DESCRIÇÃO

Histórico do desenvolvimento da biotecnologia e da engenharia genética, seus desafios, apresentação

da clonagem molecular e suas aplicações em saúde humana.

PROPÓSITO
Entender as ferramentas de biotecnologia aplicadas à engenharia genética e seus desafios práticos e
éticos é fundamental para aplicações avançadas na manipulação de organismos na agroindústria,
ecologia e Medicina.

OBJETIVOS

MÓDULO 1

Identificar conceitos-chave em biotecnologia e seus desafios éticos

MÓDULO 2

Distinguir as ferramentas usadas para manipulação genética de organismos

MÓDULO 3

Reconhecer aplicações da tecnologia do DNA recombinante

INTRODUÇÃO
Uma das áreas em rápida expansão da Biologia é a biotecnologia. Por definição e convenção
internacional, a biotecnologia é entendida como o uso de processos biológicos dos seres vivos, como
plantas, animais e micro-organismos, para avanço tecnológico médico, industrial e agrícola. Nesse
sentido, a biotecnologia tem sido utilizada pela humanidade há milênios, especialmente pelo uso de
micro-organismos para produção de comida (pães, bolos, vinhos, cervejas e queijos) por fermentação, e
melhoramento de produtos animais e vegetais por meio de cruzamentos seletivos. Pequenos usos que,
inicialmente, permitiram a produção de alimentos mais duradouros do que os grãos originais e, a longo
prazo, abriram caminho para o desenvolvimento social e tecnológico da humanidade.

Atualmente, o termo biotecnologia é usado comumente para se referir a modificações e melhoramentos

genéticos de animais, plantas e micro-organismos, com intuito de obtenção de produtos. Por isso, o
termo acaba se sobrepondo à engenharia genética, que dispõe de um conjunto de ferramentas de alta
tecnologia para a modificação e edição de genes nos mais diversos organismos – objeto do estudo a
seguir.

MÓDULO 1

 Identificar conceitos-chave em biotecnologia e seus desafios éticos

INTRODUÇÃO
Há milênios a humanidade vem usando processos biológicos para a geração de produtos. Comidas e
bebidas fabricadas por fermentação são exemplos de produtos biotecnológicos (no sentido mais amplo)
que eram feitos sem se saber como. Nossos antepassados apenas sabiam que deixar cereais e sucos
em ambiente vedado, sem contato com o ar do exterior, resultaria no crescimento de massas e na
produção de bebidas com álcool. Conforme avançamos científica e tecnologicamente, conseguimos não
apenas entender melhor os processos biológicos, como também melhorá-los e modificá-los.

Foto: Shutterstock.com

CONCEITOS E HISTÓRICO DA BIOTECNOLOGIA

Existem evidências que datam de mais de 8 mil anos sobre fermentação alcoólica para produção, na
China, de cervejas feitas de arroz, uvas e mel. Mais antigo ainda, originado no Oriente Médio, o pão tem
sido fabricado a partir de trigo, água, fermentação e calor por mais de 9 milênios.

Foi após a invenção do microscópio óptico (Invenção do século XVII) que a humanidade soube que a
fermentação acontece pela ação de micro-organismos – especificamente, as leveduras e bactérias –
descoberta feita pelo notório cientista Louis Pasteur, no século XIX.

A fermentação consiste no processo bioquímico de produção de energia pela quebra de açúcares dentro
das células, em ambiente anaeróbico. Para se manter viva, a célula precisa que seu metabolismo esteja
ativo e, para isso, necessita de energia. A principal fonte de energia usada pela célula é a quebra da
glicose, em um processo chamado de glicólise.
Imagem: Shutterstock.com
 Esquema simplificado da glicólise, e fermentação láctea e alcoólica.

A quebra da glicose gera piruvato, ATP e elétrons livres. Estes últimos são carregados por compostos

orgânicos (nicotinamida adenina dinucleotídeo – NAD+), na forma reduzida (NADH+H+). Para ser

reutilizado pela célula, NADH+H+ precisa passar esses elétrons adiante.

PIRUVATO

Na glicólise, uma molécula de glucose gera duas moléculas de piruvato, cada uma com três
carbonos.

ATP

É uma das principais formas de energia química da célula; sua quebra em ADP+Pi gera energia
para diversas reações biológicas.

Na presença de oxigênio, as células podem usá-lo como o aceptor (ou receptor) final dos elétrons
através da cadeia respiratória. Quando não há oxigênio disponível, o processo de transferência de
elétrons para um aceptor final é chamado de fermentação.

Existem ao menos dois tipos principais de fermentação: o piruvato pode ser reduzido a lactato, na
fermentação láctica; ou pode ser reduzido a acetaldeído e, posteriormente, a álcool (fermentação
alcoólica) – neste último tipo, há liberação de dióxido de carbono (CO2), que faz a massa do pão

“fermentar”. Em ambos os casos, o NADH+H+ retorna a NAD+, e rejeitos biológicos (lactato e álcool) são
apreciados como alimento ou bebida.

Todas as etapas descritas envolvem enzimas, que são proteínas com a função de catalisar (ou acelerar)
uma reação química. Elas podem ser classificadas em dois tipos:

As enzimas que quebram macromoléculas em moléculas menores, mais simples, são chamadas de
catabólicas (dentre as quais encontramos as enzimas digestivas).

As enzimas que catalisam reações de formação das macromoléculas são chamadas de anabólicas.

Frequentemente, as enzimas são utilizadas em diferentes aspectos e níveis da biotecnologia, além da

fermentação.

O domínio do processo de fermentação e a descoberta dos mecanismos celulares por meio dos quais
ela acontece foram o ponto de partida para o desenvolvimento da biotecnologia moderna. Nós
aprendemos que podemos melhorar organismos complexos, por exemplo, ao cruzarmos plantas com
características desejáveis e selecionarmos aquelas que satisfaçam nosso objetivo.

Os princípios genéticos aprendidos por Gregor Mendel e outros cientistas do passado pavimentaram o
caminho para descobertas futuras: na primeira década do século XX, o botânico dinamarquês Wilhelm
Johannsen revisitou os trabalhos de Mendel e chamou pela primeira vez as unidades hereditárias de
genes, termo derivado do grego genos = nascimento, origem. Ele também cunhou os
termos genótipo (Características genéticas) e fenótipo (Características físicas) .

Na década seguinte, o biólogo Thomas Hunt Morgan conseguiu definir experimentalmente que os
cromossomos eram as estruturas físicas em que os genes estão, ao estudar os cromossomos sexuais
da mosca Drosophila melanogaster . A descoberta dos cromossomos, no entanto, foi feita meio século
antes, por Walther Flemming, mas nomeados da forma como conhecemos hoje por Heinrich Waldeyer.

No final da década de 1920, Frederick Griffith, estudando uma forma de vacina contra pneumonia
causada por Streptococcus pneumoniae , em ratos, acabou descobrindo o que chamou de “princípio
transformante”. Nesse experimento, Griffith misturou uma cepa de S. pneumoniae não patogênica com
uma solução contendo S. pneumoniae patogênica e a inoculou nos ratos. Os animais morreram e
Griffith recuperou bactérias morfologicamente idênticas às vistas na cepa patogênica. Muito embora sem
saber do que se tratava na época, sua descoberta teve imenso impacto em biotecnologia, como você
verá adiante.

Quase duas décadas depois, três cientistas – Oswald Avery, Maclyn McCarty e Colin MacLeod –
descobriram que o “princípio transformante” e toda informação genética em geral estão contidos no
DNA.
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Um grande marco para a ciência foi a descoberta da estrutura molecular da informação genética. Na
década de 1950, os pesquisadores Rosalind Frankling, Thomas Watson e Francis Crick identificaram a
estrutura tridimensional do DNA.

A partir do conhecimento da estrutura molecular da informação genética, sua regulação, expressão e

funcionamento, vieram os primeiros trabalhos sobre sua alteração artificial. Na década de 1970, a
companhia americana Genentech, fundada por Robert Swanson e Herbert Boyer, começou a modificar o
DNA diretamente in vitro (em uma placa de petri e em um laboratório).

Isso só foi possível após a colaboração de Boyer e Stanley Cohen, que resultou no descobrimento do
que hoje chamamos de recombinação de DNA. Iniciamos a era da engenharia genética, área que
corresponde à grande parte daquilo que consideramos biotecnologia moderna e compreende as
técnicas de clonagem molecular e DNA recombinante.

TÉCNICAS DE CLONAGEM MOLECULAR E DNA

RECOMBINANTE

As técnicas de clonagem molecular e de DNA recombinante nos permitiram mudar geneticamente

organismos unicelulares, como bactérias e leveduras.
A partir da década de 1980, os primeiros organismos complexos, as plantas, foram alterados em seus
genes – chamamos de organismos geneticamente modificados. Existem dois grupos principais de
OGM: aqueles que tiveram genes de outras espécies transferidos para o seu genoma, chamados de
transgênicos; e aqueles que tiveram seu genoma modificado em geral, não necessariamente tendo sido
feita uma transferência permanente de genes de outras espécies.

ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS

OGM (organismos geneticamente modificados, ou genetically modified organisms – GMO, em

inglês) é como são chamados os seres vivos modificados artificialmente.

Em 1983, foi apresentada ao mundo a primeira planta geneticamente modificada com a transferência de
um gene de resistência a antibióticos (vindo da bactéria Agrobacterium tumefaciens ) para a planta do
tabaco (Nicotiana tabacum ). Alguns anos depois, a primeira planta do tabaco, resistente a herbicidas,
foi divulgada.

Ainda na mesma década, os primeiros animais foram clonados a partir de células embrionárias e, em
1996-97, o primeiro animal clonado a partir de células somáticas foi noticiado – a ovelha Dolly.

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Na mesma época, começou um grande esforço internacional para o mapeamento do genoma humano
completo, o Projeto Genoma Humano. A partir do conhecimento detalhado do genoma humano, novas
fronteiras se abriram para compreensão, prevenção e tratamento de doenças genéticas.

Já no século XXI, grandes avanços em terapias gênicas em humanos estão sendo feitos de forma
majoritariamente experimental. A aprovação emergencial de vacinas de RNA para o SARS-CoV2, no
final de 2020 e início de 2021, deve entrar como mais um grande marco histórico e científico no avanço
da biotecnologia.

TIPOS E MODELOS DE BIOTECNOLOGIA

Como se pode ver, as aplicações da biotecnologia têm crescido em diversos contextos. Grandes setores
da economia mundial, como indústria farmacêutica, energia sustentável, agronegócio, e a Medicina, têm
sido beneficiados pela evolução biotecnológica das últimas décadas. Para facilitar o estudo das diversas
áreas que exercem e se beneficiam da biotecnologia, vamos identificá-las usando um sistema de quatro
cores, expandido posteriormente, e exemplificaremos algumas aplicações.
Imagem: Shutterstock.com.

BIOTECNOLOGIA VERMELHA

Uma das mais importantes áreas de atuação da biotecnologia moderna é a Medicina. O crescente
conhecimento de doenças genéticas e do próprio genoma humano visto nas últimas décadas é
consequência de avanços biotecnológicos. Ao mesmo tempo, é uma das principais forças propulsoras
dos mesmos avanços; o interesse em termos de mais conhecimento sobre os detalhes do nosso
funcionamento saudável e patológico, junto à necessidade de melhores estratégias diagnósticas e
terapêuticas, motiva o desenvolvimento técnico-científico que está na base da biotecnologia.

Imagem: Shutterstock.com.
Diversos são os exemplos do uso da biotecnologia medicinal. O mais conhecido deles é, talvez, a
fertilização in vitro . Nesse procedimento, a fecundação do gameta feminino pelo masculino é feita fora
do organismo, e o embrião resultante é inserido no útero da mulher posteriormente.

Outro exemplo do uso da biotecnologia na Medicina é o diagnóstico. Doenças genéticas e infecciosas,

por exemplo, podem ser identificadas por amplificação do DNA ou seu sequenciamento; em ambos os
casos, há uso de processos biológicos que ocorrem in vitro para obtenção de um produto: o diagnóstico.

Uma das áreas em rápida expansão da biotecnologia vermelha é a terapêutica e prevenção, objeto do
estudo no vídeo.

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AVANÇOS DA BIOTECNOLOGIA VERMELHA
A especialista Camila Baez fala sobre os avanços obtidos até hoje na biotecnologia vermelha

BIOTECNOLOGIA VERDE

A agropecuária é um dos setores que mais lucraram com as aplicações da biotecnologia. Na década de
1970, aconteceu a chamada “Revolução Verde”, com o uso da modificação genética de plantas para
aumento de produtividade – o que poderia potencialmente acabar com a fome no mundo todo. Na
prática, vimos a introdução de plantas modificadas para aumento de produtividade, de modo a reduzir
custos e aumentar a rentabilidade do cultivo.


  EXEMPLO

O uso de biotecnologia para aumentar a produção de colheitas e do gado pode se dar de diversas formas.
Por exemplo, construindo OGM ao transferir genes de resistência a parasitas ou a agrotóxicos, em plantas
que antes eram suscetíveis. Plantas como o milho e a soja podem ser modificadas com a adição do gene Bt
(da bactéria Bacillus thuringiensis ), o que as torna mais resistentes a insetos como borboletas e moscas.
Assim, menores perdas na produção de cereais são registradas, e usa-se e gasta-se menos com inseticidas,
o que torna a colheita mais produtiva e sustentável.

As plantas também podem ser geneticamente modificadas para conferir maior resistência a condições
ambientais desfavoráveis e até mesmo mais extremas, como secas e geadas. Esses avanços são
particularmente interessantes frente às mudanças climáticas que o planeta enfrenta, e podem
representar uma expansão do território cultivável no mundo.

Foto: Shutterstock.com.

Além disso, podemos produzir cereais com melhor armazenamento e maior qualidade nutricional: já foi
identificado um gene do tomate que, quando modificado, aumenta o tempo de armazenamento e sua
resistência a patógenos. O enriquecimento de nutrientes em plantas por meio da biotecnologia verde
também tem progredido.

Você pode aprofundar seu estudo das diversas frentes em que a biotecnologia verde tem sido usada, no
Brasil, no material complementar citado no item Explore+.

BIOTECNOLOGIA BRANCA

Há aplicação da biotecnologia também na indústria. Em sua maioria, essas indústrias trabalham

agregando valor a produtos derivados de plantas e animais (modificados geneticamente ou não) por
meio de processos biológicos. A biotecnologia branca apresenta certa sobreposição aos outros tipos de
biotecnologia; por isso, vamos focar apenas em alguns de seus produtos.

A indústria utiliza especialmente os micro-organismos e suas enzimas como biocatalizadores.


 EXEMPLO

Nessa categoria se encaixam as fermentações alcoólica e láctica usadas na produção de cervejas, vinhos,
pães, iogurtes e queijos, mas não se restringe a esses produtos. Os organismos envolvidos como
biocatalizadores também podem ser modificados geneticamente para aumentar a produtividade e a
resistência a fatores ambientais como temperatura, pH, e até mesmo parasitas celulares.

O uso da biotecnologia branca por vezes tende a substituir processos químicos nocivos ao ambiente e
representa uma opção mais sustentável e moderna. Veja o exemplo:

PRODUÇÃO DO BIOCOMBUSTÍVEL ETANOL

Foto: Shutterstock.com

A produção do biocombustível etanol a partir da fermentação dos açúcares presentes na cana-de-

açúcar, como opção mais sustentável a combustíveis derivados do petróleo, uma vez que emite menos
gases do efeito estufa com sua queima. Da mesma forma, tecnologias para produção de biogás também
têm sido desenvolvidas a partir da palma-de-óleo (também conhecida como óleo de dendê). Para tratar
a água efluente desse processo, são usadas microalgas produtoras de biomassa (que pode ser
aproveitada na produção de energia, pigmentos, ração animal, ou como fertilizante) em fotobiorreatores
(reator biológico que usa luz – normalmente solar – e organismos fototróficos para fixação de CO2 em

hidratos de carbono).

Como se pode ver, a biotecnologia branca permeia diversas outras indústrias, como a de alimentos,
energia, sustentabilidade, e se expande para outras, como a indústria têxtil, a médica e a biotecnologia
azul.

BIOTECNOLOGIA AZUL

A utilização dos processos biológicos da rica e largamente desconhecida biodiversidade marinha é

denominada biotecnologia azul. Por vezes, o oceano representa um ambiente hostil para nós, mas
pujante em vida, que pode fornecer informações e soluções inovadoras e sustentáveis à humanidade. A
biotecnologia azul pode ser usada por outras biotecnologias, fornecendo ferramentas para solucionar
questões medicinais, agropecuárias e industriais.

Um exemplo de processos biológicos de organismos marinhos posteriormente usados na ciência foi a

identificação de uma proteína verde fluorescente (green fluorescente protein – GFP), e de seu gene, a
partir da água-viva Aequorea victoria ). Desde então, a GFP tem sido usada em inúmeros estudos
científicos que proporcionaram imenso avanço médico e biológico.

Foto: Shutterstock.com.

Além disso, produtos marinhos podem ser usados na produção de energia renovável e sustentável por
meio de fotobiorreatores e de biodiesel. A biomassa resultante pode ser usada para nutrição animal ou
na fertilização de campos. Em adição, no oceano encontramos bactérias capazes de degradar derivados
do petróleo. Contudo, o ambiente marinho permanece largamente desconhecido e outras potenciais
aplicações de sua biodiversidade para solução de questões humanas ainda devem surgir.

Existem ainda outros tipos de biotecnologia, veja abaixo:

AMARELA
CINZA
MARROM
DOURADA
ROXA
PRETA

AMARELA

É a biotecnologia usada na produção e no melhoramento de alimentos.

CINZA

Biotecnologia aplicada à preservação, proteção e recuperação ambiental.

MARROM

Biotecnologia que atua no tratamento, na fertilidade e na proteção do solo.

DOURADA

Na biotecnologia dourada, encontramos a bioinformática como ferramenta de estudo de processos

biológicos.
ROXA

A biotecnologia roxa permeia todas as demais por abranger a biossegurança e a propriedade intelectual
no seu desenvolvimento e uso.

PRETA

A biotecnologia preta seria a aplicação de processos biológicos contra o ser humano como armamento
biológico. Essa biotecnologia é proibida e seu uso é considerado crime de guerra, por ser dificilmente
controlada.

BIOÉTICA E BIOSSEGURANÇA DA
BIOTECNOLOGIA
O uso de processos biológicos de organismos vivos, juntamente com a capacidade de modificá-los
geneticamente, seja por cruzamentos e seleções, indução de mutações ou por engenharia genética,
trouxe consigo desafios em dois grandes campos da Biologia: a ética e a biossegurança.

BIOÉTICA NA BIOTECNOLOGIA

Falar em engenharia genética implica pensar que, em teoria, é possível modificar todos os organismos
conhecidos: leveduras podem ser modificadas geneticamente para produzir mais enzimas e fermentar
melhor; bactérias podem ser usadas em processos industriais de larga escala e até mesmo na
biorremediação de ecossistemas; animais podem ser melhorados para produzir mais de seus produtos
derivados, ou simplesmente para ter fisiologia mais parecida com a humana; plantas também são alvo
de alteração para aumento de produção. Em teoria (e, tecnicamente, na prática), é possível modificar
geneticamente até outros seres humanos, e talvez esse seja o grande dilema ético da biotecnologia
moderna.
 BIORREMEDIAÇÃO

Uso de processos biológicos para a atenuação de contaminantes ambientais.

A edição genética em humanos, particularmente delicada no aspecto bioético, pode ser subdividida em:

Edição de células germinativas (espermatozoides, óvulos)

Edição células somáticas - células diploides que compõem tecidos e órgãos. Edição genética de
células somáticas pode ser uma opção de tratamento de doenças genéticas graves


 EXEMPLO

As células do sistema imunológico de pacientes com câncer podem ser editadas geneticamente para
aumentar sua ação contra o câncer, em uma espécie de terapia imunológica (ou imunoterapia) experimental.
Por potencialmente ter a capacidade de tratamento e cura de doenças existentes, a edição de células
somáticas enfrenta menor resistência ética do que a edição de células germinativas.

A edição de células germinativas, de forma geral, gera um organismo adulto que a tenha presente em
todas as suas células, inclusive seus gametas (óvulos ou espermatozoides), ou seja, essa edição
artificial pode ser transmitida às próximas gerações. Por mais ficção científica que isso possa parecer, a
edição de células germinativas humanas pode ser usada não apenas para evitar ou reduzir riscos de
doenças genéticas, mas também para produzir artificialmente melhoramentos físicos, estéticos e até
cognitivos àqueles que possam comprá-las.

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  VOCÊ SABIA

Recentemente, cientistas chineses chocaram o mundo científico com a divulgação do nascimento dos
primeiros bebês humanos geneticamente modificados. A repercussão desse incidente foi tamanha que a
Organização Mundial da Saúde criou um comitê especial para estabelecer limites à edição genética de
humanos. Após a comunidade científica internacional se manifestar veementemente contra a edição genética
de embriões humanos, o pesquisador chinês que liderou o estudo foi preso e condenado a três anos de
prisão e ao pagamento de multa.

Aqui, o desenvolvimento científico e tecnológico da edição de genomas esbarra em ideias eugenistas de

desenvolvimento de uma “raça” humana melhorada, livre de “imperfeições” – mas o que consideramos
imperfeições? Doenças genéticas? Limitações físicas, motoras, cognitivas e comportamentais?
Deficiências visuais, auditivas, físicas? Será que a humanidade não deveria caminhar no sentido da
aceitação e inclusão de características que podem ser taxadas como “imperfeições”, ao invés de tentar
eliminá-las artificialmente? Existem questões importantíssimas sobre as quais nós, a humanidade,
precisamos refletir e discutir com zelo para criarmos diretrizes que sejam obedecidas por todos.

Existem outros aspectos éticos importantes da biotecnologia, especialmente em animais. Os mais

comumente modificados são mamíferos e aves, que são seres sencientes – ou seja, têm sensações e
sentimentos conscientes. Em outras palavras, os animais sentem mais do que fome, frio e dor: eles têm
e expressam sentimentos básicos.

ELES TÊM E EXPRESSAM SENTIMENTOS

BÁSICOS

Podemos citar como exemplos o abanar do rabo do cachorro para seu dono e seu rosnado como
ferramenta de ameaça, ou o ronronar de gatos ao receber carinho.

Precisamos manter em vista que alguns procedimentos biotecnológicos são invasivos e dolorosos,
causam medo, desconforto, ansiedade e afetam o bem-estar do animal. Ainda assim, as legislações de
diversos países permitem não apenas tais procedimentos, como também atividades de lazer danosas
aos animais, sem que elas sejam estritamente necessárias ao desenvolvimento ou sobrevivência de
humanos.
 PROCEDIMENTOS BIOTECNOLÓGICOS

Por exemplo, a inseminação artificial usada na procriação de gado, e experimentos laboratoriais

em que camundongos são humanizados (modificados geneticamente para terem a fisiologia mais
semelhante à humana).

BIOSSEGURANÇA EM BIOTECNOLOGIA

A biotecnologia e, mais especificamente, a engenharia genética permitiram a introdução de espécies

animais e vegetais geneticamente modificados para aumentar produção, sem necessariamente
aumentar a quantidade de organismos envolvidos.


 EXEMPLO

É possível gerar uma variante bovina capaz de produzir mais músculo – e consequentemente, mais carne –
por animal. Ou alterar o genoma de vegetais que produzem os cereais para que desenvolvam espigas
maiores e mais numerosas por planta. Isso alavancou a indústria do agronegócio, uma das mais beneficiadas
pela produção de OGM.

Entretanto, a segurança à saúde humana e ambiental dos OGM e transgênicos não é conhecida. Um
dos riscos em potencial dos OGM ao ambiente é a sua introdução em ecossistemas naturais. Não se
sabe ao certo quais alterações genômicas de plantas e animais poderiam, por exemplo, gerar uma
vantagem evolutiva que leve à substituição de populações nativas e selvagens.

PENSE NESTE CASO:

Uma planta OGM que produza mais frutos e seja mais resistente ao ambiente e a parasitas pode se
tornar uma espécie invasora de um determinado ecossistema delicado e até mesmo levar à extinção em
massa de espécies nativas ameaçadas. Com relação à saúde humana, os OGM podem potencialmente
causar alergias, acúmulo de substâncias tóxicas e resistência microbiana aos antibióticos, apenas para
ilustrar algumas situações.

Por isso, organismos nacionais e internacionais regulam a produção, o uso e a comercialização dos
OGM e transgênicos. Um dos principais acordos internacionais sobre o manejo de OGM – do qual o
Brasil é signatário – é o Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança. Faz parte da Convenção sobre
Diversidade Biológica, criada na década de 1990, para proteção da biodiversidade.

O protocolo é uma ferramenta de valor legal internacional que legisla para que haja o desenvolvimento
sustentável e protetor da biodiversidade, e a equidade biotecnológica e comercial entre os países do
acordo, promovendo o comércio internacional.

Nesse contexto, o Brasil está no centro das atenções, pois temos a interseção entre o grande patrimônio
em biodiversidade, o amplo uso de OGM e o fato de sermos o maior exportador de produtos
agropecuários a assinar a convenção e o protocolo. Assim, a legislação brasileira sobre biossegurança
em OGM é espelhada nos preceitos legais do Protocolo de Cartagena.

SAIBA MAIS SOBRE A LEGISLAÇÃO BRASILEIRA

A atual lei de biossegurança em vigor é a Lei nº 11.105/2005, que dispõe sobre diversos aspectos do
uso de OGM, como sua pesquisa, produção, manipulação, seu transporte, armazenamento, comércio e
consumo, descarte e liberação no meio ambiente. Também foca em “diretrizes para o estímulo do
avanço científico em biossegurança e biotecnologia, proteção à vida e saúde humana, animal e vegetal,
e observância do princípio de precaução para proteção do meio ambiente” (LEI Nº 11.105/2005).
Aproveite o material disponível no item Explore+ para conhecer os detalhes da legislação.

Criticada por ser mais permissiva do que a Lei nº 8.794/1995, a qual substituiu, não negou, por exemplo,
nenhum pedido de aprovação de uso de OGM, tendo, inclusive, aprovado a primeira árvore GMO do
mundo. A Lei nº 11.105/2005 também traz inovações. Regulamenta, por exemplo, o uso de células-
tronco em pesquisa, incluindo aquelas com embriões humanos. Além disso, responsabiliza civil e
administrativamente infratores, e define como crimes, entre outros: a prática de engenharia genética em
células germinativas, zigotos e embriões humanos; a clonagem humana; o uso de embriões humanos e
o descarte de OGM em desacordo com a legislação.

VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. A HUMANIDADE TEM CONQUISTADO GRANDES AVANÇOS NA ÁREA
BIOLÓGICA NO ÚLTIMO SÉCULO, O QUE TORNOU POSSÍVEL A RESOLUÇÃO DE
DIVERSOS PROBLEMAS E, AO MESMO TEMPO, GEROU OUTROS. SOBRE A
BIOTECNOLOGIA, É INCORRETO AFIRMAR QUE:

A) Um dos marcos da biotecnologia moderna foi a identificação dos micro-organismos como agentes
envolvidos na fermentação.

B) A biotecnologia verde se refere ao uso de processos biológicos de criaturas marinhas ou aquáticas na

produção de itens de uso humano.

C) A identificação da estrutura do DNA contribuiu para o surgimento de um novo ramo da biotecnologia –

a engenharia genética.

D) Modificações genéticas permitiram o aumento de produtividade no cultivo de diversas plantas.

E) Os principais processos biológicos usados pela biotecnologia são catalisados por enzimas.

2. O PROTOCOLO DE CARTAGENA REPRESENTA UM ESFORÇO

INTERNACIONAL PARA O CONTROLE DA TRANSFERÊNCIA E
COMERCIALIZAÇÃO DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS. COM
BASE EM SEUS CONHECIMENTOS SOBRE BIOTECNOLOGIA, ASSINALE A
OPÇÃO CORRETA:

A) O uso de organismos geneticamente modificados é completamente seguro à saúde e ao meio

ambiente.

B) Os animais são seres sencientes e, portanto, não há impedimento ético à sua exploração biológica,
contanto que haja benefício humano.

C) A legislação vigente no Brasil define como crime a modificação genética de células germinativas e
zigotos humanos.

D) Na China, a manipulação de células germinativas e embriões humanos é legalizada. D

E) O Protocolo de Cartagena defende o progresso da biotecnologia em preterição da sustentabilidade e,

por isso, foi banido do Brasil.

GABARITO

1. A humanidade tem conquistado grandes avanços na área biológica no último século, o que
tornou possível a resolução de diversos problemas e, ao mesmo tempo, gerou outros. Sobre a
biotecnologia, é incorreto afirmar que:

A alternativa "B " está correta.

O uso da biodiversidade marinha e seus processos biológicos na produção de diversos itens de

consumo e uso humano são classificados como biotecnologia azul. Entende - se por biotecnologia verde
o uso na agroindústria.

2. O Protocolo de Cartagena representa um esforço internacional para o controle da transferência

e comercialização de organismos geneticamente modificados. Com base em seus
conhecimentos sobre biotecnologia, assinale a opção correta:

A alternativa "C " está correta.

A Lei nº 11.105/2005 classifica como crimes a manipulação genética de embriões humanos, salvo
exceções, assim como a edição genética de células germinativas, zigotos e embriões humanos.

MÓDULO 2

 Distinguir as ferramentas usadas para manipulação genética de organismos

GENÉTICA APLICADA À BIOTECNOLOGIA

Como você viu, a biotecnologia tem sido largamente aplicada em diversas áreas e permitiu um
desenvolvimento técnico e científico sem precedentes na Biologia de forma geral. Em especial, a
capacidade de modificarmos genomas de inúmeras espécies de plantas, animais, fungos e bactérias
tem sido estratégica para o desenvolvimento observado.

Mas quais são os princípios biológicos com que estamos lidando? Como se pode modificar genomas?
É o que você vai ver aqui.

Existem alguns princípios básicos de genética que devem ser explorados para que se entenda melhor
suas aplicações na biotecnologia. O primeiro deles é a genética em si. Todos os organismos vivos do
nosso planeta têm informações genéticas, que são as características hereditárias passadas de geração
a geração. Das bactérias e vírus mais simples ao complexo genoma de plantas e animais superiores, as
informações genéticas são codificadas por longas moléculas DNA ou RNA, em suas mais diversas
formas e combinações.

O DNA se organiza na célula nos cromossomos. Em procariotos (bactérias), os cromossomos assumem

forma circular e estão livres no protoplasma. Em eucariotos, os cromossomos são organizados, lineares
e estão contidos dentro do envoltório nuclear, separados do citoplasma. Dentro dos cromossomos
encontramos os genes – sequências de nucleotídeos que codificam uma informação funcional, seja na
forma de proteínas ou de RNA. Além da região codificante em si, os genes normalmente possuem
regiões promotoras e terminadoras da expressão, antes e depois da região codificadora. Entre os genes,
existem regiões não codificadoras longas e curtas, cujas funções não são completamente conhecidas.

Imagem: Shutterstock.com
 Estrutura do genoma em uma célula eucariota.

O entendimento da bioquímica dos ácidos nucleicos é outro ponto que deve ser revisto para que se
possa compreender como as modificações genéticas são feitas. O DNA e o RNA são moléculas
complexas formadas por unidades básicas mais simples, chamadas de nucleotídeos. Cada nucleotídeo
é composto por três regiões principais:

Um açúcar de 5 carbonos

Um grupamento fosfato ligado ao 5º carbono

As bases nitrogenadas
Imagem: Shutterstock.com

É bom lembrar que, no RNA, não há timinas, e sim uracilas (U). Essas bases são classificadas em dois
grandes grupos químicos: as purinas (A e G) e as pirimidinas (C e T ou U) . As bases nitrogenadas
são as responsáveis por conter a informação genética; é com elas que as células escrevem a
informação contida no complexo texto que são os genomas.

A estrutura do DNA da maioria dos organismos é uma dupla hélice, com o fosfato do 5º carbono se
conectando à hidroxila do 3º carbono por meio de uma ligação chamada fosfodiéster. Essa ligação deixa
as bases nitrogenadas livres e, por terem cargas fracas, são capazes de interagir umas com as outras
por pontes de hidrogênio e em pares de purinas com pirimidinas: A-T e C-G. A interação entre as bases
nitrogenadas dos nucleotídeos é um princípio denominado complementaridade. Tal princípio faz com
que duas fitas de DNA de sequências complementares interajam entre si, formando a dupla hélice, o que
garante a estabilidade da informação genética.
Imagem: Shutterstock.com
 Representação esquemática do pareamento por complementaridade entre bases nitrogenadas.

A complementaridade também permite que uma fita seja usada como molde para a síntese de outra fita
nova durante a replicação do DNA – isso é chamado de duplicação semiconservativa: as fitas parentais
de DNA compõem as hélices duplas com as fitas filhas de DNA.


 RELEMBRANDO

Outro ponto que precisa ser relembrado é o dogma central da biologia molecular. Essa “regra” biológica
afirma que o DNA é usado como molde para a síntese de novas moléculas de DNA (replicação) e de
moléculas de RNA (transcrição). Nesse contexto, o RNA é um mensageiro intermediário da informação
contida no DNA e é usado para síntese (tradução) de proteínas, os efetores moleculares mais comuns da
célula. Vale lembrar que o sentido de transcrição DNA → RNA não é único, pois já foram descobertas
enzimas virais capazes de sintetizar DNA a partir de RNA (RNA → DNA).
Imagem: Shutterstock.com
 Dogma central da biologia molecular.

A síntese de DNA e de RNA nos processos de replicação e transcrição é mediada por enzimas capazes
de reconhecer os nucleotídeos da fita-molde. Elas os pareiam com nucleotídeos trifosfatados
complementares livres e catalisam a ligação fosfodiéster que une os nucleotídeos. Assim, a síntese de
uma nova fita de DNA ou RNA é feita. Essas enzimas – as polimerases – podem ser subdivididas em
quatro grupos, com base em sua capacidade de leitura e síntese de ácidos nucleicos:

DNA-polimerases DNA-dependentes

RNA-polimerases DNA-dependentes

RNA-polimerases RNA dependentes

DNA-polimerases RNA-dependentes

RNA-POLIMERASES DNA-DEPENDENTES

Também são chamadas de transcriptases, encontradas apenas em células.

Trata-se de enzimas virais muito úteis em biotecnologia.

PRINCÍPIOS DA TÉCNICA DO DNA
RECOMBINANTE
Uma das ferramentas mais importantes da biotecnologia – que permeia todas as áreas nas quais é
aplicada – é a tecnologia do DNA recombinante. Segmentos de DNA de origens diferentes podem ser
unidos, formando uma nova sequência contígua chamada de recombinante, usando essa técnica. O
DNA recombinado é introduzido em uma célula hospedeira e pode ser usado para modificar o genoma
da célula hospedeira, gerando os OGM e os transgênicos; pode ser usado também como sistema de
expressão de proteínas.

A recombinação de duas sequências de DNA é um evento que acontece naturalmente em células

germinativas durante a meiose, conhecido como crossing over .

Imagem: Shutterstock.com
 Crossing over: evento em que há recombinação homóloga.

Nesse evento, a recombinação que acontece é homóloga, pois sequências de DNA quase (ou
perfeitamente) idênticas presentes nos dois cromossomos homólogos são pareadas e trocadas.

A tecnologia do DNA recombinante se baseia no princípio de que duas sequências de DNA podem
recombinar entre si, mesmo que elas não sejam perfeitamente iguais. De fato, quando fundimos duas
sequências de DNA para fazermos um DNA recombinante, fazemos recombinação heteróloga.

Para ver em detalhes como o DNA recombinante funciona, é necessário conhecer alguns conceitos.

Você precisa, primeiramente, saber que elemento genético deseja inserir no hospedeiro, ou o inserto.

Além disso, escolher qual o meio de transporte dessa informação, ou seja, com qual tipo de vetor será
recombinado o inserto, para poder transferi-lo para a célula.

Ao mesmo tempo, é preciso definir qual a melhor célula para ser usada como sistema ou hospedeiro.
Após definidos o inserto, o vetor e o sistema celular que serão usados, é o momento de ter estratégias
de seleção dos recombinantes bem-sucedidos.

Uma vez selecionados, serão expandidas em número apenas as células hospedeiras que contêm o DNA
recombinante.

A esse processo dá-se o nome de clonagem molecular, pois multiplicamos células que são idênticas
geneticamente, ou seja, são clones. A seguir você verá cada uma dessas etapas separadamente.

Veja a seguir o esquema da tecnologia do DNA recombinante.

Imagem: shutterstock.com

Imagem: shutterstock.com

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Imagem: shutterstock.com

ISOLAMENTO DO FRAGMENTO DE INTERESSE

Um dos elementos fundamentais para a recombinação de DNA é o fragmento de interesse, - o inserto –
que será usado. O inserto pode ser qualquer sequência que desejamos colocar no sistema hospedeiro:
um gene completo, com o promotor; a região codificante; o terminador; ou pode ser um RNA não
codificante.

Digamos que o interesse seja expressar uma proteína recombinante humana em uma bactéria.

O inserto pode ser apenas a região genética que codifica para a proteína humana, flanqueado (ou seja,
tendo em cada extremidade) por um promotor e um terminador, que podem ser tanto nativos do gene
humano a ser expresso, quanto promotores otimizados para bactéria.

Idealmente, e para maximizar a produção de proteína recombinante, se o sistema hospedeiro é

procarionte, devemos utilizar os promotores e terminadores bacterianos. Também é necessário otimizar
todo o gene de acordo com os códons (sequência de três nucleotídeos que correspondem a um
aminoácido – mas sem trocar a sequência de aminoácidos da proteína!) mais usados pela espécie de
bactéria em questão – o que chamamos de otimização de códons.




O uso de sequências regulatórias específicas do hospedeiro, assim como a otimização de códons, deve
ser feito sempre que possível.

Uma vez definido o inserto, deve-se obtê-lo isoladamente e em grande quantidade. Uma forma de obter
o DNA do inserto em quantidade suficiente é pelo crescimento e multiplicação das células em cultivo.
Tendo um número expressivo de células, é possível digerir seu DNA usando enzimas, e separar o
fragmento desejado por meio de eletroforese.

Após purificação, temos o inserto em quantidade suficiente para inseri-lo no vetor. Entretanto, a digestão
enzimática do DNA apresenta uma grande limitação: para usá-la, é necessário saber a sequência do
fragmento de interesse com exatidão, e ela precisa conter, em suas extremidades, sítios de clivagem
enzimática.

No próximo tópico você vai conhecer mais sobre a digestão enzimática do DNA.

A digestão enzimática do DNA total da célula pode ser muito trabalhosa e pouco eficaz e isso fez com
que a digestão enzimática para isolamento do fragmento de interesse caísse em desuso. O método mais
comumente usado hoje para amplificação de um gene, ou inserto, é a PCR. Por ela, pode-se amplificar
grande quantidade de DNA-alvo a partir de muito pouco material genético e em muito menos tempo. A
PCR ainda possibilita fazer pequenas alterações nas extremidades do fragmento a ser amplificado, o
que será muito útil mais à frente.

O desenvolvimento de outra técnica facilitou muito o planejamento da PCR para o isolamento de um

fragmento de interesse: o sequenciamento de DNA. A partir dele, sabemos exatamente a sequência do
DNA-alvo e podemos delinear como fazer a PCR ou digestão enzimática. No item Explore+ você terá
mais dicas de aprendizagem sobre PCR e sequenciamento.
ESCOLHA DO VETOR E ENZIMAS DE
RESTRIÇÃO
Agora que o inserto está isolado, pode-se fundi-lo com o vetor. Os vetores funcionam como meio de
transporte para colocar o inserto dentro da célula. Os vetores mais comumente usados são os
plasmídeos, pequenos DNA circulares que possuem todos os elementos necessários à sua própria
replicação independentemente dos cromossomos celulares – por isso, são chamados de
autorreplicantes. De fato, plasmídeo é um termo genérico para qualquer elemento hereditário
extracromossomal. Ocorre naturalmente em bactérias, como elementos genéticos móveis que são
transferidos de uma bactéria a outra no processo chamado de conjugação, ou que podem ser obtidos a
partir do meio ambiente, por meio do fenômeno de transformação. Você vai ver esse fenômeno em
detalhes mais à frente.

COMO ESCOLHER O VETOR

O primeiro passo para escolha do vetor é definir qual será a estratégia de uso do inserto. De forma
simplificada, podemos dividir os plasmídeos em dois grupos:

VETORES DE EXPRESSÃO
Se o interesse for inserir um gene exógeno no sistema com o objetivo de produzir grandes quantidades
de proteína de forma temporária (ou transiente), precisaremos usar um vetor de expressão. Caso a
expressão da proteína não seja mais interessante para nós, podemos “remover” o plasmídeo, e a célula
volta ao seu estado genético “original”.

VETORES DE MODIFICAÇÃO
Se, por outro lado, a intenção for expressar uma determinada proteína exógena de forma permanente ou
modificar um gene do organismo, poderemos usar um plasmídeo recombinado com o inserto. Este
último vetor é estruturalmente diferente do primeiro e normalmente não é em si transformado para
dentro da célula, mas, sim, um fragmento dele. E, mesmo que o seja, não é expresso em sua forma
extracromossomal em eucariotos, pois não possui todos os elementos básicos responsáveis pela
expressão, de forma que precisa estar integrado ao genoma para que a transcrição e tradução
aconteçam.

Certas regiões específicas são requeridas para que os plasmídeos sejam expressos e replicados pela
maquinaria celular. A região de origem de replicação, chamada Ori , é reconhecida pelos fatores
celulares que farão a replicação. Caso o plasmídeo seja usado como vetor em células eucarióticas, é
preciso verificar quais são os elementos necessários ao sistema hospedeiro e qual estratégia se quer
adotar. Isso é devido a diferentes tipos (sequências) de Ori em eucarioto. Como ilustração, veja o
exemplo da levedura, um fungo unicelular extremamente relevante para a biotecnologia. São quatro
tipos diferentes de plasmídeos em leveduras, com base em Oris diferentes, que podem ser usados:

Imagem: Autor/Shutterstock

Ori ARS, que permite a replicação do plasmídeo independentemente da replicação do

cromossomo da célula, gerando múltiplas cópias do plasmídeo por célula. É instável e facilmente
perdida por ela.

Ori CEN, que só replica junto com o DNA celular e, por isso, é encontrada em poucas cópias por
célula, sendo estável.

Ori YEp, mais semelhante à Ori bacteriana, com alto número de cópias que podem ser reguladas.

A versão sem nenhuma Ori, normalmente usada para integração direta no cromossomo.

Outra função importante dos vetores é a capacidade de oferecer alguma vantagem seletiva à célula
hospedeira, seja ela procariota ou eucariota. Isso porque, apesar de ocorrerem naturalmente em muitos
tipos de bactérias, os plasmídeos não são essenciais para a sobrevivência da célula em um ambiente
sem pressão seletiva. No entanto, quando há pressão seletiva, a presença de um plasmídeo funcional
pode oferecer a vantagem seletiva que a bactéria precisa para sobreviver a uma condição hostil.


  EXEMPLO

O maior exemplo disso são os plasmídeos que transportam genes de resistência a antibióticos; embora não
sejam fundamentais para a sobrevivência da bactéria em condições normais, podem dar grande vantagem
seletiva e permitir que apenas as células que os possuem sobrevivam na presença do antibiótico em
questão.

A terceira região é comumente encontrada em plasmídeos comerciais, com múltiplos sítios de restrição
(ou digestão) enzimática (em inglês, essa região é denominada multiple cloning region – MCS). Essa
região pode ser flanqueada por promotores e terminadores, ou esses reguladores podem estar
presentes no inserto. É nessa região que o inserto é clonado, usando principalmente os sítios de
restrição.

Imagem: Elaborado por Camilla Baez

 Representação da estrutura de um plasmídeo simples

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

O MCS de um vetor apresenta múltiplas sequências de DNA diferentes que são reconhecidas por
enzimas capazes de clivar – ou cortar – o DNA próximo da sequência ou nela própria. Essas enzimas,
por clivarem DNA no meio de uma sequência, são conhecidas como endonucleases, existem em
células bacterianas e funcionam principalmente como uma forma de defesa contra DNA exógenos que
podem representar uma ameaça à célula, como é o caso dos bacteriófagos.

Esse grupo de enzimas que estamos descrevendo e que usamos na clonagem molecular se destaca
das demais endonucleases por clivarem o DNA em regiões específicas determinadas pela sequência, e
por isso são referidas como enzimas de restrição.
De acordo com o tipo de clivagem que as enzimas de restrição podem fazer, é possível separá-las em
dois grupos.

ENZIMAS BLUNT END

Existem aquelas enzimas que reconhecem determinada sequência e clivam a ligação fosfodiéster entre
os nucleotídeos de ambas as fitas, na mesma posição. Em outras palavras, elas cortam reto. Por essa
característica, são conhecidas como enzimas blunt end (terminação reta, cega, lisa, em tradução livre
do inglês).

ENZIMAS STICKY END

O segundo grupo de enzimas de restrição também cliva sequências de DNA específicas, porém de
forma assimétrica. Ou seja, a clivagem em uma das fitas que compõem a dupla hélice não é feita na
posição equivalente na fita complementar, mas, sim, alguns nucleotídeos antes ou depois. Esse tipo de
corte deixa algumas bases nitrogenadas livres, não pareadas por complementaridade, em ambas as
fitas. Isso facilita a religação de fitas de DNA com sequências complementares livres e, por isso, as
enzimas que assim clivam o DNA são denominadas de sticky end (terminação coesiva, “grudenta”, em
tradução livre do inglês).

Imagem: Elaborado por Camilla Baez

 Ilustração representando a diferença na clivagem de DNA entre enzimas de restrição coesivas
(sticky) e retas, ou cegas (blunt), com exemplos

Para usar enzimas de restrição como ferramentas de clonagem molecular, é preciso ter atenção e
garantir que a sequência de DNA reconhecida pela enzima esteja presente apenas uma vez, tanto no
vetor quanto no inserto. Caso contrário, a enzima terá múltiplos sítios de clivagem e iremos fragmentar
demais o vetor ou inserto, tornando-o inútil.
No caso do uso de enzimas do tipo coesivas, é necessária a mesma sequência de clivagem tanto MCS
do vetor quanto nas extremidades do inserto. Caso a sequência de reconhecimento e clivagem não
esteja presente na posição correta em um dos dois, a clonagem não dará certo, pois não haverá a
complementaridade necessária ao pareamento e posterior ligação das sequências.

Se a opção for por uma enzima do tipo “cegas”, pode-se usar enzimas diferentes para digerir o inserto e
o vetor, já que as sequências são cortadas no mesmo ponto, nas duas fitas. No entanto, a eficiência da
próxima etapa, a ligação, vai ser muito mais reduzida do que se forem usadas enzimas do tipo coesivas.

Uma vez concluída a digestão do vetor e do inserto separadamente, o próximo passo é a união das
sequências do inserto e do vetor. Após isso, verifica-se se a digestão ocorreu conforme esperado, por
meio de uma eletroforese, em que o DNA do vetor, antes circular, foi linearizado, migrando mais
facilmente do que sua forma circularizada. Em seguida, estabiliza-se o DNA digerido do vetor usando
uma enzima chamada fosfatase. Ela remove os fosfatos do 5º carbono da desoxirribose, o que
impossibilita a restauração da ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos do próprio vetor. Isso previne
que o vetor se recircularize espontaneamente, o que impediria a clonagem do inserto.

Como o inserto não teve seus fosfatos removidos pela fosfatase, a ligase consegue unir apenas o
pareamento vetor-inserto.

Uma vez construído o vetor com o DNA recombinante de interesse, é preciso expandir o novo
plasmídeo, o que pode ser feito tanto por transformação bacteriana quanto por PCR. Ainda que a
bactéria não seja o sistema final de expressão ou o organismo que queremos modificar, a expansão do
plasmídeo recombinante nesse sistema aumenta a eficiência da subsequente transformação da célula-
alvo.

Imagem: Elaborado por Camilla Baez

 A enzima DNA-ligase faz a restauração da ligação fosfodiéster, após digestão enzimática, do inserto
no vetor.

TRANSFORMAÇÃO, SELEÇÃO DOS CLONES

RECOMBINANTES E MULTIPLICAÇÃO
Uma vez que o vetor com DNA recombinante tenha sido obtido, é hora de transferi-lo de um microtubo
de ensaio para dentro de células. Como você viu, existe um processo natural de obtenção de DNA
exógeno a partir do ambiente que células bacterianas são capazes de fazer, denominado transformação.

As bactérias que fazem transformação são chamadas de bactérias competentes. Existem diversas
espécies bacterianas que são naturalmente competentes. Em biotecnologia, no entanto, é mais comum
trabalharmos com uma bactéria que não é naturalmente competente: a Escherichia coli , um bacilo
Gram-negativo presente na microbiota do nosso organismo.

A E. coli tem sido largamente utilizada em clonagem molecular, modificação genética e como sistema
hospedeiro para expressão estável de proteínas, por ter um rápido crescimento em cultivo feito em meio
relativamente simples e ter o genoma bem caracterizado. Além disso, as cepas usadas em laboratório
são não patogênicas, o que a torna um hospedeiro simples e seguro de se manipular em baixo nível de
biossegurança.

PROCEDIMENTO DE TRANSFORMAÇÃO

Se a E. coli não é capaz de fazer transformação, é possível usá-la como sistema?

Talvez o procedimento mais utilizado seja por meio do tratamento com cálcio (Ca+2). Quando em
solução contendo cálcio, as células são congeladas instantaneamente e assim sua competência é
preservada. Quando formos usar a bactéria para transformação, ela já estará competente e terá maior
capacidade de transformação. Mesmo assim, apenas uma em cada 10 mil células terá a entrada do
plasmídeo feita com sucesso.

Para transformar a E. coli , será necessário descongelá-la em gelo, para não perder a competência, e
incubar as células junto com o DNA plasmidial. Junto com a elevação rápida de temperatura por alguns
segundos no procedimento chamado de choque térmico (42oC por 30 a 45 segundos), a parede celular
bacteriana, na presença de cálcio, torna-se mais permeável à entrada de DNA livre no meio. Após rápida
incubação em gelo, as células são semeadas em meio sólido seletivo.
Imagem: Autor Amunroe13 / Wikimedia commons / Licença CC-BY-SA-3.0
 Representação da transformação bacteriana. Após congelamento instantâneo de bactéria sensível a
antibiótico (1), a parede celular fica permeável (2). O plasmídeo é incubado com a bactéria, e pode
entrar mediante choque térmico (3). Os clones cuja transformação foi bem-sucedida são capazes de
crescer sob seleção (4).

A eficiência da transformação é proporcional à quantidade de DNA recombinante usado: quanto mais

DNA, maior a chance de a transformação acontecer. Por isso, quando se trabalha com DNA
recombinante, é necessário usar o máximo possível do vetor recombinante para obter o máximo de
colônias e poder selecionar posteriormente aquelas que tiveram a clonagem bem-sucedida. Essa regra
também é válida para a simples expansão de plasmídeos, mas se DNA demais for usado nesse caso,
depois não será possível diferenciar as colônias de clones.

SELEÇÃO DOS RECOMBINANTES E MULTIPLICAÇÃO

Uma das formas de seleção de transformantes (bactérias transformadas) mais frequentemente usada é
a seleção pelo uso de antibióticos no meio de cultivo – o mais comumente utilizado é a ampicilina, um

derivado da penicilina; as células devem crescer de um dia para o outro em incubadora de 37oC.

Caso a transformação tenha sido bem-sucedida, é possível ver o crescimento de bactérias resistentes à
seleção por antibiótico. Mas isso não é suficiente para garantir que o vetor transformado tenha o inserto
recombinado. Para isso, é preciso verificar quais colônias de clones idênticos geneticamente possuem
o vetor com inserto por meio de PCR e, idealmente, de sequenciamento. Finalmente, fazemos a
expansão dos clones positivos para a recombinação, simplesmente repicando a colônia em meio de
cultivo com seleção. A partir daí, podemos congelar uma alíquota de células, ou podemos extrair o DNA
plasmidial.

Se o plasmídeo foi usado apenas como um vetor de expressão em bactérias, a seleção por antibiótico é
a única necessária. Caso o sistema seja eucarioto (leveduras, células vegetais ou animais), será
necessário outro marcador de seleção, específico para o tipo de sistema que estiver sendo trabalhado.
Da mesma forma como podemos usar antibióticos para selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo,
podemos trabalhar com genes de resistência a antibióticos que ajam contra eucariotos, como
antifúngicos e outros compostos tóxicos às células.

Outra forma de seleção presente em eucariotos consiste em sistemas que permitem o crescimento da
célula na ausência de um nutriente essencial e que leva um nome complicado: complementação
auxotrófica

AUXOTRÓFICA

Auxotrofia é a incapacidade que certos organismos têm de crescer em meio de cultivo na ausência
de determinado nutriente.

Nesse sistema de seleção é possível, por exemplo, adicionar ao vetor recombinado o gene da enzima
que faz a síntese do nutriente ausente no meio. Assim, apenas as células que contêm o DNA
recombinante crescem em meio de cultivo sem determinado nutriente.


OUTRAS TÉCNICAS DE RECOMBINAÇÃO,
TRANSFORMAÇÃO E SELEÇÃO
A especialista Camila Baez apresenta outras técnicas de recombinação, transformação e seleção
VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE TEM MUITAS APLICAÇÕES EM

DIVERSOS SETORES E É UMA IMPORTANTE FERRAMENTA DA
BIOTECNOLOGIA. SOBRE DNA RECOMBINANTE, É INCORRETO AFIRMAR QUE:

A) Mesmo que não sejam o sistema hospedeiro final, as bactérias são úteis na técnica do DNA
recombinante.

B) O DNA recombinante consiste na união de sequências de DNA de duas ou mais origens diferentes.

C) Os vetores são pequenas moléculas de DNA autorreplicantes em bactérias.

D) A conjugação bacteriana é a principal forma de inserir o DNA recombinado nas células.

E) A seleção por antibiótico é uma das principais formas de selecionar os clones recombinantes.

2. PARA A CLONAGEM MOLECULAR, PRECISAMOS DE UM INSERTO, UM VETOR

E UM HOSPEDEIRO. SOBRE A CLONAGEM MOLECULAR, É CORRETO AFIRMAR
QUE:

A) Os plasmídeos são vetores autorreplicativos nos quais inserimos um DNA exógeno a ser clonado.

B) Chamamos de transformação ao processo de transformar organismo selvagem em geneticamente

modificado.

C) Os plasmídeos não precisam de origem de replicação específico para serem expressos em sistemas
eucariontes.

D) As enzimas de restrição são usadas na clonagem para sintetizar novas sequências de DNA,
mediante sua capacidade sintetase.

E) Os clones são selecionados com base em sua semelhança fenotípica em microscopia ótica.

GABARITO

1. A tecnologia do DNA recombinante tem muitas aplicações em diversos setores e é uma

importante ferramenta da biotecnologia. Sobre DNA recombinante, é incorreto afirmar que:

A alternativa "D " está correta.

As bactérias podem adquirir DNA de forma horizontal por meio da conjugação, em que duas células
trocam material genético, ou por meio de transformação, em que DNA livre no ambiente é obtido por
células competentes. Na tecnologia do DNA recombinante, a forma de entrada do DNA recombinante é
pela transformação.

2. Para a clonagem molecular, precisamos de um inserto, um vetor e um hospedeiro. Sobre a

clonagem molecular, é correto afirmar que:

A alternativa "A " está correta.

Vetores de clonagem molecular são DNA circulares extracromossomais, dispensáveis à sobrevivência

da célula na ausência de pressão seletiva. Eles são replicados de forma independente por possuírem
todos os elementos básicos à replicação, como uma origem, promotores e terminadores.

MÓDULO 3

 Reconhecer aplicações da tecnologia do DNA recombinante

PRODUÇÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES
Como você viu, a tecnologia do DNA recombinante pode ser usada em diversas áreas, da Medicina à
indústria de biocombustíveis e sustentabilidade. Apesar da variedade de setores que se beneficiam do
avanço científico e produtivo dessa técnica, a tecnologia em si pode ser subdividida em dois tipos de
sistemas principais: expressão de proteínas recombinantes e modificação genética de um organismo de
forma permanente.


  COMENTÁRIO

Caso o objetivo com a tecnologia do DNA recombinante seja produzir grandes quantidades de uma proteína,
deve-se trabalhar com um sistema de expressão. As proteínas produzidas têm aplicações diversas. Pode-se
usá-las para modificar o metabolismo de uma célula ou organismo quando, por exemplo, tornamos uma
planta ou bactéria resistente a um produto químico em particular. Pode-se modificar proteínas, conjugando-as
com outras proteínas fluorescentes, para visualização de estruturas celulares. Ainda é possível usar o DNA
recombinante para produzir grandes quantidades de proteínas que serão purificadas e usadas em outro
contexto.

Dependendo da aplicação pretendida, o sistema vai ser de expressão homóloga ou de expressão

heteróloga.

EXPRESSÃO HOMÓLOGA
A expressão homóloga consiste na criação de um vetor recombinante contendo um gene já presente
no genoma cromossômico da célula hospedeira. Normalmente, o objetivo dessa abordagem é aumentar
a síntese de uma proteína celular específica para alterar o metabolismo da célula.

EXPRESSÃO HETERÓLOGA
Na expressão heteróloga, usa-se um gene de um organismo A para ser expresso na célula B. Por
exemplo, pode-se expressar a proteína verde fluorescente de águas vivas em células animais em
cultivo, com diversas finalidades. Uma delas é a posterior separação da célula modificada daquelas que
não o foram, em uma espécie refinada de seleção.

A expressão de proteínas recombinantes heterólogas é ainda subdividida em dois tipos, de acordo com
a permanência da expressão:

TRANSIENTE
Também conhecida como temporária, ocorre quando o vetor recombinante usado permanece separado
do genoma cromossômico e pode ser perdido, seja pela remoção de seleção seja por múltiplas
passagens em cultivo – especialmente para células de mamífero.

PERMANENTE
Ocorre quando o DNA recombinante é integrado no genoma da célula hospedeira e, após uma seleção
inicial, não requer manutenção da pressão seletiva. Isso porque, uma vez integrado ao genoma, o DNA
recombinante não é removido – a não ser que algo seja diretamente feito para que isso aconteça.
PRINCIPAIS SISTEMAS CELULARES DE EXPRESSÃO
DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES HETERÓLOGAS

Para que uma grande quantidade de proteínas seja produzida por meio de expressão heteróloga, é
necessário usar o sistema celular certo. Na escolha do sistema celular, a preferência é para tipos
celulares que cresçam e se multipliquem rapidamente, e que sejam de simples manutenção e
manipulação genética. Sendo assim, normalmente trabalhamos com dois tipos de células, as bactérias –
especialmente a E. coli – e a levedura – como a Saccharomyces cerevisiae , mas também podemos
usar outras. Ambos os sistemas apresentam curto tempo de duplicação celular, baixo risco biológico,
fácil manipulação genética e já existe vasto conhecimento de seu genoma.


 RECOMENDAÇÃO DE PROTOCOLOS E PRÁTICAS

A escolha do sistema de expressão, no entanto, deve ser feita com cautela, já que nem toda proteína
heteróloga é corretamente expressa em qualquer sistema.

A E. coli é um dos sistemas de expressão de proteínas heterólogas mais usados. Seu tempo de
duplicação é de cerca de 20 minutos, e em poucas horas pode-se ter quantidade massiva de células
expressando a proteína. Além disso, conhecemos bem sua genética e fisiologia e podemos usá-las a
nosso favor, aumentando a produção da proteína recombinante. Vale lembrar que, para usar a E. coli
como sistema de expressão, o vetor deve ter sido otimizado com as sequências Ori , promotores,
terminadores e seleção ideais para essa espécie de bactérias; caso contrário, a obtenção da proteína
pode não acontecer.

As aplicações da E. coli como sistema de produção de proteínas heterólogas são vastas. Em especial,
seu uso tem sido muito explorado na produção de biofármacos. Por exemplo, a insulina humana
produzida em E. coli é licenciada para uso humano, no tratamento de diabetes, desde a década de
1980. Outros exemplos de proteínas humanas produzidas em E. coli para posterior uso terapêutico
incluem interferons, para tratamentos de doenças virais crônicas e de câncer, e diversos hormônios,
como a calcitonina e hormônio da paratireoide, e glucagon.

Contudo, a E. coli apresenta uma grande limitação: por ser um procarioto, ela não faz modificações
pós-traducionais nas proteínas de eucariotos. Essas mudanças são feitas após a cadeia de aminoácidos
ter sido completamente sintetizada, e podem incluir aceleração na formação da estrutura tridimensional
final da proteína – processo feito por proteínas auxiliares denominadas chaperonas – ou adição de
grupamentos químicos, como fosfatos e açúcares. Por isso, quando tais modificações são requeridas
para o funcionamento da proteína no organismo humano, a E. coli deixa de ser um bom sistema de
uso.

Nesses casos, as leveduras, por serem eucariotos, podem ser capazes de fazer modificações pós-
traducionais. De forma geral, as leveduras são a primeira linha de escolha como alternativa à E. coli
para produção de proteínas heterólogas, por também serem unicelulares e terem fácil crescimento e
manutenção em laboratório, além de metabolismo e genoma bem estudados. Entretanto, algumas
modificações pós-traducionais feitas pelas leveduras podem não corresponder às observadas nas
proteínas do organismo original, e acabar causando reações imunológicas quando inoculadas no
paciente. Por isso, ao trabalhar com proteínas heterólogas complexas, é fundamental que haja extensos
estudos para a validação da levedura como sistema. Acesse o material suplementar na sessão Explore+
para aprender mais detalhes sobre o uso da levedura como sistema de expressão de proteínas
heterólogas.

Alternativamente, tem-se a produção de proteínas heterólogas ou homólogas em cultivo de células de

mamíferos. A produção de anticorpos monoclonais, por exemplo, é costumeiramente feita em células
modificadas de mamífero, por serem extremamente complexos. Porém, as células de mamífero são de
difícil manutenção e crescem muito mais lentamente que micro-organismos, requerendo laboratórios e
mão de obra mais especializados e caros.

PURIFICANDO A PROTEÍNA HETERÓLOGA

Ao trabalhar com proteínas heterólogas, alguns cuidados devem ser tomados para garantir a quantidade
máxima de proteína purificada.

Primeiro, devemos ter meios de detecção da produção da proteína, e identificar em qual momento sua
expressão atinge o ápice para poder ser purificada.


Também é preciso garantir o máximo de solubilidade da proteína, pois, se ela formar precipitados no
hospedeiro, não conseguiremos separá-la.


Além disso, a formação de precipitados pode prejudicar o metabolismo e a própria viabilidade do
sistema hospedeiro, caso se torne tóxico à célula.


Adicionalmente, é preciso ter uma forma de purificá-la. Para isso, lançamos mão de técnicas de
cromatografia de afinidade, em que a afinidade química forte entre dois compostos diferentes permite
que o composto solúvel seja ligado com alta especificidade e, após lavagens, seja purificado com
elevada produtividade.

DOIS COMPOSTOS DIFERENTES

Um solúvel em um meio macromolecular complexo e ou outro fixado em uma coluna ou resina.

Marcador Sequência de aminoácidos

Flag-tag DYKDDDDK

HA-Tag YPYDVPDYA

Poli-His-Tag 6 ou mais histidinas seguidas (HHHHHH)

Myc-Tag EQKLISEEDL

GFP-Tag Proteína verde fluorescente, cadeia longa.

Biotina Se liga à Estreptoavidina

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 Marcadores de proteína Tabela: Elaborado por Camilla Baez

MODIFICANDO ORGANISMOS
GENETICAMENTE
Talvez a maior possibilidade oferecida pela engenharia genética, além dos sistemas biológicos simples
para expressão heteróloga de proteínas, seja a capacidade de modificação direta do genoma de
organismos. Podemos usar ferramentas clássicas, como a recombinação homóloga, ou técnicas mais
modernas, como a CRISPR/Cas.

Como você já viu, a recombinação homóloga acontece em células que passam por meiose, em que
trechos dos cromossomos homólogos (cromossomos que contêm o mesmo tamanho, estrutura e genes)
são trocados durante o emparelhamento para posterior separação e citocinese. Essa troca é uma
ferramenta de variabilidade genética, gerando gametas com conteúdo genético mais diversificado.

A recombinação homóloga pode acontecer como resposta de dano ao DNA (DDR – DNA damage
repair , em inglês). Durante a divisão celular, erros na síntese do DNA podem desencadear a resposta
de reparo, tanto na mitose quanto na meiose. Os tipos de erros são muitos, como a incorporação de
nucleotídeos errados, ou a quebra da ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos que compõem a fita-
molde (quebras nas fitas-duplas, DSB – double-strand breaks , em inglês). A DDR pode levar ao reparo
e à viabilidade celular ou à morte celular, dependendo de quão extenso seja o dano.

Imagem: Elaborado por Américo Jr.

 Exemplos de dano ao DNA que desencadeiam a resposta ao dano do DNA.

Na engenharia genética, podemos nos beneficiar desse sistema de reparo. Em especial, a DSB pode
ser explorada, pois então as fitas estarão livres (e parcialmente descontinuadas) para que a
recombinação homóloga possa ser feita. Da mesma forma, como o DNA de cromossomos homólogos se
pareiam e são trocados no crossing over , pode-se usar o pareamento com sequências homólogas
exógenas produzidas por DNA recombinantes, e introduzir um inserto no genoma.

É necessário garantir que o DNA com homologia esteja, no entanto, bem próximo do sítio de quebra.
Nesse caso, o DNA exógeno terá entrado na célula por meio de transformação, e o genoma da célula
começa a ser replicado. Uma vez que o DNA tenha sido quebrado em ambas as fitas, ocorre o processo
de ressecção, em que parte da fita dupla é removida, deixando uma fita simples, que será usada como
molde de homologia. A recombinação homóloga pode ser dividida em três etapas:

Pré-sinapse – após a DSB, enzimas conhecidas como recombinases formam um complexo ao redor do
sítio em que a fita dupla foi quebrada. Essas proteínas se ligam às fitas simples, o que facilita o
reconhecimento das regiões de homologia.

Sinapse – caso o DNA homólogo esteja presente, as recombinases farão o pareamento dos
nucleotídeos entre as fitas quebradas e o inserto homólogo.

Pós-sinapse – o complexo recombinase é desfeito, e a duplicação do DNA é feita, finalizando o processo

de recombinação homóloga.

A recombinação homóloga permitiu o desenvolvimento de micro-organismos, plantas e animais

modificados geneticamente. Hoje, podemos remover um gene por completo de um organismo, gerando
os chamados nocautes (KO – knock-out , em inglês). Também podemos usar essa ferramenta para
transferir genes de um organismo A para o B, como foi visto para a produção de cereais transgênicos
contendo o gene Bt do Bacillus thuringiensis . O princípio da recombinação homóloga também abriu
caminho para uma técnica ainda mais moderna: a edição genética usando o sistema CRISPR/Cas,
objeto de estudo da videoaula.


RECONHECER APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA
DO DNA RECOMBINANTE
A especialista Camila Baez fala sobre a ferramenta de edição genética CRISPR/Cas.

BIBLIOTECAS DE DNA E CDNA

Outra aplicação da clonagem molecular é a produção de bibliotecas de DNA, produzidas pela clonagem
de milhares de genes de um organismo-alvo dentro de bactérias ou leveduras, como livros em uma
biblioteca. As bibliotecas de cDNA, por exemplo, contêm todos os genes transcritos reversamente (de
RNA para cDNA), representando todos os genes sendo expressos em determinado momento, que
podem estar relacionados à fase do ciclo celular, ao desenvolvimento do organismo, a condições
ambientais e específicas de cada tecido.

Como são feitas a partir dos RNA mensageiro sendo expressos, as bibliotecas de cDNA não possuem
elementos regulatórios, como promotores e terminadores, nem elementos não traduzidos, como introns.
Como bactérias não têm os mesmos elementos reguladores, nem introns, as bibliotecas de cDNA são
sistemas úteis na produção heteróloga de proteínas de eucariotos em sistemas procariotos.
Caso haja interesse em estudar o DNA genômico, pode-se utilizar bibliotecas de DNA, que contêm todos
os elementos regulatórios e introns, e são formadas como cromossomos artificiais em bactérias (BAC –
Bacterial Artificial Chromosome , em inglês), leveduras (YAC – Yeast Artificial Chromosome , em
inglês) ou PAC (P1-derived Artificial Chromosome , em inglês). As bibliotecas de DNA são
particularmente úteis em pesquisa científica sobre expressão de genes usando sistemas heterólogos.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. A ENGENHARIA GENÉTICA PERMITIU A EVOLUÇÃO DE TERAPIAS E DE

MELHORAMENTOS BIOLÓGICOS. SOBRE A PRODUÇÃO HETERÓLOGA DE
PROTEÍNAS, É CORRETO AFIRMAR QUE:

A) As proteínas heterólogas são produzidas por meio de modificações genéticas no organismo em que
elas são usadas.

B) A tecnologia do DNA recombinante não está relacionada à produção de proteínas heterólogas.

C) O principal organismo usado na produção de proteínas heterólogas é o cultivo celular de insetos.

D) A E. coli é o principal sistema de expressão de proteínas heterólogas, por ser de fácil manutenção e
crescimento.

E) Apenas células de natureza humana podem produzir proteínas heterólogas de humanos, caso
contrário as proteínas não serão funcionais.

2. “FRENTE AOS AVANÇOS TECNOLÓGICOS E NO CONHECIMENTO, O

ENTENDIMENTO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA DIVISÃO CELULAR E OS
DIFERENTES FATORES QUE CONTROLAM AS FASES DO CICLO CELULAR VÊM
GANHANDO DESTAQUE E UMA NOVA COMPREENSÃO EM NÍVEL MOLECULAR.”
(NEPOMUCENO ET AL. , 2017)

CONSIDERANDO A AFIRMAÇÃO ACIMA, ASSINALE A ALTERNATIVA CORRETA:

A) Uma das ferramentas usadas na engenharia genética é a transmutação, capaz de alterar organismos
a partir da entrada de genes endógenos.
B) Uma das ferramentas úteis na engenharia genética é a recombinação, feita especialmente por
translocases, que translocam segmentos de DNA de um cromossomo a outro.

C) A recombinação heteróloga é usada para inserir segmentos de DNA que contêm sequências
idênticas, por meio de recombinases.

D) A recombinação homóloga é usada para inserir segmentos de DNA que contêm sequências idênticas,
por meio de recombinases.

E) O sistema de reparo de dano ao DNA constitui uma ferramenta usada pela técnica de transformação,
em que a restrição enzimática repara a quebra da fita dupla do DNA.

GABARITO

1. A engenharia genética permitiu a evolução de terapias e de melhoramentos biológicos. Sobre a

produção heteróloga de proteínas, é correto afirmar que:

A alternativa "D " está correta.

Para que a produção de proteínas heterólogas seja bem-sucedida, são necessárias grandes
quantidades de proteínas e, consequentemente, de muitas células. A E. coli é uma bactéria não
patogênica, que duplica rapidamente, permitindo que grandes quantidades de células sejam obtidas em
poucas horas.

2. “Frente aos avanços tecnológicos e no conhecimento, o entendimento dos mecanismos

envolvidos na divisão celular e os diferentes fatores que controlam as fases do ciclo celular vêm
ganhando destaque e uma nova compreensão em nível molecular.” (NEPOMUCENO et al. , 2017)

Considerando a afirmação acima, assinale a alternativa correta:

A alternativa "D " está correta.

O processo de recombinação homóloga acontece quando há quebra da fita dupla de DNA. No local da
quebra, forma-se um complexo de reparação que contém recombinases, enzimas responsáveis pelo
pareamento com sequências idênticas que auxiliam no reparo ao inserirem as sequências livres.

CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste estudo você viu como a biotecnologia tem contribuído para avanços científicos significativos. Viu
como indústrias têm se beneficiado do aumento de produtividade obtido por alterações genéticas feitas
artificialmente, e como é importante haver regulação e controle em níveis nacionais e internacionais para
proteção das espécies originais, não modificadas.

Você teve oportunidade de conhecer os principais elementos biológicos e técnicos necessários para a
tecnologia do DNA recombinante, um instrumento chave na engenharia genética. Também conheceu
aspectos técnicos de execução e controle de qualidade, em nível molecular, das alterações feitas.

Aqui mostramos algumas aplicações de modificações genéticas, como a produção de proteínas

heterólogas, e seus usos em diferentes indústrias.

Em resumo, este material apresentou as diversas formas de uso da biotecnologia na modificação de

genomas e como isso impacta diversas áreas das indústrias.

AVALIAÇÃO DO TEMA:

REFERÊNCIAS
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EXPLORE+
Conheça mais sobre:

Os transgênicos no Brasil, no website da Embrapa.

A Lei nº 11.105/2005, no website do Governo.

As técnicas de Biologia Molecular – PCR, no vídeo da USP/Univesp, disponível no youtube.

Sequenciamento de Sanger – PPCC Biologia Molecular , da UFSC, disponível no youtube.

As leveduras como sistema de expressão de proteínas heterólogas no artigo de Fernando Araripe

Torres e Lidia Maria Pepe de Moraes, da UFPE: “Proteínas recombinantes produzidas em
leveduras”. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 2000.

CONTEUDISTA
Camila Freze Baez

 CURRÍCULO LATTES