mais por estarem a trabalhar em aerobiose, as do meio também crescem).
 Cresce em meios de cultura de simples obtenção (complexos), que são mais fáceis
e baratos de obter.
Quando não se pode usar a E. coli (ex.: como não tem Complexo de Golgi nem RE não
conseguimos obter uma proteína glicosilada), geralmente recorre-se a leveduras ou células
animais.
Contudo, existem ainda outras bactérias passíveis de se usarem neste ramo da ciência, tais
como Bacillus, pseudomonas, rizóbios, estreptomices, etc., embora sejam mais difíceis de
manipular.
47
EUCARIOTAS
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Embora venha em segundo relativamente à E. coli, esta levedura é a primeira opção eucariótica
a que se recorre quando não é possível a utilização da bactéria E. coli.
 Taxa de crescimento elevada

 É uma levedura unicelular não patogénica.
 Tem sistema de membranas intercelulares – sistema modelo de eucariotas.
 Cresce em meios de cultura de simples obtenção (complexos).
 O seu genoma é conhecido e permitem a formação de cromossomas artificiais (YAC)
que são vetores de clonagem alternativos aos plasmídeos.
NOTA: As leveduras não fazem uma fermentação completa pois a partir de um teor de álcool
elas morrem, sendo este limite característico de cada levedura. É por isso que para diferentes
bebidas alcoólicas se utilizam diferentes leveduras. Fermentações que durem mais tempo
permitem a produção de mais álcool e o produto resultante fica mais ácido. Contrariamente, se
durar pouco tempo, a bebida fica mais doce.
Geralmente as S. cerevisiae resolvem o “problema” da E. coli, mas quando isso não acontece
precisamos de recorrer a outras leveduras ou a tecidos eucarióticos.
TECIDOS EUCARIÓTICOS
 Culturas primárias: culturas de células feitas diretamente a partir de tecidos

animais/vegetais, como por exemplo os hepatócitos. Não temos garantia que estas
células não morrem a meio do processo de recombinação e por isso não se aplicam na
área da Biotecnologia.
 Estabelecidas em cultura (estabilizadas): as células estabelecidas são transformadas,

pelo que se considera este um método cancerígeno, teoricamente. Na prática, contudo,
não é o que se observa.
 Têm um crescimento lento (~ 16-24 horas por geração).
 São cultivadas no fundo dum fraco e não em suspensão (como a E. coli) e por
isso têm pouco espaço, atingindo rapidamente a confluência o que resulta
num nº de gerações limitado e numa densidade mínima de células. Na
confluência tem-se de fazer uma passagem de células para outro meio.
 Têm exigências nutricionais significativas, pois crescem em meios simples que
são difíceis de obter.
 O risco de contaminação da cultura é maior.
 São exemplos de células usadas:

 Células de mamíferos – são as mais usadas e a 1ª opção para o processo de
recombinação genética.
 Células de insetos – são muito importantes e a 2ª opção no mercado para o
processo de recombinação genética.
 Células de plantas – são difíceis de manipular devido à parede celular, tendo
de se obter primeiro protoplastos antes de proceder à recombinação.
48
VII - ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
CLONAGEM MOLECULAR
A clonagem molecular é uma técnica de extrema importância

a nível da Engenharia Genética que permite selecionar uma
cópia de uma região específica do genoma e produzi-la em
quantidades ilimitadas.
As bactérias contêm plasmídeos, os quais podem ser usados

como vetores de clonagem. Chamamos então vetor
plasmídico a pequenas moléculas circulares de DNA
derivadas de plasmídeos naturais de bactérias.
Para proceder à clonagem:
1) Identificar DNA que nos interessa para o processo e extraí-lo do organismo dador.
2) Fragmentar o DNA que queremos clonar, e cortar os plasmídeos a usar como vetor,
utilizando as mesmas enzimas de restrição, o que vai permitir compatibilidade de
extremidades. (são endonucleases que tornam o DNA em cadeia simples, formando
extremidades com cadeias específicas que vão ser complementares).
3) Devido à especificidade do corte é possível o emparelhamento por complementaridade
de bases entre o fragmento de DNA e o plasmídeo.
4) A ligação dos quatro extremos é feita pela enzima DNA ligase, obtendo-se assim um
novo plasmídeo recombinante.
5) O plasmídeo recombinante é introduzido numa bactéria hospedeira por transformação
(ou conjugação ou transdução) que o vai encarar como DNA plasmídico normal e replica-
o de igual forma como o resto do seu material genético, sendo assim possível criar
milhões de cópias desse plasmídeo (por hereditariedade, ou seja, as células-filhas
também o vão ter).
6) Selecionar os transformantes das células-filha que não ficaram com o plasmídeo por
erros na replicação, e preservação dos mesmos.
Este processo não ocorre com 100% de sucesso,

sendo isso, na verdade, bastante raro. É então
necessário selecionar os plasmídeos que ficaram
recombinados corretamente.
Geralmente com o fragmento de DNA a clonar é

colocado ainda no plasmídeo um gene que confira
resistência a um antibiótico (por exemplo, a
informação genética adicionada pode codificar
uma proteína que degrada o antibiótico). Para
selecionar os plasmídeos recombinantes basta
submeter as bactérias ao dito antibiótico e
selecionar aquelas que sobrevivem – significa que
possuem o plasmídeo recombinante.
49
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Não são, como se possa pensar, um produto de laboratório, embora sejam de extrema
importância em Engenharia Genética!
As enzimas de restrição são endonucleases que existem nas bactérias como mecanismo de
defesa que as protege de agressões de outros DNAs externos, impedindo que estes a
transformem, sendo que cada bactéria tem a sua própria enzima de restrição. Estas atuam
restringindo/ cortando os ácidos nucleicos infeciosos.
Elas existem nas células sempre associadas a sistemas de modificação: enzimas de

modificação – metilases – as quais colocam resíduos de metilo nos locais que são
reconhecidos pelas enzimas de restrição no DNA celular para que este não seja afetado pelas
enzimas de restrição erradamente, ou seja, protegem o DNA próprio da célula para que não seja
destruído juntamente com o viral.
G | AATTC
Local de atuação da enzima de restrição.

Caso um dos outros ácidos nucleicos
estivesse metilado, a enzima de restrição já
não reconhecia o seu local e não atuava.
As enzimas de restrição cortam sempre num local específico de uma sequência específica, que
são próprios de cada enzima. Numa sequência de nucleótidos (sempre escrita na direção 5’3’)
pode-se representar o local do corte feito pela enzima de restrição de várias maneiras.
Vamos usar o exemplo da sequência utilizada acima, sendo que a enzima atua entre o nucleótido
G e os dois As – sequência e locais SEMPRE reconhecidos pela enzima Eco RI.
5′
𝐺 ↓ 𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶 3′
𝐺: 𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶
𝐺|𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶
𝐺 𝑉 𝐴𝐴𝑇𝑇𝐶
NOTA: As enzimas de restrição cortam sempre as duas cadeias da molécula de DNA, fazendo
com que as extremidades fiquem em cadeias simples.
NOMENCLATURA DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
As enzimas de restrição são tipicamente identificadas por 3 letras que representam,

respetivamente, o género, a espécie e a estirpe, e ainda 1 número que simboliza a ordem da
descoberta. São exemplos:
 Hpa I / Hpa II: Haemophilus parainfluenza

 Eco RI / Eco RII: Escherichia coli R
50
TIPOS DE ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Tipo I
São complexas, multiméricas e combinam sistema de restrição e modificação, sendo que os

mesmos complexos enzimáticos reconhecem uma sequência de DNA e modificam-na e cortam-
na.
 Como não queremos as células modificadas não nos interessam nesta área.
 Cortam o DNA de forma random a partir da sequência de reconhecimento.
Tipo II
Estão são as enzimas de restrição utilizadas em laboratório, sendo as únicas tecnologicamente

interessantes porque são pequenas, diversificadas e fáceis de manipular.
 Reconhecem sequências palindrómicas:

sequências em que a complementar é igual à
original, mas em sentido contrário, ou seja,
como as cadeias são antiparalelas, lidas na
mesma direção são iguais. Estas podem ser:
 Contíguas (GAATTC): ganham uma
estrutura particular – estrutura
cruciforme – a qual é reconhecida
pelas enzimas de restrição.
 Não contínuas (GCCNNNNNNGGC):
também adquirem a estrutura
cruciforme mas não são úteis para a
Engenharia Genética.
 Cortam em posições bem definidas,
frequentemente dentro ou na periferia (muito próximo) da sequência de reconhecimento.
 Têm apenas atividade de endonuclease e não de modificação das células.
Tipo III
 São grandes e combinam também restrição e modificação.

 Cortam fora da sequência de reconhecimento e raramente têm digestões completas.
 Não são interessantes para a Engenharia Genética.
Tipo IV
 São grandes e combinam também restrição e modificação.

 Cortam fora das sequências de reconhecimento e estas são contíguas ou descontínuas.
 Não são interessantes para a Engenharia Genética.
51
TIPOS DE EXTREMIDADES OBTIDAS PELAS ENZIMAS
As enzimas de restrição hidrolisam as ligações nucleotídica fosfodiéster entre o grupo fosfato e

grupo hidroxilo, gerando uma extremidade 3’-OH e uma extremidade 5’-P.
 Se o local de clivagem não é no centro, a

enzima gera extremos coesivos (“sticky
ends”), que podem emparelhar com outros
fragmentos digeridos pela mesma enzima.
Estes extremos são mais fáceis de ligar pois
a clivagem é assimétrica e ficam bases
desemparelhadas – formam-se extremidades
de cadeia simples.
 Se o local de clivagem é no centro, a enzima gera extremos

cegos (“blunt ends”) pois a clivagem é simétrica. Não são
interessantes na área da Engenharia Genética e
Recombinação.
52
Enzimas correlacionadas
Isosquizómeros: são enzimas que reconhecem a mesma sequência palindrómica mas uma
gera extremos cegos e outra gera extremos coesivos que, por isso, não são compatíveis.
 Xma I (C|CCGGG) / Sma I (CCC|GGG)

 Hpa II (C|CGG) / Msp I (C|CGG ; C|C*GG)
Isocaudómeros: são enzimas que reconhecem sequências palindrómicas diferentes mas geram
extremos coesivos compatíveis que se ligam.
 Bam HI (G|GATCC) / Sal 3 AI (|GATC)  O extremo compatível é GATC.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO “MAIS ÚTEIS”
As enzimas de restrição “mais úteis” são aquelas que…
 Reconhecem sequências palindrómicas.

 Reconhecem um nº de bases par (4 ou 6) – há enzimas que reconhecem nº de bases
ímpar, mas não são interessantes na área da Engenharia Genética. As mais úteis são
aquelas que reconhecem 4 ou 6 bases (é mais fácil encontrar sequências mais
pequenas), pois as que reconhecem mais bases são muito específicas e só são
aplicadas em processos em que conhecemos exatamente a sequência de nucleótidos.
 4 bases: gera fragmentos estatísticos de 256 nts.
 6 bases: gera fragmentos estatísticos de 4096 nts.
 Geram extremos coesivos
 Reconhecem sempre a mesma sequência particular
 Têm uma grande capacidade de digerir o DNA
 Têm elevada pureza enzimática e elevada atividade específica.
São exemplos de enzimas de restrição:
53
MAPAS DE RESTRIÇÃO
Os mapas de restrição são uma compilação do número, ordem e distância entre os locais de
corte de uma enzima de restrição ao longo de um segmento de DNA clonado.
 As unidades do mapa são expressas em pares de bases (ou para distâncias mais longas
em pares de kilobases).
 Geralmente o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido.
Digestões simples: DNA digerido por apenas uma enzima de restrição. Faz-se uma
determinação relativa das orientações dos fragmentos no DNA linear.
Digestões múltiplas: DNA digerido por mais de uma enzima de restrição. Determinam-se as
posições dos fragmentos de DNA produzidos pelas enzimas por eletroforese.
Quando se faz uma digestão simples apenas se sabe em quantos fragmentos de DNA surgem
da digestão com um determinado enzima, o que corresponde com o nº de locais de atuação das
enzimas de restrição. Contudo, há diversas hipóteses dos locais de corte.
 Se for um DNA circular e tiver apenas um local de corte, vai resultar num fragmento que
é o plasmídeo original.
54
Para saber os locais de corte exatos tem-se de fazer uma múltipla digestão (neste caso dupla).
Com esta informação somos capazes de construir um mapa de restrição.
LIGAÇÃO DOS FRAGMENTOS
Annealing: as extremidades dos fragmentos de DNAs em cadeia simples unem-se numa ligação
fraca por pontes de hidrogénio.
Ligase: enzima que forma ligações fosfodiéster fortes entre os nucleótidos dos vários
fragmentos.
OUTRAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS
Fosfatase alcalina: enzima remove grupo fosfato da extremidade 5´ das moléculas de DNA.
DNase I: enzima que degrada DNA em dupla cadeia por hidrolisação interna das ligações
fosfodiéster.
E. coli exonuclease III: enzima que remove nucleótidos dos extremos 3’-OH de moléculas de
DNA.
55

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Engenharia Genética F1

I- IMPORTÂNCIA DA ENGENHARIA GENÉTICA

A engenharia genética baseia-se em:

Historicamente, são datas importantes para a engenharia genética:

1900 – Leis de Mendel da hereditariedade

ENGENHARIA GENÉTICA VS BIOTECNOLOGIA

Na Engenharia Genética existe todo um processo laboratorial de recombinação do material

Noutras palavras, a Engenharia Genética é a aplicação dos conceitos de funcionamento

“Food”: alimentação humana e animal; engloba animais mutificados, alimentos transgénicos

 O algodão transgénico possui um gene de resistência a infestação de larvas.

 Etanol: gasolina + etanol (90:10).

 Hidrogénio: as hidrogenases bacterianas retiram o hidrogénio da água, ou seja, a

“Feedstock”: aplicações ambientais e de biorremediação, no âmbito em que a biotecnologia

“Pharmaceuticals”: engloba terapias humanas, medicamentos/ vacinas e diagnósticos. É o

 Medicamentos: os biológicos vão interferir com o sistema imunitário. Consistem em:

ENGENHARIA GENÉTICA NO FUTURO

Célula procariota Célula eucariota

FUNCIONAMENTO DAS CÉLULAS

 A polémica que surgiu da criação de uma bactéria artificial baseou-se em colocar um

As células funcionais movimentam, no seu

 Replicação: ocorre em células quando estas adquirem condições específicas, sendo um

A CONSTRUÇÃO DAS CÉLULAS Moléculas inorgânicas (CO2, NH2, H2O)

Esta quote não é totalmente Sistemas supra-moleculares (membranas,

Célula (bactérias, algas, fungos,

As macromoléculas são somatórios de monómeros e não funcionariam umas sem as outras

 As proteínas (como enzimas) são somatórios de aminoácidos;

Existem ainda macromoléculas complexas que compreendem as nucleoproteínas,

As proteínas resultam da condensação de aminoácidos em que existe uma ligação peptídica

 Moléculas constituídas por 2-10 aminoácidos são chamadas de péptidos. As proteínas

Estrutura das proteínas

Funções das proteínas

 Estrutural (colagénio, queratina)

O material genético – DNA

Os ácidos nucleicos, no geral, são compostos por 4 nucleótidos

NOTA: Os nucleótidos podem considerar-se ésteres fosfatados de nucleósidos, que são

 Forma : é a mais frequente, sendo helicoidal para a

Os eucariotas adotaram a estratégia de ter o seu genoma “partido em pedaços” em

Dentro do núcleo dos eucariotas, nos cromossomas, o DNA

 Primeiramente as proteínas formam dímeros entre si e

Propriedades físico-químicas do DNA

 Viscosidade: propriedade intrínseca ao DNA que se deve à abertura e fecho do mesmo,

Sequência única Sequências repetitivas

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

1) Replicação/ Duplicação do material genético (DNA ou RNA)

III - PRESERVAÇÃO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA

 Para passar à fase S, as células são sujeitas a vários

A replicação é um mecanismo que permite a O processo de duplicação de DNA e

A helicase abre quimicamente a cadeia molde de DNA, quebrando as pontes de H entre as

As proteínas SSB (“Single-stranded DNA binding proteins”) ligam-se às cadeias molde

Em seguida, a RNA primase liga-se à cadeia de DNA e sintetiza 1 primer ou iniciador

 Os primers são sempre pequenas moléculas de RNA (5-12 nucleótidos); só em

A DNA polimerase III vai continuar o processo, fixando-se na

 A DNA polimerase III só replica no sentido 5’3’ (sentido

NOTA: Os fragmentos vermelhos

Cada cópia da molécula de

A cadeia de síntese descontínua (“cadeia atrasada”) com

1) A RNA primase vai sintetizar primers de RNA (complementares à cadeia de DNA) na

 O telómero de cromossomas humano é composto por uma sequencia de DNA TTAGGG

NOTA: A DNA polimerase I também atua na cadeia contínua,

cadeia também terá o “problema” dos telómeros.

Existem vários tipos de origens de replicação, tal como mostra a imagem.

 Nos eucariotas existem ainda regiões de