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Microbiologia
Geral
(MIG)
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Importância dos microrganismos para os homens
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associados somente a agentes causadores de doenças. Somente uma minoria dos
microrganismos é patogênica (causadora de doenças), mas o conhecimento prático sobre eles é
de extrema importância para o desenvolvimento da medicina. Vale ressaltar que quando
transmitidos de uma pessoa para outra, alguns microrganismos são responsáveis por doenças
como peste, catapora, febre tifóide, sífilis e SIDA (AIDS). Além disso, os microrganismos são
associados frequentemente a infecções desagradáveis (exemplo: doença que ocorre no pé,
causada por um fungo e chamada de pé-de-atleta), ou a inconveniências mais comuns, como
comida estragada.
À medida que ler sobre os microrganismos, você aprenderá a apreciar o mundo
frequentemente invisível de bactérias, algas, fungos, protozoários e vírus!
Atividade em equipe:
Os microrganismos têm sido utilizados pelo homem em diferentes processos e de
diferentes maneiras. Debata com seus colegas do grupo e descreva no mínimo três aplicações de
microrganismos diferentes das citadas no texto.
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Introdução à Microbiologia
O que você pensa quando ouve as palavras germe e micróbio? Pequenas criaturas que
causam MAL e não se encaixam em nenhuma categoria da divisão: animal, vegetal ou mineral.
Os micróbios, também chamados de microrganismos, são minúsculos seres vivos,
individualmente muito pequenos para serem vistos a olho nu. O grupo inclui bactérias, fungos
(leveduras e mofos), protozoários e algas microscópicas. Também inclui vírus, os quais são
acelulares, muitas vezes considerados como sendo o limite entre seres vivos e não-vivos.
Você será apresentado a cada um desses grupos no decorrer das aulas.
Microbiologia é o estudo de organismos microscópicos. Esse nome deriva de três palavras
gregas: mikros (“pequeno”), bios (“vida”) e logos (“ciência”). Assim, microbiologia significa o estudo
da vida microscópica.
Os cientistas deduziram que os microrganismos originaram-se aproximadamente há quatro
bilhões de anos, a partir de um material orgânico complexo em águas oceânicas, ou
possivelmente de nuvens que circundavam nossa primitiva Terra. Como os primeiros indícios de
vida na Terra, os microrganismos são considerados ancestrais de todas as outras formas de vida.
Embora os microrganismos sejam antigos, a microbiologia é uma ciência jovem.
Pesquisadores observaram microrganismos pela primeira vez somente há 300 anos e eles foram
pouco compreendidos durante muitos anos após sua descoberta. Existe um período de quase 200
anos entre as primeiras observações até o reconhecimento de sua importância.
Em meio a muitas tentativas científicas de se obter novos conhecimentos sobre
microrganismos, algumas merecem ser mencionadas por terem contribuído mais intensamente ao
reconhecimento da microbiologia como ciência.
A primeira delas surgiu na segunda metade do século XIX, quando os cientistas provaram
que os microrganismos originaram-se de pais iguais a eles próprios e não de causas
sobrenaturais ou de plantas e animais em putrefação. Mais tarde, os cientistas provaram que os
microrganismos não são o resultado, mas sim a causa dos processos fermentativos no suco de
uva para a produção de vinho.
Eles também descobriram que um tipo específico de microrganismo causa uma doença
específica.
Estas informações foram o início do reconhecimento e da compreensão da influência
destas “novas” formas de vida sobre a saúde e o bem-estar do homem. Durante o início do século
XX, os microbiologistas aprenderam que os microrganismos são capazes de realizar muitas
reações químicas, que envolvem a quebra de substâncias e a síntese de novos compostos.
Igualmente importante foi a observação de que o mecanismo pelo qual as reações
químicas são produzidas pelos microrganismos é muito semelhante àquele que ocorre em formas
de vida superiores.
Durante as últimas décadas, os microrganismos têm surgido como parte do eixo principal
das ciências biológicas. Entre as razões para isto, está o conceito de “unidade em bioquímica”,
que significa que muitos dos processos bioquímicos que ocorrem em microrganismos são
essencialmente os mesmos em todas as formas de vida, inclusive o homem. Além disso, toda a
informação genética de todos os organismos, dos microrganismos a seres humanos, é codificada
pelo DNA.
Em virtude da relativa simplicidade em realizar experimentos com microrganismos,
associada à rápida velocidade de crescimento e de sua variedade de atividades bioquímicas, os
microrganismos tornaram-se o modelo experimental de escolha para o estudo da genética e de
fenômenos biológicos fundamentais.
Para compreender o atual estágio da ciência da microbiologia, precisamos conhecer como
ela chegou até onde estamos atualmente.
A descoberta do mundo microbiano inclui histórias sobre orgulho, nacionalismo, clamor
público para curas e questões sobre ética. Os primeiros cientistas que optaram por estudar
microbiologia foram motivados, no decorrer de suas descobertas, por competição, inspiração e
sorte. Houve conceitos errôneos que levaram a verdade, e verdades que não foram inicialmente
reconhecidas. Tudo começou com indivíduos fascinados pelo que os outros não podiam ver...
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Uma breve história da Microbiologia
A ciência da microbiologia iniciou há apenas algumas centenas de anos. Na verdade, os
ancestrais das bactérias foram os primeiros seres vivos na Terra.
As primeiras observações
Uma das descobertas mais importantes na história da biologia.
1. Robert Hooke observou em um microscópio extremamente simples que amostras de
cortiça eram compostas de “pequenas caixas”; ele introduziu o conceito de célula (1665).
Eram as menores unidades vivas.
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Antagonistas não se convenceram, eles argumentaram que o ar
fresco era necessário para a geração espontânea.
Iniciou novo experimento, 3 jarras foram cobertas com uma fina
rede, ao invés de serem lacradas. Nenhuma larva apareceu nas
jarras, embora ar fresco estivesse presente. As larvas apareciam
somente se fosse permitido que moscas deixassem seus ovos
sobre a carne.
Foi um forte golpe mas muitos cientistas ainda acreditavam que
pequenos organismos como os animálculos, eram
suficientemente simples para serem gerados a partir de materiais
não-vivos.
Needham respondeu que a “força vital” necessária para a geração espontânea tinha sido
destruída pelo calor e foi mantida fora dos frascos pelos lacres.
A força vital recebeu mais crédito quando Laurent Lavoisier mostrou a importância do
oxigênio para a vida. Criticaram que não havia oxigênio suficiente nos frascos lacrados de
Spallanzani para sustentar a vida mirobiana.
5. Contra a abiogênese: Franz Schulze (1815-1873) e Theodor Schwann (1810-1882) 60 a 70
anos depois: realizaram experiências onde aeraram infusões fervidas, fazendo o ar
atravessar soluções ácidas (Schulze), e outra que forçava o ar através de tubos aquecidos
ao rubro (Schwann).
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6. Contrário a abiogênese: Schröeder e Von Dush (1850) –
Tamponação com algodão. Realizaram experiência
semelhante a anterior, fazendo o ar passar por um algodão
para os frascos que tinham o ar aquecido.
As bactérias foram retidas no algodão (filtro) e não houve
crescimento de microrganismos no caldo. Nascia a técnica
de fechar os tubos de ensaio e erlenmeyers com tampões
de algodão.
7. A questão ainda estava sem solução quando Rudolf Virchow introduziu o conceito da
biogênese: células vivas somente podem surgir a partir de células preexistentes (1858).
Os argumentos sobre a geração espontânea continuaram até 1861 quando a questão foi
resolvida por Louis Pasteur.
8. Louis Pasteur demonstrou que os microrganismos estão presentes no ar e em todos os
lugares e ofereceu provas para a teoria da biogênese (1861).
Afirmou que os microrganismos podiam contaminar soluções estéreis, embora o próprio ar
por si só não criasse micróbios.
Ele encheu vários frascos, que continham a extremidade da abertura no formato de um
pescoço curto, com caldo de carne e ferveu seus conteúdos. Alguns deles, ele deixou que
esfriassem abertos. Em poucos dias estes frascos estavam contaminados com micróbios.
Os outros frascos, lacrados após fervura, estavam livres de microrganismos. Concluiu que
os micróbios do ar eram os responsáveis pela contaminação da matéria não-viva, assim
como os caldos nos frascos de Needham.
A seguir, colocou meio de cultura em frascos com a extremidade da abertura no formato de
um pescoço longo na forma da letra S. O conteúdo dos frascos foi fervido e resfriado. O
meio de cultura nos frascos não apodreceu e nem mostrou sinais de vida, mesmo após
meses. O modelo criado por Pasteur permitia que o ar entrasse no frasco, mas o pescoço
curvado prendia qualquer microrganismo presente no ar e que pudesse contaminar o meio.
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A Idade de Ouro da Microbiologia
1. Os rápidos avanços na ciência da microbiologia foram obtidos entre 1857 e 1914.
Chamada de Idade de Ouro. Rápidos avanços liderados por Pasteur e Robert Koch
levaram ao estabelecimento da microbiologia como uma ciência. Os microbiologistas
estudaram as atividades químicas dos microrganismos, aperfeiçoaram técnicas de
microscopia e de cultivo dos microrganismos e desenvolveram vacinas e técnicas
cirúrgicas.
Fermentação e Pasteurização
Etapa fundamental que estabeleceu relação entre microrganismos e doenças, ocorreu
quando um grupo de mercadores franceses pediu que Pasteur descobrisse porque os vinhos e
cervejas azedavam. Eles queriam impedir a deterioração destas bebidas quando elas eram
enviadas a longas distâncias. Muitos cientistas acreditavam que o ar convertia o açúcares desses
fluidos em álcool.
1. Pasteur descobriu que microrganismos chamados as leveduras fermentavam o açúcar a
álcool (convertiam na ausência de ar). Esse processo é chamado fermentação e é usado
na produção de vinho e cerveja. O azedamento e a danificação são causados por
microrganismos diferentes, as bactérias e que as bactérias podem oxidar o álcool a ácido
acético.
2. A solução de Pasteur foi aquecer o vinho e a cerveja o suficiente para matar a maioria das
bactérias que causavam o estrago. Um processo de aquecimento, denominado
pasteurização, é utilizado para matar bactérias em algumas bebidas alcoólicas e no leite. A
relação entre danificação de comidas e microrganismos foi o passo mais importante para
estabelecer a relação entre doenças e micróbios.
A teoria do germe da doença
A relação entre doenças e micróbios era desconhecida até relativamente pouco tempo.
Antes disso, tratamentos efetivos para muitas doenças eram descobertos por tentativa e erro, mas
as causas das doenças era desconhecidas. Essa relação alertou os cientistas para a possibilidade
dos microrganismos terem relação semelhante com plantas e animais – especificamente
causando doenças. Essa ideia foi chamada de Teoria do Germe da Doença. Teoria difícil de
acreditar porque muitos acreditavam que a doença era uma punição para crimes ou pecados
individuais ou por demônios.
1. Agostino Bassi (1835) provou que uma doença do bicho-da-seda era causada por um
fungo e Pasteur (1865) provou que outra doença do bicho-da-seda era causada por um
protozoário e desenvolveu método para identificar as larvas do bicho-da-seda que estavam
contaminadas mostraram uma forte relação entre os microrganismos e as doenças.
2. Joseph Lister introduziu o uso de um desinfetante para a limpeza das roupas cirúrgicas, a
fim de controlar as infecções nas pessoas (década de 1860). Era um cirurgião e aplicou
essa teoria nos procedimentos médicos, que naquela época não desinfetavam as mãos e
transmitiam infecções (febre às crianças recém-nascidas) de um paciente a outro.
Conheceu trabalhos de Pasteur. Desinfetantes não eram usados mas Lister sabia que o
fenol matava bactérias e começou a tratar ferimentos cirúrgicos com solução de fenol. Isso
reduziu as infecções e as mortes e outros cirurgiões adotaram o procedimento. Seus
estudos provaram que microrganismos são a causa das infecções cirúrgicas.
3. Robert Koch provou que os microrganismos causam doenças. Ele utilizou uma série de
procedimentos, chamados de postulados de Koch (1876), que são utilizados até hoje para
provar que um determinado microrganismo causa uma determinada doença.
Era médico e rival de Pasteur na disputa para descobrir a causa do antraz (carbúnculo)
que destruía rebanhos de gado e ovelha na Europa. Koch descobriu uma bactéria em
forma de bastão (Bacillus anthracis) no sangue do gado que morrera de antraz. Ele
cultivou a bactéria em meio nutriente e depois injetou amostras da cultura em animais
sadios. Quando esses animais adoeceram e morreram ele isolou a bactéria de seus
sangues e comparou as novas bactérias com as isoladas originalmente, e concluiu que as
duas amostras tinham a mesma bactéria.
Ele estabeleceu uma série de procedimentos experimentais para relacionar diretamente
micróbio específico com doença específica, chamados de postulados de Koch.
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POSTULADOS DE KOCH
1. O microrganismo deve estar sempre presente
nas lesões das plantas ou animais doentes
(ASSOCIAÇÃO CONSTANTE)
Vacinação
Frequentemente, um tratamento ou uma medida preventiva é desenvolvido antes que os
cientistas saibam como funciona. A vacina contra varíola é um exemplo disso. Em 4 de maio de
1796, quase 70 anos antes de Koch estabelecer que um microrganismo específico era o causador
do antraz, Edward Jenner, jovem médico britânico, iniciou experimento para encontrar uma
maneira de proteger as pessoas contra a varíola.
As epidemias de varíola eram muito temidas. A doença aparecia periodicamente por toda
Europa, matando milhares e liquidou 90% dos nativos na Costa Oeste norte-americana quando os
colonizadores europeus levaram a infecção para o Novo Mundo.
1. Na vacinação, a imunidade (resistência a uma determinada doença) é conferida pela
inoculação com uma vacina.
2. Em 1798, Edward Jenner demonstrou que a inoculação com material de vacínia
proporciona imunidade aos seres humanos contra varíola.
Quando uma jovem que trabalhava na ordenha de vacas informou a Jenner que ela não
contrairia varíola porque já havia estado doente de vacínia – doença muito mais amena
que a varíola – ele decidiu testar a história da garota. Primeiro, ele coletou amostras de
feridas de vacínia. Então inoculou um voluntário saudável de 8 anos de idade com o
materia retirado das feridas de vacínia por meio de pequenos arranhões no braço do
garoto com uma agulha contaminada. Os arranhões deram origem às bolhas, típicas da
doença. Em poucos dias, o voluntário estava medianamente doente, mas se recuperou
rapidamente e nunca mais contraiu vacínia nem varíola.
O processo foi chamado de vacinação, da palavra
latina vacca, significando gado. Pasteur deu esse
nome em homenagem ao trabalho de Jenner. A
proteção contra uma doença fornecida pela
vacinação (ou pela recuperação da própria
doença) é chamada de imunidade.
3. Por volta de 1880, Pasteur descobriu que uma
bactéria não-virulenta poderia ser utilizada como
uma vacina para a cólera em aves domésticas; ele
criou a palavra vacina.
Anos após os experimentos de Jenner, por volta de 1880, Pasteur descobriu como
funcionava a vacinação. Ele descobriu que a bactéria que causava a cólera nas aves
domésticas perdia a capacidade de causar a doença (perdia a virulência ou tornava-se
avirulenta) depois que era mantida por longos períodos no laboratório. Entretanto, este e
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outros microrganismos com virulência diminuída eram capazes de induzir imunidade contra
infecções subsequentes de seus companheiros virulentos. A descoberta desse fenômeno
forneceu a chave para o sucesso do experimento de Jenner com vacínia. Ambas, vacínia e
varíola, são causadas por vírus. Mesmo que o vírus que causa vacínia não seja um
derivado do vírus da varíola produzido em laboratório, sua semelhança com o vírus da
varíola é tão grande que ele pode induzir imunidade para ambas as viroses. Pasteur usou
o termo vacina para as culturas de microrganismos avirulentos, utilizadas para inoculação
preventiva.
4. As vacinas modernas são preparadas a partir de microrganismos não-virulentos, de
patógenos mortos, ou de componentes de patógenos e pela tecnologia do DNA
recombinante.
O experimento de Jenner foi o primeiro que ocorreu na cultura ocidental que utilizou um
agente viral vivo – o vírus da vacínia – para produzir imunidade. Na China antiga, os
médicos imunizavam seus pacientes pela remoção de escamas de pústulas ressecadas de
pessoas que estavam sofrendo de casos moderados de varíola, transformavam essas
escamas em um pó fino e inseriam esse pó nas narinas das pessoas para serem
protegidas.
Algumas vacinas ainda são produzidas a partir de linhagens avirulentas de micróbios, que
produzem imunidade contra as linhagens virulentas. Outras vacinas são feitas a partir de
micróbios mortos, de componente isolados dos microrganismos virulentos ou pelas
técnicas de engenharia genética.
O nascimento da quimioterapia moderna: sonhos de uma “bala mágica”
Após estabelecer relação microrganismos-doenças, médicos microbiologistas direcionaram
suas pesquisas para as substâncias que poderiam destruir os microrganismos patogênicos sem
prejudicar os animais infectados ou os seres humanos.
1. Quimioterapia é o tratamento químico de uma doença. O tratamento das doenças
utilizando substâncias químicas é chamado de quimioterapia. (Esse termo também refere-
se geralmente ao tratamento químico de doenças não-infecciosas como o câncer.)
2. Dois tipos de agentes quimioterápicos são as drogas sintéticas (químicos preparados em
laboratório) e antibióticos (substâncias produzidas naturalmente por bactérias e fungos
para inibir o crescimento de outros microrganismos). A base do sucesso da quimioterapia
está no fato de que alguns químicos são mais venenosos para os microrganismos que
para os hospedeiros infectados por esses micróbios.
3. Paul Ehrlich utilizou um produto químico contendo arsênico, denominado salvarsan, para o
tratamento da sífilis (1910). Ele disparou o primeiro tiro na revolução da quimioterapia.
Como estudante de medicina, especulou a respeito de uma “bala mágica”, que poderia
combater e destruir um patógeno, sem prejudicar o hospedeiro infectado. Após testar
centenas de substâncias, encontrou o salvarsan, derivado de arsênico, efetivo no combate
à sífilis. Salvarsan = salvação para a sífilis e por ter arsênico.
Antes da descoberta o único composto químico conhecido era um extrato retirado da casca
de uma árvore sul-americana, quinino, que havia sido utilizado pelos conquistadores
espanhóis no tratamento da malária.
No final da década de 30, haviam sido desenvolvidas outras drogas para destruir
microrganismos. Muitas eram derivadas de corantes (testavam corantes sintetizados e
produzidos para tecidos na busca de propriedades antimicrobianas). As sulfonamidas
(drogas derivadas da sulfa) foram sintetizadas no mesmo período.
4. Alexander Fleming observou que o bolor (fungo) Penicillium inibia o crescimento de uma
cultura de bactérias. Ele chamou o ingrediente ativo de penicilina (1928).
O primeiro antibiótico foi descoberto por acidente. Alexander Fleming quase estava
descartando algumas culturas em placas que haviam sido contaminadas por fungos
quando observou cuidadosamente o curioso padrão de crescimento nas placas
contaminadas. Havia uma área clara ao redor do fungo onde a cultura de bactéria havia
sido inibida.
Ele observou que um tipo de fungo podia inibir o crescimento da bactéria.
O fungo foi mais tarde identificado como Penicillium notatum e, em 1928, Fleming nomeou
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o inibidor ativo do fungo de penicilina. Assim, penicilina é um antibiótico produzido por um
fungo. Sua utilidade não foi aparente até a década de 40, quando foi testada clinicamente
e produzida em grande escala.
A penicilina tem sido utilizada clinicamente como antibiótico desde a década de 40.
5. Os pesquisadores estão atacando o problema de resistência dos micróbios às drogas.
PROBLEMA 1: Muitos antibióticos foram desenvolvidos. Infelizmente, antibióticos e outras
drogas quimioterápicas não estão livres de problemas. Muitos químicos antimicrobianos
são muito tóxicos para os seres humanos para serem aplicados; matam os micróbios
patogênicos mas também prejudicam o hospedeiro infectado.
A toxicidade para o homem é um problema específico no desenvolvimento de drogas para
o tratamento de doenças virais. O crescimento viral depende dos processos vitais de
células normais do hospedeiro. Portanto, existem poucas drogas antivirais usadas com
sucesso, uma vez que um droga interfere na reprodução viral provavelmente afeta também
as células saudáveis do organismo.
PROBLEMA 2: Outro problema com as drogas antimicrobianas é o aparecimento e a
dispersão de variedades novas de microrganismos que são resistentes aos antibióticos. A
resistência a drogas resulta de mudanças genéticas nos micróbios que os torna tolerantes
a uma certa quantidade de antibiótico que normalmente inibiria seu crescimento.
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Exercícios
1. Qual o conceito de célula? Qual pesquisador empregou esse conceito pela primeira vez? Que
instrumento ele utilizou?
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2. Quem foi o primeiro a observar os microrganismos vivos através de lentes de aumento? Como ele
os chamava?
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3. Explique o conceito de geração espontânea. Qual o outro nome dado a esse conceito? Cite
exemplos das crenças relacionadas a essa teoria.
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8. Explique, em detalhes, qual foi a etapa fundamental que estabeleceu relação entre microrganismos
e doenças (qual experimento foi feito, por quem, qual a conclusão).
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9. O que era a “Teoria do Germe da Doença”? Como a teoria da biogênese abriu o caminho para a
teoria do germe da doença?
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c) Robert Koch
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11. Explique como foi a descoberta da vacina. Qual pesquisador foi responsável?
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15. O que é penicilina? Como ela foi descoberta? Por qual cientista?
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16. Cite e explique dois problemas atuais relacionados ao uso indiscriminado de antibióticos.
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17. Pesquise na Internet e faça a correspondência entre pesquisadores e contribuições para o avanço
da microbiologia.
___ Avery, MacLeod e McCarty (a) Desenvolvimento da vacina contra a varíola
___ Beadle e Tatum (b) Descobriu como o DNA controla a síntese de
proteínas dentro de uma célula
___ Berg
(c) Descobriu a penicilina
___ Ehrlich
(d) Descobriu que o DNA pode ser transferido de uma
___ Fleming
bactéria para outra
___ Hooke
(e) Refutou a geração espontânea
___ Iwanowski
(f) O primeiro a caracterizar um vírus
___ Jacob e Monod
(g) O primeiro a utilizar desinfetantes nos
___ Jenner procedimentos cirúrgicos
___ Koch (h) O primeiro a observar as bactérias
___ Lancefield (i) O primeiro a observar células em material vegetal e
a nomeá-las
___ Lederberg e Tatum
(j) Observou que os vírus eram passíveis de serem
___ Lister
filtrados
___ Pasteur
(k) Provou que o DNA é o material hereditário
___ Stanley
(l) Provou que os microrganismos podem causar
___ van Leeuwenhoek doenças
___ Virchow (m) Preconizou que as células vivas surgem a partir
de células vivas preexistentes
___ Weizmann
(n) Mostrou que os genes codificam as enzimas
(o) Misturou DNA animal com DNA de bactérias
(p) Utilizou bactérias para produzir acetona
(q) Utilizou o primeiro agente quimioterápico sintético
(r) Propôs um sistema de classificação para os
estreptococos com base nos antígenos de suas
paredes celulares
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Classificação dos microrganismos.
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A Tabela mostra esquemas de classificação de 3 espécies: uma bactéria, uma alga e um
animal.
Organismo
Taxa (categorias)
Gato Alga Bactéria
Reino ou grupo principal Animal Plantae Eubacteria
Divisão Chlorophyta Gracillicutes
Filo Chordata
Subfilo Vertebrata
Classe Mammalia Chlorophyceae Scotobacteria
Subclasse Eutheria
Ordem Carnivora Volvocales Spirochaetales
Família Felidae Chlamydomonadaceae Leptospiraceae
Gênero Felis Clamydomonas Leptospira
Espécie F. domesticus C. eugametos L. interrogans
O sistema de nomenclatura (nomeação) em uso atualmente para os organismos foi
estabelecido em 1735 por Carolus Linnaeus. Os nomes científicos são latinizados porque o latim
era a língua tradicionalmente utilizada pelos estudantes. A nomenclatura científica para cada
organismo designa para cada organismo dois nomes – o gênero é o primeiro nome, sempre
iniciado com letra maiúscula; o epíteto específico (nome das espécies) segue o gênero e não se
inicia por letra maiúscula. Assim, o nome de uma espécie é sempre dado como uma combinação
latina de duas partes (binomial): nome do gênero + nome específico que denota a espécie.
O organismo é designado pelos dois nomes, o gênero e o epíteto específico, ambos sendo
sublinhados ou escritos em itálico. Por tradição, após um nome científico ter sido mencionado uma
vez, ele pode ser abreviado com a inicial do nome do gênero seguido pelo epíteto específico. Por
exemplo, o homem pertence à espécie Homo sapiens, enquanto a bactéria que causa a doença
de Lyme pertence à espécie Borrelia burgdorferi.
Durante a metade do século XVIII, todos os organismos vivos foram distribuídos por
Carolus Linnaeus em dois reinos, Plantae e Animalia. Embora seu trabalho pioneiro tenha grande
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contribuição científica, este e outros sistemas de classificação iniciais apresentavam falhas ou
esquemas errados, porque eram baseados em informações imprecisas. Atualmente, os sistemas
de classificação, particularmente aqueles para microrganismos, estão evoluindo ainda, pois os
pesquisadores estão descobrindo mais informações sobre as características físicas e químicas
dos organismos.
1) Reino Protista
Em seu sistema de classificação, Linnaeus colocou os protozoários no reino animal e
outros microrganismos com as plantas. Mas esse conceito simples era impraticável para os
microrganismos, alguns dos quais são predominantemente semelhantes às plantas, outros aos
animais e outros têm características de ambos. Em 1866, Ernst H. Haeckel propôs um terceiro
reino para resolver o dilema, o reino Protista, que incluía aqueles microrganismos que tinham
características tanto de plantas como de animais. De acordo com ele, bactérias, algas e
protozoários foram incluídos nesse reino. Mas com acesso às informações sobre as estruturas
internas dos microrganismos, a validade do reino Protista foi questionada.
Principais esquemas de classificação de organismos vivos.
Esquema de classificação Reinos Organismos incluídos
Linnaeus (1753) Plantae Bactérias, fungos, algas, plantas.
Animalia Protozoários e animais superiores
Haeckel (1865) Plantae Algas multicelulares e plantas.
Animalia Animais.
Protista Microrganismos incluindo bactérias,
protozoários, algas, bolores e leveduras.
Whittaker (1969) Plantae Algas multicelulares e plantas.
Animalia Animais.
Protista Protozoários e algas unicelulares.
Fungi Bolores e leveduras.
Monera Todas as bactérias (procariotos)
Woese (1977) Archaeobacteria Bactérias que produzem gás metano,
requerem altas concentrações de sal ou altas
temperaturas.
Eubacteria Todas as outras bactérias, incluindo aquelas
mais familiares aos microbiologistas, tais
como causadoras de doenças, bactérias de
solo e da água e bactérias fotossintéticas.
Eucaryotes Protozoários, algas, fungos, plantas e
animais.
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Nesse esquema de classificação, os procariotos constituem o reino Monera, que até
recentemente foi considerado o reino mais primitivo e acreditava-se que era o ancestral dos
eucariotos. Os procariotos normalmente obtêm nutrientes somente por absorção, e não podem
ingerir alimentos ou realizar fotossíntese (como as plantas). O reino Protista inclui os
microrganismos eucarióticos unicelulares, que representam os 3 tipos nutricionais: as algas são
fotossintéticas, os protozoários podem ingerir seu alimento e os fungos limosos (inferiores)
somente absorvem os nutrientes. Organismos eucarióticos superiores são colocados nos reinos
Plantae (plantas verdes fotossintéticas e algas superiores), Animalia (animais que ingerem os
alimentos) e Fungi, organismos que têm parede celular mas não apresentam o pigmento
fotossintético clorofila encontrado em outras plantas, portanto eles absorvem os nutrientes.
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Evidências para sustentar essa ideia vieram de estudos com o ácido ribonucléico
ribossômico, ou rRNA, que é essencial para a síntese protéica e, portanto, para a sobrevivência
da célula. Foi descoberto que nos ribossomos de todos os organismos vivos, o rRNA é composto
de muitas unidades pequenas denominadas ribonucleotídeos. Existem 4 tipos de
ribonucleotídeos, arranjados em várias combinações para formar uma única e longa cadeia de
centenas de unidades. O rRNA de qualquer organismo particular tem um arranjo distinto de
ribonucleotídeos, ou seja, uma sequência nucleotídica específica. (O RNA difere do DNA por ser
uma fita simples, apresentar ribose em vez de desoxirribose, e uracila (U) em vez de timina (T). As
outras 3 bases adenina (A), guanina (G) e citosina (C) ocorrem tanto em RNA quanto em DNA.)
Os genes que controlam a sequência nucleotídica de rRNA variam lentamente durante
milhões de anos de evolução. Portanto, o rRNA pode servir como um indicador de como os
organismos estão intimamente relacionados e algumas regiões da molécula de rRNA de todos os
organismos vivos permanecem quase as mesmas. Esta constância sustenta a ideia de que todos
os organismos têm se desenvolvido de formas ancestrais comuns.
Ao mesmo tempo, a quantidade de diferenças entre as outras regiões de rRNA pode ser
usada para medir o grau de relacionamento entre os organismos. Por exemplo, se as sequências
de ribonucleotídeos de dois tipos de organismos diferem em grande extensão, a relação entre
ambos é muito distante; isto é, os organismos divergiram há muito tempo de um ancestral comum.
Porém, se as sequências mostram mais similaridades, os organismos estão intimamente
relacionados e têm um ancestral em comum relativamente recente.
Usando essas técnica, Woese descobriu que as moléculas de rRNA em grupos de
organismos diferem no arranjo e na sequência de seus nucleotídeos. Os eucariotos possuem um
tipo geral de sequência e o procariotos, um segundo tipo. Mas ele também descobriu que alguns
procariotos têm um terceiro tipo de rRNA e o arranjo desse rRNA difere dos outros procariotos e
dos eucariotos. Em outras palavras, existem dois tipos principais de bactérias, chamadas de
arqueobactérias e eubactérias, que são tão diferentes uma das outras como também são dos
eucariotos.
20
Exercícios
4) Qual a função do material que fica no núcleo de uma célula, envolto ou não por uma
membrana?
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21
10) Escreva corretamente o nome científico dos microrganismos:
a) o gênero de uma bactéria é “clostridium” e o epíteto específico é “botulinum”:
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12) Quais os três reinos em que Haeckel classificava os organismos? Qual continha os
microrganismos?
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14) Qual é a base do sistema de classificação de cinco reinos proposto por Whittaker? Quais são
os três modos principais? Descreva cada um deles.
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15) Quais são os cinco reinos propostos por Whittaker? Que organismos estão presentes em cada
um deles?
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22
Metabolismo microbiano.
1. Metabolismo microbiano
- Metabolismo é a soma de todas as reações químicas dentro de um organismo vivo. Como as
reações químicas liberam ou requerem energia, o metabolismo é o balanceamento de energia.
- Metabolismo pode ser dividido em duas classes de reações químicas: reações que liberam
energia e reações que requerem (absorvem) energia.
- Nas células vivas, as reações reguladas por enzimas que liberam energia estão envolvidas no
catabolismo, a quebra de compostos orgânicos complexos em compostos mais simples. São
reações chamadas de catabólicas ou degradativas. Essas reações são geralmente de hidrólise
(reações que usam água e nas quais ligações químicas são quebradas) e são exergônicas
(produzem mais energia que consomem). Exemplo: células quebram açúcares em dióxido de
carbono e água.
- As reações reguladas por enzimas que requerem energia estão envolvidas no anabolismo, a
construção de moléculas orgânicas complexas a partir de moléculas orgânicas mais simples. São
chamadas de reações anabólicas ou biossintéticas. Essas reações muitas vezes envolvem
reações de síntese por desidratação (reações que liberam água) e são endergônicas (consomem
mais energia do que produzem). Exemplos: formação de proteínas a partir de aminoácidos, ácidos
nucléicos a partir de nucleotídeos e polissacarídeos a partir de açúcares simples. Essas reações
biossintéticas geram os materiais para o crescimento celular.
- O ATP é formado por uma adenina, uma ribose e três grupos fosfato. Quando o grupo fosfato
terminal é retirado do ATP, difosfato de adenosina (ADP) é formado, e energia é liberada para
dirigir as reações anabólicas.
A energia das reações catabólicas é usada para combinar ADP e um P para sintetizar novamente
ATP:
- A composição química de uma célula viva está constantemente mudando, algumas moléculas
são quebradas enquanto outras estão sendo sintetizadas. Esse fluxo balanceado de compostos
químicos e energia mantém a vida de uma célula.
- Vias metabólicas que existem nas células são sequências de reações químicas catalisadas por
enzimas.
23
2. Produção de energia
- Moléculas nutrientes, como todas as moléculas, têm energia associada com os elétrons que
formam as ligações entre seus átomos.
- Quando essa energia está distribuída por toda a molécula, é difícil para a célula utilizá-la.
- Várias reações em vias catabólicas, contudo, concentram a energia dentro das ligações do ATP,
que serve como um transportador de energia.
- ATP tem “ligações de alta energia”, ou “ligações instáveis”. Embora a quantidade de energia
nessas ligações não seja excepcionalmente grande, ela pode ser liberada rápida e facilmente.
- ATP = querosene (líquido altamente inflamável), embora uma grande tora de madeira possa
eventualmente queimar e produzir mais calor que uma xícara de querosene, o querosene tem
ignição mais fácil e proporciona calor mais rápido. De forma semelhante, as ligações instáveis de
“alta energia” do ATP suprem a célula com energia prontamente disponível para reações
anabólicas.
- Exemplo de uma oxidação em que a molécula A perde um elétron para a molécula B. A molécula
A sofreu oxidação (significando que ela perdeu um ou mais elétrons), enquanto a molécula B
sofreu redução (significando que ela ganhou um ou mais elétrons).
redução
é
→
A B A oxidada B reduzida
oxidação
- Reações de oxidação-redução sempre estão acopladas, cada vez que uma substância é
oxidada, uma outra é simultaneamente reduzida.
24
- Os organismos liberam e armazenam energia de moléculas orgânicas por meio de uma série de
reações controladas, ao invés de ser uma única explosão. Se a energia fosse liberada toda de
uma só vez, como uma grande quantidade de calor, ela não poderia ser prontamente utilizada
para impulsionar as reações químicas e causaria, de fato, danos à célula. Para extrair energia de
compostos orgânicos e a armazenar na forma química, os organismos passam elétrons de um
composto a outro por meio de uma série de reações redox.
3. Catabolismo de carboidratos
- Maioria dos microrganismos oxida carboidratos como fonte primária de energia celular.
Catabolismo de carboidratos para produzir energia é de grande importância no metabolismo
celular.
- Glicose é a fonte mais comum de energia de carboidrato utilizada pelas células, mas
microrganismos também podem catalisar lipídios e proteínas para produzir energia
- Para produzir energia a partir da glicose, os microrganismos usam dois processos gerais:
respiração celular e fermentação.
- Respiração ocorre em três etapas: glicólise, ciclo de Krebs e a cadeia (sistema) de transporte de
elétrons.
- Fermentação também inicia com a etapa da glicólise, mas após converter glicose em ácido
pirúvico, este é convertido em um ou mais produtos diferentes, dependendo do tipo de célula, por
exemplo: álcool (etanol) e ácido lático. Rendimento de ATP é menor.
25
- Respiração é definida como um processo de geração de ATP em que moléculas são oxidadas e
o receptor final de elétrons é (quase sempre) uma molécula inorgânica. Existem 2 tipos de
respiração: aeróbica, que usa oxigênio e onde o receptor final de elétrons é o O 2; e anaeróbica,
que não usa oxigênio e ainda pode ser morto por ele e o receptor final de elétrons é uma molécula
inorgânica (exceto oxigênio molecular) ou raramente, uma molécula orgânica. A respiração
anaeróbica é importante para ciclos de enxofre e nitrogênio (bactérias que usam nitrato e sulfato
como aceptores finais de elétrons). A quantidade de ATP gerada na respiração anaeróbica varia
com o microrganismo e a via. Como somente uma parte do ciclo de Krebs funciona sob condições
anaeróbicas, e como nem todos os transportadores participam da cadeia transportadora de
elétrons, o rendimento de ATP nunca é tão alto como na respiração aeróbica, consequentemente,
os anaeróbios crescem mais lentamente que os aeróbios.
26
- Fermentação:
- libera energia de açúcares ou moléculas orgânicas, tais como aa, ácidos
orgânicos, purinas e pirimidinas
- não requer oxigênio (mas algumas vezes pode ocorrer na presença desse)
- não requer uso do ciclo de Krebs ou de uma cadeia de transporte de
elétrons
- usa molécula orgânica como aceptor final de elétrons
- produz pequenas quantidades de ATP, porque grande parte da energia
original da glicose permanece nas ligações químicas dos produtos finais orgânicos, como ácido
lático ou etanol.
4. Fotossíntese
- em todas as vias anteriores, os microrganismos obtêm energia para o trabalho celular pela
oxidação de compostos orgânicos. Mas onde os microrganismos obtêm esses compostos
orgânicos?
- Fonte de energia:
- fototróficos: usam luz como fonte de energia primária
- quimiotróficos: dependem de reações de redox de compostos orgânicos ou
inorgânicos para energia
- Fonte de carbono:
- autotróficos: nutrição própria, usam dióxido de carbono
- heterotróficos: nutrição depende dos outros, requerem fonte de carbono
orgânica
Exercício
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28
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Morfologia, reprodução e classificação bacteriana.
Procariontes – Monera
células procariontes ou
procariotas
não possuem carioteca
(membrana nuclear),
membrana que separa o
material genético do citoplasma
Existe material genético nas duas, mas nas procariontes este está “boiando” no
citoplasma, e na célula eucarionte o material genético está no núcleo – separado pela carioteca do
restante da célula.
BACTÉRIAS
1) Estrutura
- grego → “bakteria” = bastão
- são seres microscópicos → menor ser vivo
- unicelulares
- célula bacteriana é procariota (material genético não envolto por membrana nuclear)
- ausência de estruturas membranosas intracelulares
30
Membrana Parede celular
Citoplasma plasmática
Cápsula
Fímbrias
a) Parede celular
- complexa, semi-rígida e responsável pela forma da célula
- circunda a membrana plasmática frágil
- componente principal é uma rede de macromoléculas chamada PEPTIDEOGLICANO
(glicoproteína)
PEPTIDEO = Filas adjacentes de polissacarídeo são ligadas por polipeptídeos
GLICANO = Dissacarídeo repetitivo formando polissacarídeo - “Esqueleto de carboidratos”
N-acetil-ácido murâmico
Staphylococcus aureus
N-acetilglucosamina
Peptídeos
Classificação
- de acordo com suas respostas à coloração de Gram, as bactérias se dividem em 2 grupos:
Membrana plasmática
31
Gram negativas: 10 % de peptideoglicano = (1-2 camadas) 2-3 nm
Camada lipoprotéica
Parede celular
externa, espessa,
Proteína semelhante à membrana
plasmática, com
lipopolissacarídeos
Lipoproteínas
Membrana plasmática
Esquema de parte da parede celular e da
membrana plasmática de bactéria gram-negativa.
- Glicocálice
- cápsula = “revestimento de açúcar”
- polímero viscoso e gelatinoso situado externamente à parede celular
- composição variável: polissacarídeos e/ou polipeptídeos
- proteção e adesão as superfícies
Exemplo 1: certas espécies, cápsulas são importantes para a virulência bacteriana, protegem
bactérias patogênicas da fagocitose pelas células do hospedeiro: Bacillus anthracis – somente a
bactéria encapsulada causa o antraz (carbúnculo)
Exemplo 3: S. mutans, causa cárie dentária pois se fixa na superfície dos dentes por meio de seu
glicocálice
32
- Flagelos
- presença não obrigatória
- apêndices longos, finos e helicoidais
- originam-se na membrana plasmática
- distribuídos em número variável
- mobilidade por rotação (até 12.000 rpm)
- Fímbrias
- presença não obrigatória
- apêndices protéicos, pequenos e imóveis
- adesão a substratos/superfícies, várias unidades por célula, biofilmes
33
- Pili
- presença não obrigatória
- apêndices protéicos, pequenos e imóveis
- unem células bacterianas na transferência de DNA de uma célula para outra (conjugação),
geralmente 1 unidade por célula
- Membrana plasmática
- estrutura fina no interior da parece celular que reveste o citoplasma
- composição: fosfolipídeos e proteínas
- permeabilidade seletiva
- Citoplasma
- material em solução (sais minerais, proteínas, carboidratos, lipídios)
- ribossomos (RNA + proteína): síntese protéica
- nucleóide: formado pelo cromossomo bacteriano (única molécula longa, contínua, em forma
circular de DNA de dupla fita)
Citoplasma DNA
Ribossomos
- Endosporos
- células de “repouso” formadas por certas bactérias gram-positivas quando nutrientes essenciais
se esgotam
- estruturas de resistência ao calor, radiações, ácidos, produtos químicos e enzimas
- dormentes por milhares de anos, podem iniciar germinação
- exemplo 1: endosporos com 7500 anos de Thermoactinomyces vulgaris do lodo congelado do
lago Elk (EUA) germinou quando reaquecido e colocado em meio nutriente
- exemplo 2: endosporos com 25 a 40 milhões de anos, intestino de abelha sem ferrão aprisionada
em âmbar (resina de árvore endurecida) na República Dominicana germinaram quando colocados
em meio nutriente.
- Gênero Clostridium (gangrena, tétano, botulismo, intoxicação alimentar); gênero Bacillus (antraz
ou carbúnculo e intoxicação alimentar)
- indústria alimentícia
- Esporulação ou esporogênese = germinação (retorno ao estado vegetativo)
34
2) Morfologia
- são unicelulares, exceto os actinomicetos
- de acordo com a forma que apresentam, as bactérias são classificadas em: cocos, vibriões
- cada grupo possui subdivisões.
Chlamydia trachomatis
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Streotococcus
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________________________________
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Mycobacterium tuberculosis
________________________________
________________________________ ________________________________
Vibrio cholerae
________________________________
Treponema pallidum
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RESUMINDO...
36
3) Reprodução
Assexuada, por bipartição ou divisão binária simples
- 2 células filhas iguais, multiplicação
4) Respiração
- Aeróbias estritas: necessitam de O2 para sua sobrevivência (ar contém 21% de O2)
- Aeróbias microaerófilas: necessitam de O2 mas em concentração menor que a encontrada no ar
- Aeróbias facultativas: podem crescer tanto na presença como na ausência de oxigênio. Não
necessitam de O2, crescem melhor com O2. Podem usar O2 quando disponível, mas na sua
ausência, são capazes de continuar seu crescimento através da respiração anaeróbia ou da
fermentação.
- Anaeróbias obrigatórias: não toleram O2 (letal).
- Anaeróbias aerotolerantes: não necessitam de O 2, crescem melhor sem O2 pois não podem usá-
lo para seu crescimento.
AERÓBIAS ANAERÓBIAS AERÓBIAS MICRO ANAERÓBIAS
ESTRITAS ESTRITAS FACULTATIVAS AERÓFILAS AEROTOLERANTES
37
5) Nutrição
- Heterótrofos (maioria):
- Saprófitos = decompõem material orgânico de animais e plantas mortas e absorvem os
nutrientes. Reciclagem – papel ecológico
- Parasitas = absorvem os nutrientes de hospedeiros vivos. Patógenos de plantas e animais
- Mutualistas = associação íntima com outros organismos
- Autótrofos
- Fotoautotróficos = obtêm a energia na forma de luz, para a fotossíntese
- Quimioautotróficos = obtêm energia pela oxidação de compostos químicos: açúcar, proteínas,
gorduras, celulose, petróleo, manganês, gasolina, …
6) Importância
- decompositoras, fazem a reciclagem e a fertilização do solo
- fixadoras de nitrogênio atmosférico (N 2), são capazes de utilizar N gasoso diretamente da
atmosfera
* bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium = obtenção de N para elas e para
plantas que convivem simbioticamente (leguminosas: soja, feijão)
* cultivo de leguminosas = maior fertilidade do solo sem a necessidade de implementação
de fertilizantes químicos, liberam nitratos (NO-3) no solo
- alimentos = produção de iogurtes, queijos, pickles, chucrute, leites fermentados, vinagre,
bebidas, carnes curadas (salames e embutidos), molho de soja
- produtos de valor industrial = antibióticos, vitaminas, acetona, metanol, butanol, …
- tratamento de esgotos = degradação dos resíduos orgânicos
- usinas de reciclagem de lixo = produção de adubos de compostagem
- biotecnologia = ferramentas da engenharia genética = bactérias capazes de produzir drogas
terapêuticas (insulina), bactérias p/ biodegradação de lixos tóxicos (derrames de hidrocarbonetos)
- cirurgia plástica = toxina botulínica (espécie de Clostridium botulinum) paralisa musculatura,
relaxando-a = “Botox”, usado em pequenas quantidades p/ atenuação de rugas e marcas de
expressão
- bacterioses humanas = antraz, botulismo, cárie, cólera, coqueluche, febre tifóide, gastroenterites,
gonorréia, hanseníase (lepra), intoxicação alimentar, meningite, pneumonia, sífilis, tétano,
tuberculose
Exercícios
4) Qual o componente principal da parede celular bacteriana? Qual sua função para a célula
bacteriana?
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5) Como as bactérias são classificadas de acordo com a coloração de Gram?
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6) Quais são as diferenças entre as paredes celulares das bactérias Gram-negativas e Gram-
positivas?
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14) Explique por que a formação dos endósporos nas bactérias não é um modo de reprodução da
célula.
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15) Como o endosporo bacteriano pode causar problemas na indústria alimentícia?
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19) Há um cuidado que deve ser tomado quando se compra um alimento enlatado. Devemos observar
não só a data de fabricação e o prazo de vencimento do produto, mas também o aspecto da lata que
não deve se apresentar estufada, pode ter-se desenvolvido, dentre outras bactérias, a produtora do
botulismo, uma doença frequentemente fatal.
a) Que tipo de respiração essa bactéria mantêm no interior da lata fechada?
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b) No caso do produto contaminado, o que causou a pressão no interior da lata, estufando a tampa?
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21) A meningite meningocócica, cuja profilaxia, principalmente entre escolares, se fez com vacinas
conhecidas como ‘tipo A’ e ‘tipo C’, é uma infecção causada:
a) somente por vírus. b) por bactérias formadas por bastão ou bacilos.
c) por bactérias de forma esférica. d) por vírus e bactérias.
e) por vírus e riquétsias
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22) Bactérias causadoras de infecção e que são vistas ao microscópio como grupamento de glóbulos
em cacho certamente são:
a) estafilococos. b) estreptococos.
c) diplococos. d) micrococos.
e) bacilos.
23) Muitas doenças humanas são produzidas por vírus. Marque da relação seguinte a única de origem
bacteriana:
a) gripe b) caxumba
c) tétano d) sarampo
e) varíola
24) Numere a Segunda coluna de acordo com a primeira e de pois assinale a alternativa que contenha
a sequência correta:
Coluna I Coluna II
(1) bacilos ( ) cocos em grupos densos
(2) estreptococos ( ) cocos em grupos aproximadamente cúbicos
(3) estafilococos ( ) cocos em fileira
(4) tétrades ( ) filamentos helicoidais
(5) sarcina ( ) bastonete reto em geral de 1 a 15 micra
(6) espirilos ( ) cocos em grupo de quatro
a) 3-2-5-6-1-4 b) 3-5-2-6-1-4
c) 3-5-2-1-6-4 d) 3-5-2-6-4-1
e) 3-5-1-2-4-6
25) Em relação a morfologia, as bactérias com formas esféricas, de bastão, em cacho de uva e em
colar denominam-se, respectivamente:
a) cocos, bacilos, estafilococos, estreptococos. b) bacilos, cocos estafilococos, estreptococos.
c) cocos, bacilos, estreptococos, estafilococos. d) bacilos, cocos, estreptococos, estafilococos.
e) estreptococos, estafilococos, bacilos, cocos.
41
29) A água oxigenada utilizada na limpeza de ferimentos, ao entrar em contato com o sangue, libera
gás oxigênio, impedindo a sobrevivência de bactérias, como as do tétano, por exemplo.
Pode-se dizer, então, que a bactéria Clostridium tetani é:
a) Aeróbica facultativa, pois utiliza o oxigênio, quando disponível, para a obtenção de energia.
b) Anaeróbica obrigatória, pois não utiliza o oxigênio para a obtenção de energia.
c) Anaeróbica facultativa, pois, na falta de oxigênio, fermentam açúcares.
d) Quimiossintética, pois utiliza a energia proveniente das descargas elétricas.
e) Fotossintetizante, já que utiliza o Sol para a obtenção de energia.
42
COLORAÇÃO DE GRAM
Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso
não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma
coloração diferencial. Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de
bactérias. Entre estes, o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884.
Usando duas seqüências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão
das bactérias em 2 grandes grupos.
O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado
Gram positivo. O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo
corante utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo.
Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como mordente (um composto químico que fixa um
corante ou outra substância ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolúvel) para
a primeira etapa da coloração. Há também um agente descorante entre a utilização de um e
outro corantes. Pode-se utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de
descoloração desejada. O álcool etílico a 95% é um agente descorante mais devagar, enquanto a
acetona agiliza essa etapa. Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool etílico e acetona (95:5),
obtendo uma velocidade de descoloração intermediária.
A maioria dos cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que
são os únicos Gram negativos. Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram
negativos. Entre os bacilos Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros
Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram-negativos.
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das
bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de
material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria
sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma.
A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias
e como estas serão coradas de forma distinta. As bactérias denominadas Gram negativas
possuem uma fina camada de glicoproteína recoberta por uma espessa camada formada
principalmente por lipoproteínas e substâncias lipídicas. Já as consideradas Gram positivas
possuem uma única e espessa camada de glicoproteína.
Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia
previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for
utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%,
homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da
coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de
fixaro esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada
se perca durante as etapas da coloração.
Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O
corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram
negativa. Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande
complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria. O álcool tem papel
fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço corado com o Cristal violeta vai
diferenciar as bactérias:
- as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão
desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e
tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I);
- as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima desta
camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros
componentes). Essa camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada
de peptidoglicano desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula
descorada neste momento.
É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum
resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão
ser alterados.
43
O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram
positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células
Gram negativas, corando-as de vermelho. Esta coloração é utilizada para a maioria das
bactérias, mas há algumas que não se coram por este método, como as micobactérias, as
bactérias espiraladas e as bactérias que não possuem parede celular. Para estes, há outros
métodos de coloração, como o método de Zihel-Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o método de
visualização em campo escuro.
Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na coloração:
- Os corantes empregados na técnica, se não filtrados, podem deixar resíduos (cristais) na lâmina.
- Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciação da bactéria
pelo álcool.
- A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas
envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-negativas.
Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à
membrana e parede da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes.
Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula.
Na prática:
Preparo e fixação do esfregaço
Etapas Observações
Transferir uma alçada da cultura ou uma Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes
colônia da placa para uma lâmina de culturas deve-se observar alguns detalhes:
microscópio limpa. è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia,
espalhando-a pela lâmina à isso evitará a
observação de colônias diferentes na lâmina e
que seja coletado um inóculo muito carregado,
o que dificultará a visualização das células
coradas.
è de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada
e espalhá-la na lâmina à isso evita que seja
coletado um inóculo muito carregado.
Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se Para o inóculo coletado de caldo não é
tiver sido colhida colônia da placa, adicionar necessário adicionar solução salina. Mas para
salina estéril para facilitar o espalhamento. colônia coletada de placa é necessário fazer a
diluição na lâmina, evitando que o esfregaço
fique muito concentrado o que dificulta a
visualização das células coradas ao
microscópio.
44
Passar a lâmina com o esfregaço sobre a É importante fixar o esfregaço para que este
chama do Bico de Bunsen, até que este esteja não se perca durante as etapas de lavagem
completamente seco. entre a utilização de um e outro corantes
Coloração do esfregaço
Etapas da coloração O que está acontecendo na pareda da
bactéria?
Cobrir o esfregaço com solução de Cristal O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os
Violeta por cerca de 1 minuto. tipos de células (Gram + e Gram -)
A seguir, lavar em água corrente com o pissete. A lavagem com água é importante após cada
etapa para que uma substância utilizada não
interfira na ação da próxima.
Nesse caso, a lavagem serve para retirar o
excesso de corante.
45
Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco O Lugol é uma solução de Iodo e funciona
por cerca de 1 minuto. como mordente neta etapa da coloração, ou
seja, ele fixa o corante Cristal Violeta na parede
da célula, pois forma um complexo grande: o
CV-I.
Novamente lavar com água, e então lavar com O álcool absoluto, ou solução de álcool-
álcool absoluto até que não saia mais corante acetona, funciona como diferenciador da
da lâmina (10 – 15 segundos). coloração:
è nas Gram +, o álcool desidrata a matriz
glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os
poros da parede e impedindo a saída do
complexo CV-I, corando a célula de roxo:
46
Lavar com água corrente em abundância, para É importante prestar bastante atenção nesta
que não reste álcool sobre a lâmina. etapa, pois se restar algum álcool na lâmina a
coloração não prosseguirá, já que o próximo
corante não se fixará na lâmina.
Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de 30 A fucsina age de diferentes formas nas
segundos. diferentes células:
è nas Gram +, os poros estão reduzidos,
impedindo que a fucsina penetre na parede
celular, não alterando a cor roxa:
Lavar com água e secar suavemente com Após secar suavemente a lâmina, observar ao
papel. microscópio na objetiva de imersão (100x), com
óleo de cedro/mineral e identificar a célula
corada.
Sant’Anna, R.S; Cerqueira, A.M.F. Apostila de Aulas Práticas – Bacteriologia. Nutrição. Instituto biomédico.
Departamento de Microbiologia e Parasitologia. Universidade Federal Fluminense, 2007.
47
Exercícios
Isso é só porque
eu sou uma
Gram negativa?
48
Morfologia, reprodução e classificação dos fungos.
1) Definição
- Representados pelos cogumelos, bolores, mofos, orelhas-de-pau e leveduras
- Organismos eucariotos
- Uni ou pluricelulares
- Aclorofilados
- Parede celular com quitina
- Quimio-heterótrofos (nutrição por absorção)
- Reserva energética de glicogênio (= reserva de carboidrato dos animais)
- Reprodução sexuada ou assexuada
- MICOLOGIA = mykes + logos = estudo dos fungos
2) Morfologia
Do ponto de vista morfológico são divididos em:
a) Leveduras
b) Bolores - Fungos filamentosos
- Fungos dimórficos
a) Leveduras
- Fungos unicelulares: esféricos ou ovais, não-filamentosos.
- Amplamente encontradas na natureza, pó branco cobrindo frutas e folhas.
- Hifas:
- septadas – com septos incompletos p/ separar as células (os poros dentro dos septos
permitem a livre circulação)
- cenocíticas – sem septos
49
- Hifas crescem por alongamento da extremidade, e quando um fragmento é quebrado, ele pode
se alongar para formar uma nova hifa.
Hifa vegetativa = porção da hifa que obtém nutrientes
Hifa reprodutiva ou aérea = hifa que se projeta acima da superfície sobre a qual o fungo
está crescendo
Fungos dimórficos
- Especialmente fungos patogênicos
- Dimorfismo (duas formas de crescimento): forma de fungos filamentosos e forma de leveduras
- Forma de fungo filamentoso produz hifas vegetativas e reprodutivas
- Forma de levedura se reproduz por brotamento
- Dependente de temperatura: 37ºC forma de levedura e 25ºC forma de fungo filamentoso
* Caso especial:
Em alguns casos esporos sexuais são produzidos e o micélio se reorganiza em um corpo frutífero
(chamado de cogumelo).
esporos = estruturas de
Corpo de frutificação: dispersão dos fungos
parte visível do fungo,
responsável pela
reprodução
Conjunto de filamentos
(hifas), parte “invisível” do
fungo 50
3) Estrutura
a) Membrana citoplasmática
- lipoprotéica
- regula trocas com meio ambiente
b) Parede celular
- rígida: polissacarídeos, proteínas e lipídeos
- proteção e resistência às pressões osmótica e mecânica
- reconhecimento: sexual, simbioses
c) Citoplasma
- organelas: vacúolos, mitocôndrias, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, ribossomos,
material de reserva (glicogênio)
d) Núcleo
- nucléolo, vários cromossomos e proteínas, envolvidos por membrana nuclear (carioteca =
eucariontes)
4) Adaptações nutricionais
a) Temperaturas de crescimento
- ótima: 25-30ºC
- mínima: 10ºC
- máxima: 40ºC
- algumas espécies termófilas (> 50ºC) e psicrófilas (< 0ºC)
b) pH
- entre 4 e 7
c) Oxigênio
- aeróbios estritos (maioria): necessitam de O2 para sua sobrevivência (ar contém 21% de O2)
- anaeróbios facultativos (leveduras): podem crescer tanto na presença como na ausência de
oxigênio. Não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2. Podem usar O2 quando disponível,
mas na sua ausência, são capazes de continuar seu crescimento através da respiração anaeróbia
ou da fermentação. Respiração e fermentação.
d) Luz
- desnecessária para o crescimento vegetativo
- pode ser importante para indução de estruturas reprodutivas
- orientação das estruturas para descarga dos esporos
e) Grau de umidade
- Podem crescer sobre substâncias com baixo grau de umidade (tão baixo que impede
crescimento de bactérias)
5) Nutrição
a) Modo de vida: fungos são organismos quimio-heterotróficos:
- Saprófitas (absorvem os nutrientes da matéria morta): principais decompositores de celulose e
lignina que são os componentes principais das paredes celulares vegetais
- Parasitas facultativos ou obrigatórios (absorvem os nutrientes de hospedeiros vivos)
- Predadores (adaptações para capturar protistas microscópicos ou animais): secreção de
substâncias mucilaginosas que levam à adesão dos organismos. As hifas invadem a presa,
51
espalham‐se por todo o corpo, absorvem os nutrientes, e podem causar a morte do organismo.
- Mutualistas (vivem em associação íntima com outros organismos, ambos se beneficiam)
corpo
frutífero hifa
micélio enzimas
substância substância
orgânica orgânica absorção
hifa complexa simples
6) Reprodução
- Muitos fungos se reproduzem sexuada e assexuadamente.
- Fungos filamentosos podem se reproduzir assexuadamente pela fragmentação de suas hifas.
- Reprodução assexuada e reprodução sexuada podem ocorrer pela formação de esporos.
- Leveduras se reproduzem de forma assexuada (divisão e esporos assexuais).
a) Reprodução assexuada
- sem cariogamia (fusão de núcleos)
- produção de esporos assexuais no interior de um saco (esporângio)
- produção de esporos assexuais nus nas pontas das hifas – conídios
- simples quebra do micélio (fragmentação das hifas)
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b) Reprodução sexuada
- esporos sexuais formados pela união de 2 células com fusão de seus núcleos (cariogamia)
- sem diferenças morfológicas entre estruturas ♀ e ♂, apenas linhas + e – pois fungos são
heterotálicos
- reprodução sexual só ocorre entre talos/hifas de linhagens + e – , o que impede auto-fertilização
- citoplasma de dois indivíduos com linhagens sexuais distintas ligam-se (plasmogamia) muito
antes da fusão dos núcleos (cariogamia)
7) Divisões
Reino Fungi é dividido em 4 grupos, baseado no modo e nas estruturas de reprodução:
- Zigomiceto
- Ascomiceto
- Basidiomiceto
- “Deuteromiceto”
a) Zigomiceto
- fungos pequenos e simples, filamentosos com hifas cenocíticas (sem septo)
- corpo de frutificação formado apenas por uma massa pequena de esporos sobre uma haste
- habitat: variado: solo, plantas e animais (parasitas)
- reprodução: assexual e sexual
- modo de vida: saprófitas:
- importância
* mofo preto do pão (Rhizopus nigrans)
* Rhizopus e Mucor: produção de enzimas amilolíticas (amilases e glucoamilases) para a
produção de alimentos.
b) Ascomiceto
- fungos de saco
- grupo complexo e diversificado
* fungos com micélio septado e leveduras
* presença de ascos (sacos): estruturas com esporos
- habitat: variado: solo, água, plantas, animais
- reprodução: assexual e sexual
- modo de vida:
* saprófitas: decompondo diferentes tipos de materiais (excrementos, madeira, folhas, ...)
53
* parasitas: plantas (os mais importantes), insetos, peixes
* simbiontes: líquens, micorrizas
- importância:
* produção de antibióticos (Penicillium chrysogenum)
* doenças: plantas, animais (Pneumocystis carinii)
* micotoxinas (Aspergillus spp.)
* espécies comestíveis de alto valor: trufas
c) Basidiomiceto
- grupo grande e diverso, inclui fungos que produzem cogumelos
* esporos sexuais externos produzidos em basídios
* micélio bem desenvolvido e septado
- habitat: fungos terrestres: solo, plantas, animais e madeira
- reprodução:
* sexual: através da produção de esporos em basídios
* assexual - esporos
- gemulação (leveduras)
- fragmentação de hifas
- importância: comestíveis e venenosos
- modo de vida:
* decompositores: principais agentes de decomposição de celulose e lignina
* simbiontes: micorrizas
* patógenos: principalmente de plantas (ferrugens)
Até agora...
* grupos com fungos TELEOMORFOS, que produzem esporos sexuais e assexuais
* alguns ascomicetos perderam a capacidade de se reproduzir sexualmente e são chamados
ANAMORFOS. Exemplo: Penicillium é um anamorfo que surgiu da mutação de um teleomorfo
* muitas vezes o mesmo fungo, em formas diferentes (sexual e assexual), estava classificado em
dois filos diferentes e somente após a verificação que estas duas formas pertenciam ao mesmo
fungo é que ele era definitivamente classificado.
d) “Deuteromiceto”
- Categoria de espera
- Fungos em que o ciclo sexual ainda não foi observado
- Uso de sequenciamento de rRNA para classificar os fungos
8) Importância
- Desde a antiguidade:
* vinho
* pão
* cerveja
* uso na medicina pelos nativos
- Nossas vidas estão ligadas aos fungos: descoberta da Penicilina
- Decomposição da matéria orgânica
* atividade de maior importância – recicladores de nutrientes do meio ambiente
* liberação de nutrientes para as plantas
- Destruição de produtos
* madeira: postes, estradas de ferro, navios, casas, tecidos, lentes, …
- Micotoxinas
* ocratoxinas: Aspergillus ochraceous e Penicillium viridicatum: cereais, atrofia renal
* aflatoxinas: Aspergillus flavus e A. parasiticus: grãos oleaginosos, câncer do fígado
* fumonisinas: Fusarium moniliforme: milho, câncer do esôfago
- Antibióticos e outros medicamentos
* penicilina: Penicillium chrysogenum
54
* cefalosporina: Cephalosporium acremonium
* ciclosporina: Cylindrocladium lucidum, Tolypocladium infatum
* Propriedades antitumorais e antivirais
- Alimentos
* cogumelos: cultivados desde ano 600 na China; a partir de 1650 na França, Agaricus bisporus, o
champignon de Paris, Tuber melanosporum, a trufa negra.
- Produção de alimentos
* Queijos gorgonzola, camembert (Penicillium camembertii), roquefort (P. roquefortii)
* pães
* cervejas
* Saquê (Aspergillus oryzae)
- Produtos de valor industrial
* álcool
* enzimas: amilases, celulases, catalases, proteases, pectinases, lacases
* ácidos orgânicos: fumárico, láctico (Rhizopus spp.), cítrico (Aspergillus niger)
* vitaminas B: leveduras
* reguladores de crescimento de plantas: ex. Giberelinas
- Simbiontes
* Micorrizas (associação entre fungos e raízes).
* Líquens (associação entre algas e fungos)
- Doenças de plantas
* perdas econômicas
* controle biológico de plantas daninhas (mico herbicidas)
- Doenças no homem e animais
* pouco agressivos
* mais comuns em regiões tropicais
* pacientes imunodeprimidos: AIDS, câncer, transplantes, ex. Candidíases, Pneumocystis carinii -
pneumonia em aidéticos
- Envenenamentos
* Amanita spp.
- Alergias
* esporos
- Controle biológico de doenças e pragas
* Trichoderma spp., Penicillium spp., Clonostachys rosea
Exercícios
1) Quais microrganismos formam o grupo dos fungos? Defina esse grupo a partir das principais
características.
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4) Como são classificados os bolores?
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b) hifa
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c) hifa cenocítica
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d) hifa septada
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e) hifa vegetativa
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f) hifa reprodutiva
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7) Qual a diferença de crescimento entre fungos e bactérias com relação ao grau de umidade?
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10) Os fungos filamentosos e as leveduras podem realizar reprodução assexuada. Explique quais as
formas para cada um dos grupos.
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13) Cite dois benefícios e dois prejuízos causados pelos fungos ao homem.
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15) "Engana-se quem acha que uma salada com cogumelos é um prato vegetariano. Cientistas
descobriram que as características genéticas dos fungos (categoria à qual pertence os cogumelos)
estão muito mais próximas às dos animais do que às dos vegetais. Cite três características dos fungos
que os tornam mais próximos de animais do que dos vegetais.
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16) O molho de soja mofado vem sendo usado na China, há mais de 2.500 anos, no combate a
infecções de pele. Durante a 2a Guerra Mundial, prisioneiros russos das prisões alemãs, que
aceitavam comer pão mofado, sofriam menos infecções de pele que os demais prisioneiros que
recusavam esse alimento.
a) O que é mofo?
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b) Por que esses alimentos mofados podem combater as infecções de pele?
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17) Planta ou animal? Os fungos não são nem uma coisa nem outra. Cite uma característica dos
fungos que se assemelha aos animais e uma outra que se assemelha às plantas.
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19) Certos fungos são empregados na produção de queijos, sendo responsáveis por sabores
característicos. Os fungos Penicillium roquefortii e Penicillium camembertii, por exemplo, são utilizados
na fabricação de queijos tipos roquefort e camembert, respectivamente. Pela análise dos nomes
científicos acima citados, podemos concluir que esses seres NÃO pertencem ao (à) mesmo(a):
a) gênero. b) classe.
c) família. d) ordem.
e) espécie.
20) Os fungos estão presentes em nossa vida diariamente, tanto na fabricação de alimentos como
parasitando plantas e animais, inclusive o homem. Por apresentarem características particulares que
os diferem das plantas e dos animais, constituem um reino particular: o Reino Fungi. Dentre as
características a seguir, assinale aquela EXCLUSIVA dos fungos.
a) Reproduzem-se por esporos. b) Armazenam glicogênio.
c) São heterótrofos por absorção. d) São aclorofilados e parasitas.
e) Não apresentam tecidos condutores de seiva.
22) Todos os itens indicam alguma importância ligada à atividade de fungos, exceto:
a) podem causar doenças chamadas micoses.
b) desempenham papel fermentativo.
c) produção autotrófica de substâncias orgânicas para consumo de outros seres.
d) alguns produzem antibióticos.
e) participação na formação de liquens.
24) Em qual das atividades humanas listada abaixo não há participação de fungos?
a) Produção de álcool combustível b) Fabricação de certos antibióticos
c) Indústria de cerveja e do vinho d) Pesquisas em controle biológico
e) Produção industrial de iogurte
25) A ferrugem do cafeeiro, o “sapinho” da boca e a histoplasmose são doenças causadas por:
a) vírus b) fungos
c) bactérias d) protozoários
58
Morfologia, características e propriedades gerais dos vírus.
1) Estrutura e morfologia
Do ponto de vista morfológico: várias formas: cilíndricos, arredondados, poliédricos,...
59
- A maioria dos pesquisadores da área biológica considera complexa a tarefa de definir se os vírus
são seres vivos ou seres não-vivos.
- Argumentos a favor
1. Os vírus apresentam reprodução; embora necessitem da ajuda da célula hospedeira para se
reproduzirem;
2. A presença de material genético (DNA ou RNA), e consequentemente a capacidade de
sofrerem mutação;
3. Capacidade de adaptação.
- - Argumentos contra
1. O fato dos vírus serem acelulares.
2. A ausência de metabolismo próprio,necessitando portanto, de constituintes celulares de outro
organismo.
60
b) Ciclo lisogênico: não provoca a morte da célula hospedeira. Mas posteriormente pode se
transformar em um ciclo lítico.
4) Vírus e as doenças
- Algumas doenças humanas causadas por vírus: AIDS, sarampo, rubéola, gripe, hepatite, herpes,
poliomielite, caxumba, varíola, raiva (hidrofobia), dengue, febre amarela, …
- Alguns vírus causadores de doenças podem permanecer por anos no indivíduo, ficando ativos
em certas épocas e inativos em outras. Exemplo: vírus do herpes.
61
62
Exercícios
5) Alguns estudiosos consideram que os vírus são seres vivos. Em que se baseia essa ideia?
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6) Alguns estudiosos consideram que os vírus não são seres vivos. Em que se baseia essa ideia?
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8) O que é um bacteriófago?
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9) Quais os ciclos vitais que um bacteriófago pode iniciar ao se instalar em uma bactéria? Explique a
diferença entre os ciclos.
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12) A AIDS é uma doença que, sem dúvida, ameaça a humanidade. As tentativas para o
desenvolvimento de uma vacina têm sido infrutíferas. Explique, do ponto de vista genético, qual a
causa desse insucesso.
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13) Explique onde atua o AZT (droga que compõem o coquetel contra o HIV), o que ela impede e qual
a consequência de seu uso para o vírus.
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14) Em 1917, o sábio francês d'Herelle verificou que uma cultura de bacilos da disenteria estava sendo
destruída por um agente cuja visualização não era possível de ser feita. Essa foi a primeira
constatação da existência de vírus que somente atacavam bactérias. Mais tarde esses vírus foram
genericamente denominados:
a) bacteriostáticos b) bacteriófagos
c) bacteróides d) bactérios
e) bactericidas
64
15) O HIV (vírus da imunodeficiência humana) é o causador da AIDS (síndrome da imunodeficiência
adquirida). Em relação a esse vírus podemos afirmar que é composto de:
a) DNA e ataca as hemácias. b) RNA e ataca as hemácias.
c) DNA e ataca os linfócitos T. d) RNA e ataca os linfócitos T.
e) RNA e ataca as plaquetas.
16) Indique em qual dos seres vivos, citados a seguir, o ácido desoxirribonucléico (DNA) e o ácido
ribonucléico (RNA) não ocorrem em um mesmo indivíduo:
a) bactéria b) protozoário
c) vírus d) fungos
e) algas
17) Entre as características biológicas citadas a seguir, a única pode ser encontrada nos vírus é um:
a) programa genético específico que permite a reprodução de novos seres do mesmo tipo.
b) processo metabólico que requer compostos nitrogenados e de carbono, incluindo os produzidos
pelos autótrofos.
c) maquinaria biológica que pode utilizar a energia armazenada em sua célula ou obtida dos alimentos.
d) maquinaria biossintética para a síntese de proteínas.
e) membrana celular que estabelece um limite e regula as trocas de matéria e energia.
18) Medicina do futuro recruta vírus "bonzinhos" para vencer câncer e AIDS através de batalhas
genéticas.- Utilizando vírus inofensivos como vetores de genes, cientistas estão colocando, nas células
dos pacientes, o material genético que os médicos desejam. (Folha de São Paulo-dez/92). Tal técnica
é possível, pois, na célula hospedeira, o DNA do vírus:
a) inativa as diferentes funções vitais. b) comanda a produção de proteínas.
c) inibe a respiração celular. d) induz uma mensagem deletéria.
e) estimula a duplicação do DNA celular.
20) O vírus da AIDS é formado por uma cápsula esférica contendo em seu interior o material genético.
Este tipo de vírus é chamado RETROVÍRUS porque:
a) o RNA produz um "molde" de molécula de DNA.
b) o RNA, torna-se uma molécula autoduplicável.
c) o DNA possui cadeia simples sem timina.
d) o DNA possui mecanismos de retroação.
e) o DNA e RNA não se pareiam
21) Os vírus são entidades que só apresentam propriedades de vida quando estão no interior de
células vivas. Fora delas, deixam de apresentar tais propriedades e podem cristalizar-se, como os
minerais. Os vírus são importantes agentes causadores de doenças humanas, como:
a) AIDS, sarampo e difteria. b) sarampo, catapora e herpes.
c) cólera, febre amarela e tétano. d) febre amarela, sarampo e tétano.
e) disenteria bacilar, hanseníase e poliomielite.
65
22) O gráfico abaixo demonstra, no organismo humano, a relação entre os linfócitos T e o vírus da
imunodeficiência humana (HIV), ao longo de dez anos de curso da síndrome da deficiência
imunológica adquirida (AIDS).Explique as razões das quedas das concentrações de:
a) linfócitos T
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b) HIV.
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66
Crescimento microbiano
1) Fatores físicos
- Temperatura
- pH
- pressão osmótica
a) Temperatura
Taxa de crescimento X temperatura
- Maioria dos microrganismos cresce dentro de variações limitadas de temperatura, com somente
30 oC de diferença entre a temperatura máxima e a mínima de crescimento
- Maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos
- Microrganismos são classificados em 3 grupos principais considerando as variações nas
temperaturas de crescimento:
- PSICRÓFILOS: crescem em baixas temperaturas
- MESÓFILOS: crescem em temperaturas moderadas
- TERMÓFILOS: crescem em altas temperaturas
SURGIRAM MAIS DUAS CLASSES...
Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos
Termófilos
extremos
67
Psicrófilos – inicialmente eram organismos capazes de crescerem a 0 oC mas existem 2 grupos
diferentes capazes de crescerem a 0 oC
1o grupo:
- contém somente psicrófilos,
- podem crescer a 0 oC, mas temperatura ótima de crescimento é 15 oC,
- são extremamente sensíveis a altas temperaturas e não crescem na temperatura ambiente (25
o
C)
- profundezas de oceanos, regiões polares, não causam problemas na preservação de alimentos
2o grupo:
- podem crescer a 0 oC, mas crescimento ótimo entre 20 oC e 25 oC,
- não crescem em temperaturas maiores que 40 oC
- podem crescer nas temperaturas usadas em refrigeradores, são mais encontrados em alimentos
estragados
- são chamados de PSICROTRÓFICOS
Mesófilos
- mais encontrados
- Temperatura ótima de crescimento entre 30 oC e 40 oC
- se adaptaram para viver no corpo de animais: muitas bactérias patogênicas têm temperatura
ótima de crescimento de 37 oC
- maioria dos microrganismos que degradam alimentos e são patogênicos
Termófilos
- crescem em altas temperaturas
- temperatura ótima de crescimento entre 60 oC e 65 oC: solo aquecido pelo sol e águas termais
- muitos não crescem em temperaturas abaixo de 45 oC
- endosporos de bactérias termofílicas são resistentes ao calor
- podem sobreviver ao tratamento por aquecimento em alimentos enlatados
- elevação da temperatura nos alimentos estocados pode permitir a germinação destes
endosporos, degradando os alimentos
- não são considerados um problema de saúde pública
Refrigeração
- método para preservação de alimentos pois diminui a velocidade de reprodução dos
microrganismos em baixas temperaturas
- microrganismos podem sobreviver em temperaturas próximas ao congelamento (dormentes)
mas seu número diminui gradualmente
- psicrotróficos não crescem bem em baixas temperaturas (comparado com os psicrófilos) mas
dependendo do tempo de contato eles podem degradar os alimentos – micélios de fungos
recobrindo alimentos podem causar alteração de cor e sabor
- IMPORTANTE: manter refrigeradores com temperaturas bem ajustadas pois assim os
psicrotróficos crescerão lentamente e a maioria dos patogênicos serão incapazes de crescer
68
Microrganismos
patogênicos se
multiplicam em T
entre 5ºC a 60ºC
(zona de perigo).
Preferem T de verão
ou do nosso corpo
(37ºC). GELADEIRA!
69
c) Pressão osmótica (concentração de sal)
- Microrganismos necessitam de água para crescimento. Eles retiram da água, presente no seu
meio ambiente, a maioria dos nutrientes solúveis. Cada célula possui 80 – 90 % de água.
- Osmose é o movimento líquido de moléculas de solvente através de uma membrana
seletivamente permeável, de uma área com alta concentração de moléculas de solvente (baixa
concentração de moléculas de soluto) para uma área de baixa concentração de moléculas de
solvente (alta concentração de moléculas de soluto).
- Nos sistemas vivos, principal solvente é a água!
- Pressão osmótica:
- pressão necessária para impedir o movimento de água pura (água sem solutos) para
uma solução contendo alguns solutos
OU
- pressão necessária para interromper o fluxo de água através da membrana
seletivamente permeável
- 3 tipos de soluções osmóticas:
- solução isotônica
- solução hipotônica
- solução hipertônica
* Quando uma célula microbiana se encontrar em uma solução contendo uma concentração de
solutos superior àquela do interior da célula (hipertônica), ocorrerá a passagem da água de dentro
da célula, por meio da membrana plasmática, para o meio com alta concentração de solutos. A
perda de água por osmose causa a plasmólise ou a diminuição (encolhimento) do citoplasma da
célula.
70
- Como usar esse fenômeno na preservação dos alimentos?
- Adição de sais (ou outros solutos como açúcar) em uma solução (causa aumento da
pressão osmótica);
- Alimentos como: peixe salgado, mel e leite condensado são preservados por esse
mecanismo;
- Alta concentração de sal ou de açúcar remove a água do interior da célula microbiana
impedindo seu crescimento!!!
2) Fatores químicos
- Água
- fontes de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo
- fontes de potássio, magnésio e cálcio
- oligoelementos
- oxigênio
- fatores orgânicos de crescimento
a) Água
- Essencial para os microrganismos
- Disponibilidade variável no ambiente
- Regulação da pressão osmótica: em ambiente com baixa concentração de água, o
microrganismo usa mecanismos para obter água através do aumento da concentração de solutos
internos, seja pelo bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese de solutos
orgânicos (açúcares, álcoois ou aminoácidos).
- Regulação térmica
71
c) Fontes de potássio, magnésio e cálcio
- também são elementos essenciais para os microrganismos
- frequentemente encontrados como co-fatores para as reações enzimáticas
e) Oxigênio
- extremamente importante no desenvolvimento microbiano
AERÓBIOS
- Estritos ou obrigatórios: necessitam de O2 para sua sobrevivência (ar contém 21% de O2);
- Facultativos (ou anaeróbios facultativos): não necessitam de O 2 mas crescem melhor com ele.
Na ausência de O2 são capazes de continuar seu crescimento pela respiração anaeróbia ou
fermentação. A eficiência na produção de energia diminui quando o O 2 não está disponível. Ex:
Escherichia coli,
- Microaerófilos: necessitam de O2 mas em concentração menor que a encontrada no ar. São
sensíveis a algumas formas tóxicas de oxigênio produzidas em concentrações letais quando em
altas concentrações de oxigênio.
ANAERÓBIOS
- Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem ele pois não podem usá-lo para
seu crescimento. Ex: Lactobacillus;
- Estritos ou obrigatórios: não toleram O2 (letal). Ex: gênero Clostridium = tétano e botulismo.
72
f) Fatores orgânicos de crescimento
- São compostos orgânicos essenciais que o microrganismo não é capaz de sintetizar e precisam
ser retirados do seu meio ambiente
- Vitaminas são fatores orgânicos de crescimento para os homens, atuam como coenzimas
(necessárias para atividades das enzimas)
- Fatores necessários para algumas bactérias: vitaminas (coenzimas), aminoácidos, purinas e
pirimidinas
Exercícios
73
6) Em um gráfico de Taxa de crescimento X Temperatura, quais são as 3 temperaturas que podem ser
definidas?
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7) Quando se prepara uma grande quantidade de alimento, no caso arroz, como devemos proceder o
resfriamento? Por quê? Observe o gráfico para auxiliar na explicação.
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8) Por que devemos manter os refrigeradores bem ajustados? Qual a efeito das temperaturas baixas
nos microrganismos?
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9) Qual é o principal grupo, com relação a classificação por temperatura, que degrada os alimentos?
Por quê?
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74
13) Explique e ilustre utilizando uma célula bacteriana os 3 tipos de soluções osmóticas existentes.
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14) Como o uso de sal ou de açúcar interfere no crescimento microbiano? Explique em detalhes. Cite 2
exemplos de alimentos preservados por esse mecanismo.
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15) De acordo com a quantidade de sal, descreva os 4 grupos de classificação dos microrganismos.
Desenhe o gráfico para auxiliar na descrição.
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75
17) Para que são usados potássio, magnésio e cálcio?
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18) O que são elementos traços? Como podem ser chamados? Quais são? Para que servem?
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76
Meios de Cultura
- recipientes:
* Placa - sólido
* Tubo - líquido
- sólido: horizontal e inclinado
77
c) Classificação dos meios de cultura
1. Quanto à origem
Naturais – meios que existem prontos na natureza. Ex. leite, sangue, caldo de frutas, etc.
2. Quanto à composição
Complexos ou Indefinidos – meios que, além de todos os componentes conhecidos, contêm em
sua composição sangue, ovos, extrato de levedura, leite, extratos de plantas, entre outros, que
não possuem a composição química totalmente conhecida
Meios semissólidos – possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma quantidade de ágar
(agente solidificante) na porcentagem de 0,75 a 0,5% (concentração menor que 15g/L), que
confere consistência intermediária, permitindo crescimento de microrganismos em tensões
variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e para conservação de culturas.
Meios sólidos – têm uma quantidade maior do agente solidificante, cerca de 1,5% a 2% de ágar
(concentração maior que 15g/L). São utilizados para cultivo, isolamento e avaliação de
populações microbianas (contagens).
4) Quanto à finalidade:
Meios de pré-enriquecimento – meios para dessensibilização de microrganismos injuriados, são
usados em amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água
peptonada, caldo lactosado
Meios diferenciais – meios que têm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre
microrganismos de um determinado grupo ou espécie bacteriana facilitando a detecção do
microrganismo desejado.
Ex. meio Eosina Azul de Metileno, Ágar MacConkey , Ágar sangue.
Meios seletivos – meios que têm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados
grupos de microrganismos, favorecendo o crescimento do microrganismo de interesse. Ex. ágar
Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey.
78
Meios de identificação – meios para realização de provas bioquímicas e verificação de funções
fisiológicas de organismos submetidos a identificação. Ex. meios Oxidação/Fermentação, Agar
Citrato, Caldo nitrato, Caldo triptofano.
Meios de contagem – meios para determinação quantitativa da população microbiana. Ex. Agar de
Contagem em Placas, Agar Batata Dextrose (BDA).
79
d) Ágar ou agar
- ágar = agente solidificante utilizado quando se quer um meio sólido
- polissacarídeo complexo obtido de algas marinhas
- usado para deixar alimentos como geléias e sorvetes mais espessos
- poucos microrganismos podem degradá-lo
- ele se liquefaz (torna-se líquido) a cerca de 100 oC (temperatura de ebulição da água) e ao nível
do mar permanece líquido até que a temperatura diminua até 40 oC
- para usar em laboratório, ágar é mantido em banho-maria a uma temperatura de 50 oC, que não
causa danos as bactérias quando adicionados sobre elas
- após solidificação o ágar pode ser incubado até 100 oC sem perder suas características
- Os recipientes contendo meios e inóculo deverão ser abertos somente na zona de esterilidade
gerada pelo Bico de Bunsen;
- A boca do tubo de ensaio deve ser aquecida na chama do Bico de Bunsen antes e depois de ser
retirado o tampão;
- O tampão nunca deve ser apoiado na bancada ou na mesa do fluxo laminar;
- Identificação do conteúdo e data de inoculação;
- Após a inoculação as placas de Petri ou tubos de ensaio devem ser incubados em estufa na
temperatura adequada.
g) Métodos de inoculação
1) Placas de Petri
Estriagem
80
Esgotamento
- Técnica mais usada para obter colônias puras de microrganismos.
- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.
- Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda a
superfície da placa.
A direção da semeadura está indicada
por setas.
A semeadura na região 1 é realizada a
partir da cultura original da bactéria.
A alça de inoculação deve ser
esterilizada entre as fases de
inoculação 1, 2 e 3.
Nas fases 2 e 3 a alça é usada para
retirar bactérias das fases anteriores,
desta forma diluindo o número de
organismos a cada semeadura.
2) Tubos de ensaio
Semear - Meio líquido
- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.
- Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a alça.
81
Estriagem - Meio sólido inclinado
- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.
- Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na
superfície do ágar.
Exercícios
3) Se você quer realizar o crescimento de uma determinada bactéria, que critérios devem ser
observados na escolha do meio de cultivo?
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82
6) Como são classificados os meios de cultura quanto à composição? Explique.
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11) Explique como é feita a técnica de esgotamento. Para que ela serve?
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83
12) Explique as seguintes técnicas de inoculação em tubos de ensaio contendo:
a) meio líquido
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b) meio semi-sólido
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c) meio sólido inclinado
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Use a informação a seguir para responder as questões 13 e 14. Dois meios de cultura foram incubados
com 4 diferentes bactérias. Após a inoculação foram obtidos os seguintes resultados:
Organismo Meio de cultura 1 Meio de cultura 2
Escherichia coli Colônias vermelhas Ausência de crescimento
Staphylococcus aureus Ausência de crescimento Crescimento
S. epidermidis Ausência de crescimento Crescimento
Salmonella enterica Colônias incolores Ausência de crescimento
84
Crescimento Microbiano - Bactérias
a) Fases do crescimento
- Curva de crescimento microbiano demonstra crescimento das células durante um período de
tempo - 4 fases de crescimento:
Logaritmo do número de células
Fase
estacionária
Fase lag
85
3) Fase Estacionária
* em determinado momento a velocidade de crescimento diminui, o número de morte celular é
igual ao número de células novas e a população se torna estável = período de equilíbrio
* nº de células vivas = nº de células mortas
* não são conhecidos os motivos que induzem a fase exponencial a diminuir sua atividade,
diversos fatores poderim influenciar: término de nutrientes, acúmulo de produtos da degradação,
mudanças no pH, ...
4) Fase de Morte Celular ou de Declínio
* nº de células mortas é maior que o de células novas
* fase continua até que a população tenha diminuído para uma pequena fração do número de
células da fase anterior, ou até que tenha desaparecido totalmente
1) Contagem direta ao microscópio do nº. total de indivíduos, vivos ou mortos. Usa câmaras de
contagem e microscópio para avaliar nº. partículas presentes em um determinado volume
3) Método do número mais provável (MNP), para bactérias que não crescem em meio sólidos. Faz
o crescimento em meio líquido com diferentes diluições de bactérias e usa tabelas (95% de
confiabilidade) para avaliar resultado.
4) Filtração, para regiões em que o número de bactérias se encontra muito pequeno (lagos e
fontes de água)
Quantificação indireta
86
Métodos para quantificação direta
Existem diferentes métodos para quantificar o crescimento microbiano. Alguns determinam o
número de células e outros analisam a massa total da população, que é diretamente proporcional ao
número de células. A quantificação de uma população geralmente é realizada considerando o número
de células em 1 mL do meio líquido ou 1 g do material sólido. Mas como populações bacterianas são
muito grandes, são usadas pequenas amostras dessas para contagem por métodos diretos ou
indiretos. Depois, o resultado é colocado em fórmulas matemáticas para calcular o valor final. Ex.: um
milionésimo de mL (10-6 mL) de leite azedo tem 70 bactérias. Deverá existir 70 milhões de bactérias
em cada mL de leite. Trabalhar com números tão pequenos não é prático. Foram desenvolvidos
métodos quantitativos usando diluições seriadas das culturas ou amostras.
1) Contagem em Placa
É a técnica mais utilizada na determinação do tamanho de uma população bacteriana.
VANTAGEM: as células viáveis (vivas) são quantificadas. DESVANTAGEM: tempo de incubação longo,
em geral 24 h, para o aparecimento das colônias visíveis em placa. Esse tempo pode impedir o uso
dessa técnica em áreas como no controle da qualidade do leite pois não é possível manter o lote por
um período longo. Esse método considera que cada colônia é originada do crescimento e da
multiplicação de uma bactéria. Isso nem sempre é verdade, uma vez que as bactérias frequentemente
crescem em cadeias ou em grumos. Para refletir essa realidade, as contagens em placas são feitas
nas chamadas unidades formadoras de colônias (UFC).
Para realizar esse método, é essencial que somente um número limitado de colônias cresça
em cada placa. Quando muitas colônias estão presentes, ocorre saturação impedindo o crescimento
de algumas colônias e dificultando a contagem. Pela convenção do Food and Drug Administration,
órgão norte-americano que controla alimentos e medicamentos, deve-se realizar a contagem em
placas que contenham de 25 a 250 colônias, mas microbiologistas preferem de 30 a 300 colônias.
Quando essa metodologia é empregada, deve-se utilizar o método da diluição seriada para
garantir que o número de colônias na placa permaneça na faixa desejada. (FIGURA)
Diluição seriada. Exemplo – amostra de leite com 10 mil bactérias / mL. A inoculação de 1 mL
dessa amostra em uma placa com meio de cultivo resultará no crescimento de 10 mil colônias e será
impossível fazer a contagem. Mas se 1 mL de leite for transferido para um tubo contendo 9 mL de água
estéril (diluição), cada mL da amostra deste tubo conterá 1000 bactérias. Esse número ainda é grande
para fazer a contagem. Portanto, uma nova diluição seriada deverá ser realizada, transferindo 1 mL
(com 1000 bactérias) para um novo tubo com 9 mL de água estéril). Nesse último tubo, cada mL
conterá 100 bactérias, que quando inoculado deverá originar 100 colônias, que podem ser facilmente
contadas.
87
Existem dois métodos para se realizar a contagem de bactérias em placa: método de
espalhamento em placa e método pour plate.
Método pour plate. No método pour plate o inóculo pode ser realizado com um volume de 1,0
mL ou 0,1 mL da diluição bacteriana diretamente na placa de Petri. O meio de cultivo, mantido em
banho-maria a 50 oC para impedir a solidificação do ágar, é vertido sobre a amostra, que será
misturada por agitação suave da placa. Após solidificação do ágar, a placa é incubada na temperatura
de crescimento da bactéria. Nesse método o crescimento das colônias das bactérias ocorre dentro do
meio de cultivo e na superfície do meio cultivo. DESVANTAGEM: microrganismos sensíveis ao calor
podem ser danificados pelo ágar fundido (líquido a 50 oC) e podem ficar impossibilitados de formar
colônias; quando alguns meios de cultivo diferenciais são usados, a aparência característica de uma
colônia na superfície do meio é essencial para que haja o diagnóstico e as colônias formadas abaixo
da superfície não são apropriadas para estes testes.
Método de espalhamento em placa. Método mais usado. O inóculo de 0,1 mL é adicionado à
superfície do meio contendo ágar já solidificado. O inóculo é, então, espalhado uniformemente na
superfície com a alça de Drigalski. Esse método não tem as desvantagens do método pour plate
porque as colônias crescem somente na superfície do meio e não entram em contato com o ágar
fundido (líquido a 50 oC).
88
2) Filtração
Aplicado para contar amostras em que o número de bactérias é muito pequeno, como lagos e
fontes de água. Esse método permite que a bactéria seja concentrada sobre a superfície de uma
membrana de filtro de poros muito pequenos (bactéria não passa pelos poros) após passagem de um
volume de 100 mL de água. Essa membrana é transferida para uma placa de Petri com um suporte
embebido em nutriente líquido, que permite que as bactérias se desenvolvam sobre a membrana. Esse
método é usado para detecção e registro de coliformes (indicadores de poluição fecal) em amostras de
alimentos e águas. Coliformes podem ser identificados por meios de cultivo diferenciais.
89
3) Método do Número Mais Provável (NMP)
É uma técnica estatística com base no seguinte princípio: quanto maior o número de bactérias
em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para eliminar totalmente o
crescimento em tubos com meio de cultura. Esse método é mais usado quando as bactérias a serem
contadas não cresceriam em meio sólido (como bactérias quimiautotróficas nitrificantes), ou quando o
crescimento de bactérias em um meio líquido diferencial é usado para identificar os microrganismos
(como coliformes em água, que seletivamente fermentam lactose produzindo ácido). O método fornece
somente uma estimativa de 95% de probabilidade de a população bacteriana conter um número de
bactérias e que o NMP da tabela é estatisticamente o número mais provável. (FIGURA)
90
4) Contagem Direta ao Microscópio
Nesse método um volume conhecido de solução bacteriana é colocado em uma área definida
de uma lâmina especial de microscópio denominada célula de contagem Petroff-Hausser.
DESVANTAGEM: dificuldade para contar bactérias móveis, células mortas acabam sendo contadas
como as vivas, necessário um grande número de células de bactérias (cerca de 10 milhões de
bactérias por mL) para ter uma contagem satisfatória. VANTAGEM: para quantificar as bactérias por
esse método não há necessidade de períodos de incubação, portanto, ela pode ser usada quando se
necessita de resultados imediatos.
91
Métodos para quantificação indireta
Muitas vezes não é necessário contar as células microbianas para determinar seu número.
1) Turbidimetria
Em alguns experimentos é possível monitorar o crescimento bacteriano através da turbidez da
cultura. Quando uma bactéria se multiplica em meio líquido, esse meio fica túrbido ou com alta
densidade de células. O espectrofotômetro (ou colorímetro) é o instrumento mais usado para
determinar a turbidez de uma amostra. Nele existe um feixe de luz que é transmitido através da
solução de bactérias para um detector fotossensível. Com o crescimento bacteriano, menos luz
atingirá o detector. Essa alteração será registrada na escada do aparelho como uma porcentagem de
transmissão. Também será registrada na escala do aparelho a absorbância (densidade ótica ou OD)
que é um valor usado para confeccionar gráficos de crescimento bacteriano. O gráfico Absorbância X
Tempo será uma linha quase reta quando a bactéria estiver na fase log (logarítmica) de crescimento ou
morte celular. Se durante as leituras de absorbância for realizada a contagem do número de células,
esses valores podem ser usados para estimar o número de bactérias em experimentos futuros em que
somente a turbidez seja medida. Para usar esse método é necessário ter mais de um milhão de
células por mL de cultura, mas para leitura no aparelho a suspensão (solução de bactérias) deve ter
entre 10 e 100 milhões de células por mL. DESVANTAGEM: difícil usar esse método quando poucas
bactérias estão presentes no meio.
92
2) Atividade Metabólica
Nesse método é feita a determinação da atividade metabólica da população microbiana. Ele
considera que a quantidade de um certo produto do metabolismo dos microrganismos, como ácido ou
CO2, pode ter relação direta com o número de células presentes. DESVANTAGEM: uso restrito a
alguns ensaios e microrganismos.
3) Peso Seco
Os métodos apresentados até agora não têm resultados bons quando usados em bactérias
filamentosas e fungos. A contagem em placa não é capaz de quantificar o aumento da massa
(crescimento do micélio) dos fungos filamentosos. O número de esporos assexuais é contado na
contagem em placa mas não é uma determinação satisfatória do crescimento. A melhor maneira de
analisar crescimento de fungos filamentosos é pela determinação do peso seco. Para isso, o fungo é
removido do meio de cultivo por filtração, para eliminar outros materiais. Depois ele é seco em
dessecador e pesado. Pode-se usar a mesma metodologia com bactérias.
Exercícios
2) O que é tempo de geração? Ele é igual para todos os microrganismos? Justifique sua resposta.
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3) Durante o preparo de um sanduíche ocorreu acidentalmente a sua contaminação com seis células
de E. coli. Considerando que o tempo de geração dessa bactéria é de 20 minutos, explique quantas
células deveriam existir no sanduíche após:
a) 20 minutos
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b) 1 hora
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c) 2 horas
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93
5) Descreva os principais acontecimentos de cada uma das fases de crescimento.
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6) Na fase estacionária os microrganismos param de crescer. Essa informação está correta? Justifique
sua resposta.
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11) Qual a diferença entre o método de espalhamento em placa e o método de pour plate?
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94
13) O que significa UFC? Por que ela foi escolhida no lugar de “colônia” como unidade para o método
de contagem em placa?
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14) Qual o número de bactérias por mL encontrado em uma amostra de leite se a placa usada para
contagem apresentava 127 UFC em uma diluição seriada de 1:1000?
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16) O que é o método do número mais provável? Em que ocasião esse método é usado? Qual é o
nível de confiabilidade deste método?
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17) De acordo com a tabela de NMP (pag. 90) qual o número estatisticamente provável de bactérias
presentes em uma amostra e os limites inferiores e superiores para as seguintes combinações de
tubos positivos:
a) 4-2-1:
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b) 5-1-2:
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c) 5-3-0:
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19) Em que fato se baseia o método da turbidimetria? Que instrumento é usado nesse método?
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95
20) Qual a relação feita no método da atividade metabólica?
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96
Controle do Crescimento Microbiano.
97
resulta principalmente da remoção mecânica, em vez da morte, da maioria dos micróbios em uma
área limitada. Os copos, as louças e os talheres dos restaurantes estão sujeitos à sanitização, que
é destinada a reduzir as contagens microbianas a níveis seguros de saúde pública e minimizar as
chances de transmissão de doença de um usuário para outra. Isso normalmente é obtido por
lavagem em alta temperatura ou, no caso das louças em um bar, lavagem em uma pia seguida
por imersão em um desinfetante químico.
A Tabela 1 resume a terminologia relativa ao controle do crescimento microbiano.
Os nomes dos tratamentos que causam a morte direta dos micróbios possuem o sufixo
-cida, significando morte. Um biocida, ou germicida mata os microrganismos (geralmente com
certas exceções, como os endosporos); um fungicida mata os fungos; um viricida inativa os vírus;
e assim por diante. Outros tratamentos inibem o crescimento e multiplicação das bactérias; seu
nomes têm sufixo -stático ou -stase, significando parar ou diminuir, como na bacteriostase. Uma
vez que o agente bacteriostático é removido, o crescimento pode ser retomado.
Sepse, do termo grego para estragado ou podre, indica contaminação bacteriana, como
nas fossas sépticas para tratamento de esgoto. (O termo também é usado para descrever uma
condição de saúde). Asséptico significa que um objeto ou área está livre de patógenos. Assepsia é
a ausência de contaminação significativa. Técnicas assépticas são importantes em cirurgia para
minimizar a contaminação dos instrumentos, da equipe cirúrgica e do paciente.
98
TABELA 2 Métodos Físicos Usados para o Controle do Crescimento
Microbiano
Método Mecanismo de Comentário Uso Preferencial
Ação
Calor
1. Calor úmido
a. Fervura Desnaturação das Mata fungos e Pratos, bacias, jarros,
Proteínas células bacterianas equipamento variado.
vegetativas
patogênicas e
quase todos os
vírus em 10 min;
menos efetivo para
endósporos.
b. Autoclave Desnaturação das Método muito Meios
Proteínas efetivo de microbiológicos,
esterilização; em soluções, roupas de
cerca de 15 psi de cama, utensílios,
pressão (121 °C), curativos,
todas as células equipamento e outros
vegetativas e seus itens que podem
endósporos são suportar temperatura
mortos em cerca de e pressão.
15 minutos.
2. Pasteurização Desnaturação das Tratamento com Leite, creme e certas
proteínas calor para o leite bebidas alcoólicas
(72°C por cerca de (cerveja e vinho).
15 seg) que mata
todos os patógenos
e a maioria dos
não-patogênicos.
3. Calor seco
a. Chama direta Queima os Método muito Alças de inoculação
contaminantes até eficaz de
se tornarem cinzas. esterilização.
b. Incineração Queima até se Método muito Copos de papel,
tornarem cinzas. eficaz de curativos
esterilização. contaminados,
carcaças de animais,
sacos e panos de
limpeza.
c. Esterilização com ar Oxidação Método muito Vidros vazios,
quente eficaz de instrumentos,
esterilização, mas agulhas e seringas
requer temperatura de vidro.
de 170°C por cerca
de 2 horas.
Filtração Separação das Remove os Útil para esterilizar
bactérias do líquido micróbios através líquidos (enzimas,
de suspensão da passagem de vacinas) que são
um líquido ou gás destruídos pelo calor.
através de um
99
material
semelhante a uma
tela; a maioria dos
filtros em uso
consiste de acetato
de celulose ou
nitrocelulose.
Frio
1. Refrigeração Redução das Tem efeito Conservação dos
reações químicas e bacteriostático. alimentos, drogas e
possíveis alterações culturas.
nas proteínas.
2. Congelamento Redução das Um método eficaz Conservação dos
profundo reações químicas e para conservar alimentos, drogas e
possíveis alterações culturas culturas.
nas proteínas. microbianas, em
que as culturas são
congeladas
rapidamente a
-50°C e -95°C.
3. Liofilização Redução das Método eficaz para Conservação dos
reações químicas e a conservação alimentos, drogas e.
possíveis alterações prolongada de Culturas.
nas proteínas. Conservação dos
alimentos, drogas e
culturas
microbianas; a
água é removida
por alto vácuo em
baixa temperatura.
Alta Pressão Alteração da Conservação de Sucos de fruta.
estrutura molecular cores, sabores e
de proteínas e valores nutricionais.
carboidratos.
Dessecação Interrupção do Envolve a remoção Conservação dos
metabolismo. de água dos alimentos.
micróbios;
principalmente
bacteriostática.
Pressão Osmótica Plasmólise Resulta na perda Conservação dos
de água das alimentos.
células
microbianas.
Radiação
1. Ionizante Destruição do DNA. Não-disseminado Usado para esterilizar
na esterilização de produtos
rotina. farmacêuticos e
suprimentos médicos
e dentários.
2. Não-Ionizante Lesão do DNA. Radiação não Controle de ambiente
muito penetrante. fechado com
lâmpada UV
(germicida).
100
TABELA 3 Agentes Químicos para Controlar o Crescimento Microbiano
Agente Químico Mecanismo de Ação Uso preferencial Comentário
Fenol e Compostos Fenólicos
1. Fenol Ruptura da membrana Raramente usado, Raramente usado
plasmática, exceto como padrão como desinfetante ou
desnaturação das de comparação. anti-séptico devido à
enzimas. possibilidade de
irritação e odor
desagradável.
2. Compostos Ruptura da membrana Superfícies Os derivados do fenol
Fenólicos plasmática, ambientais, são reativos mesmo
desnaturação das instrumentos, em presença de
enzimas. superfícies cutâneas material orgânico; um
e membranas exemplo é o O-
mucosas. fenilfenol.
3. Bifenóis Provável ruptura da Sabonete para as O triclosano é um
membrana plasmática. mãos e loções exemplo
hidratantes. especialmente comum
de um bifenol, Ampla
utilização, porém mais
eficaz contra gram-
positivos.
Biguanidas (clorexidina) Ruptura da membrana Desinfecção da pele Bactericida contra
plasmática. especialmente para gram-positivos e
escovação cirúrgica. gram-negativos,
atóxicos, persistente.
Halogênicos O iodo inibe a função O iodo é um anti- O iodo e o cloro
das proteínas e é um séptico eficaz podem agir
forte agente oxidante; o
disponível como isoladamente ou como
cloro forma o agente tintura e como componentes de
oxidante forte ácido iodofor; o gás cloro é compostos
hipocloroso, que alterausado para inorgânicos e
os componentes desinfetar o orgânicos.
celulares. equipamento de
fábricas de laticínios,
utensílios para
refeições, itens
domésticos e
vidraria.
Álcoois Desnaturação das Termômetros e Bactericida e
proteínas e dissolução outros instrumentos; fungicida, mas ineficaz
dos lipídeos. ao limpar a pele com contra endósporos ou
álcool antes de uma vírus não-
injeção, a maior envelopados; alcoóis
parte da ação comumente usados
desinfetante são o etanol e o
provavelmente isopropanol.
provém de
simplesmente
remover
(degerminar) o pó e
alguns micróbios.
101
Metais pesados e Seus Desnaturação da O nitrato de prata Os metais pesados
Compostos enzimas e de outras pode ser usado para como a prata e o
proteínas essenciais. prevenir a oftalmia mercúrio são biocidas.
gonorréica neonatal;
o mercurocromo
desinfeta a pele e as
membranas
mucosas; o sulfato
de cobre é um
algicida.
Agentes de Superfície
1. Sabões e Remoção mecânica dos Degerminação da Muitos sabões
detergentes ácido- micróbios através da pele e remoção de antibacterianos
aniônicos escovação. resíduos. contêm
aniônicos. antimicrobianos.
2. Detergentes ácido- Incerto; pode envolver a Sanitização em Amplo espectro de
aniônicos inativação ou ruptura indústrias de atividade; atóxicos,
das enzimas. processamento de não-corrosivos e de
lacticínios e ação rápida.
alimentos.
3. Detergentes Inibição de enzimas, Anti-séptico para a Bactericidas,
catiônicos ) desnaturação das pele, instrumentos, bacteriostáticos,
compostos de proteínas e ruptura das utensílios, objetos de fungicidas e viricidas
amônio membranas borracha. contra vírus
quarternário) plasmáticas. envelopados;
exemplos de qual são
o Cepacol e o
Zephiram.
Ácidos Orgânicos Inibição metabólica, Ácido sórbico e ácido Amplamente usados
afetando principalmente benzoico efetivos em para controlar bolores
os bolores; ação não baixo pH, parabenz e algumas bactérias
relacionada à sua muito usado em AM alimentos e
acidez. cosméticos, xampus; cosméticos.
propianato de cálcio
usado em pão.
Aldeídos Desnaturação das O glutaraldeído é Antimicrobianos muito
proteínas. menos irritante que o efetivos.
formaldeído e é
usado para a
desinfecção de
equipamentos
médicos.
Esterilizantes Gasosos Desnaturação das Excelente agente O óxido de etileno é o
proteínas esterilizante, mais comumente
especialmente para usado.
objetos que seriam
danificados pelo
calor.
Peroxigênios (Agentes Oxidação Superfícies O ozônio é
Oxidantes) contaminadas; amplamente usado
alguns ferimentos como suplemento
profundos, em que para a cloração; o
eles são muito peróxido de
efetivos contra hidrogênio é um anti-
102
anaeróbicos séptico fraco, mas um
sensíveis ao bom desinfetante. O
oxigênio. ácido peracético é
especialmente efetivo.
103
7. A autoclave (vapor sob pressão) á o método mais efetivo de esterilização com calor úmido.
O vapor deve entrar em contato direto com o material a ser esterilizado.
8. Na pasteurização HTST, uma alta temperatura é usada por um curto período (72°C por 15
segundos) para destruir os patógenos sem alterar o sabor do alimento, o tratamento com
temperaturas ultra-elevadas (UHT) (140°C por 3 segundos) é usado para esterilizar
laticínios.
9. Os métodos de esterilização com calor seco incluem a chama direta, incineração e
esterilização com ar quente. O calor seco mata por oxidação.
10. Diferentes métodos que produzem o mesmo efeito (redução no crescimento microbiano)
são denominados tratamentos equivalentes.
Filtração
1. A filtração é a passagem de um líquido ou gás através de um filtro com poros pequenos o
suficiente para reter os micróbios.
2. Os micróbios podem ser removidos do ar por filtros de partículas de alta eficiência.
3. Os filtros de membrana compostos de nitrocelulose ou acetato de celulose são comumente
usados para filtrar bactérias, vírus e mesmo proteínas de alta massa molecular.
Baixas Temperaturas
1. A eficácia das baixas temperaturas depende do microrganismo particular e da intensidade
da aplicação.
2. A maioria dos microrganismos não se reproduz em temperaturas comuns de refrigerador
(0-7°C).
3. Muitos micróbios sobrevivem (mas não crescem) nas temperaturas abaixo de zero, usadas
para armazenar alimentos.
Alta Pressão
1. Alta pressão desnatura as proteínas nas células vegetais.
Dessecação
1. Na ausência de água, os microrganismos não podem crescer, mas podem permanecer
viáveis.
2. Vírus e endósporos podem resistir à dessecação.
Pressão Osmótica
1. Os microrganismos em altas concentrações de sais e açucares sofrem plasmólise.
2. Os bolores e as leveduras são mais capazes que as bactérias de crescer em matérias com
baixa umidade ou alta pressão osmótica.
Radiação
1. Os efeitos da radiação dependem de seu comprimento de onda, intensidade e duração.
2. A radiação ionizante (raios gama, raios X e feixes de elétrons de alta energia) tem um grau
de penetração e exerce seu efeito principalmente ionizando a água e formando radicais
hidroxila altamente reativos.
3. A radiação ultravioleta (UV), uma forma de radiação não-ionizante, tem baixo grau de
penetração e causa lesão celular produzindo dímeros de timina no DNA, que interferem
com a replicação do DNA; o comprimento de onda germicida mais efetivo é 260 nm.
4. As microondas podem matar os micróbios indiretamente à medida que as matérias de
aquecem.
104
Avaliando um Desinfetante
1. No teste de uso-diluição, a sobrevivência bacteriana (S.choleraesuis, S. aureus e P.
aeruginosa) na diluição de um desinfetante recomendado pelo fabricante é determinada.
2. Vírus, bactérias formadoras de endósporos, microbactérias e fungos também podem ser
usados no teste de uso-diluição.
3. No método de disco-difusão, um disco de papel filtro é embebido com uma substância
química e colocado em uma placa de agar inoculada; uma zona de inibição indica
efetividade.
TIPOS DE DESINFETANTE
Fenol e Compostos Fenólicos
1. Os compostos fenólicos exercem sua ação lesando as membranas plasmáticas.
Bifenóis
1. Bifenóis, como o triclosano (venda liberada) e hexaclorofeno (prescrito) são amplamente
usados em produtos domésticos.
Biguanidos
1. A clorexidina lesa as membranas plasmáticas das células vegetais.
Halogênios
1. Alguns halogênios (iodo e cloro) são usados isoladamente ou como componentes de
soluções inorgânicas ou orgânicas.
2. O iodo pode ser combinado com certos aminoácidos para inativar enzimas e outras
proteínas celulares.
3. O iodo está disponível como tintura (em solução com álcool) ou como iodofor (combinando
a uma molécula orgânica).
4. A ação germicida do cloro baseia-se na formação de ácido hipocloroso quando o cloro é
adicionado à água.
5. O cloro é usado como desinfetante em forma gasosa (Cl² ou ClO²) ou em um composto,
como o hipoclorito de cálcio, o hipoclorito de sódio, o dicloroisocianurato de sódio e as
cloraminas.
Álcoois
1. Os alcoóis exercem sua ação desnaturando as proteínas e dissolvendo os lipídeos.
2. Em tinturas, eles aumentam a efetividade de outros produtos químicos antimicrobianos.
3. O etanol aquoso (60 a 95%) e o isopropanol são usados como desinfetantes.
105
Antibióticos
1. A nisina e a natamicina são antibióticos usados para conservar alimentos, especialmente
no queijo.
Aldeídos
1. Os aldeídos como o formaldeído e o glurataldeído exercem seu efeito antimicrobiano
tornando as proteínas inativas.
2. Eles estão entre os mais efetivos desinfetantes químicos.
Quimioesterilizantes Gasosos
1. O óxido de etileno é o gás mais frequentemente usado para a esterilização.
2. Ele penetra na maioria dos materiais e mata todos os microrganismos por desnaturação
proteínas.
Peroxigênios (Agentes Oxidantes)
1. O ozônio, o peróxido e o ácido peracético são usados como agentes antimicrobianos.
2. Eles exercem seu efeito oxidando as moléculas dentro das células.
Exercícios
106
h) assepsia:
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
i) asséptico:
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
3) Qual a diferença entre tratamentos com sufixo -cida e os tratamentos com sufixo -stático (ou
-stase)?
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
107
Roteiros de
aulas práticas de
Microbiologia
Geral
(MIG)
108
Laboratório de Microbiologia
A unidade curricular Microbiologia Geral (MIG) tem como principal objetivo o aprendizado
de técnicas, representadas por uma série de operações executadas segundo normas
padronizadas, possibilitando o conhecimento e a manipulação de microrganismos.
As técnicas microbiológicas básicas e essenciais podem ser resumidas em:
a) observação microscópica: observação de microrganismos em condições adequadas à
visualização em microscópio;
b) cultivo artificial: multiplicação dos microrganismos fora do seu habitat natural, utilizando meios
de cultura;
c) esterilização: eliminação das formas vivas nos meios de cultura, utensílios e instrumentos;
d) prática asséptica: prevenção do contato do material em estudo com formas microbianas
indesejáveis.
Laboratórios de microbiologia são locais onde se manipulam os microrganismos com os
mais variados objetivos, tais como:
a) identificar os microrganismos responsáveis por doenças em animais e vegetais;
b) avaliar a microbiota do ar, do solo, da água, dos alimentos, entre outros;
c) identificar a presença de microrganismos indesejáveis nos alimentos ou produtos
industrializados;
d) usar os microrganismos como modelos de estudo para a compreensão dos processos vitais;
e) descobrir substâncias (remédios, vacinas, antibióticos, vitaminas, hormônios, …) que
combatam microrganismos patogênicos ou favoreçam o crescimento e desenvolvimento de
plantas e animais.
Como no laboratório de microbiologia trabalha-se com organismos que na sua grande
maioria são invisíveis a olho nu, deve-se tomar o máximo cuidado para não contaminar:
a) o manipulante;
b) o ambiente;
c) o material em estudo.
Para isso é necessário que algumas medidas sejam tomadas e que regras de trabalho
sejam estabelecidas.
109
6) se tiver algum ferimento nas mãos, avise o professor e procure não tocar no material;
7) prender cabelos longos para evitar exposição ao fogo da chama do bico de Bunsen;
8) usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado: guarda-pó ou jaleco de mangas
longas, limpo e fechado durante toda a aula, para proteger as roupas de contaminação e manchas
ou descolorações com soluções; luvas cirúrgicas descartáveis; máscara, touca e óculos de
proteção (estes quando necessário);
9) retirar joias, anéis, relógios e pulseiras;
10) usar calças compridas e sapatos fechados;
11) usar óculos de segurança nas tarefas que apresentarem riscos;
12) nunca aplicar maquilagem / cosméticos ou colocar / retirar lentes de contato no laboratório;
13) é expressamente proibido fumar, comer (nem balas e chicletes) ou beber no laboratório;
14) nunca colocar as mãos na boca, olhos, ouvidos e cabelos durante a aula e, caso ocorra,
adotar os procedimentos de higienização adequados;
15) manter a caneta longe da boca;
16) limpar com solução desinfetante, no início e no final de cada aula, a bancada onde você
trabalhou e lavar as mãos após desinfetar a bancada ;
17) nunca colocar instrumentos contaminados, como alças de platina, agulhas, pinças e
pipetas ou ponteiras sobre a bancada. Alças, agulhas e pinças devem ser esterilizadas na chama
(flambadas); pipetas, ponteiras e lâminas usadas devem ser colocadas em recipientes contendo
desinfetante, especialmente designados pelo professor, NUNCA devem ser deixados sobre a
bancada ou a pia;
18) alças, agulhas e pinças devem ser esterilizadas na chama (flambadas = aquecidas ao
rubro) antes e depois de serem usadas e, antes de tocar o material de cultura, deve-se esperar
que a alça esfrie próximo à chama;
19) deve-se trabalhar na zona de segurança do bico de Bunsen,
que compreende a área mais próxima possível do bico de Bunsen
onde o ar é livre de microrganismos;
A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa a diminuição de
microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele
apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de
chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser
utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não
forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta
diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de
Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da
chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é
uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona
Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a
Flambagem).
20) ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias
inflamáveis (álcool, éter, acetona, …) por perto;
21) tubos de ensaio e placas de Petri com meios de cultura, inclusive aqueles com crescimento
de microrganismos só poderão ser abertos nas proximidades da chama para evitar contaminação;
22) tubos de ensaio e placas de Petri devem ser manipulados adequadamente e NUNCA se
deve colocar o tampão de algodão sobre a bancada;
23) transportar e manter os tubos de cultura (tubos de ensaio) em uma estante apropriada para
evitar acidentes e contaminações de pessoas e ambiente, NUNCA colocar os tubos no bolso do
jaleco ou deitados sobre a bancada;
24) manipular culturas de bactérias e fungos com muito cuidado;
25) manipular as culturas de fungo rapidamente para evitar a disseminação de suas estruturas
reprodutivas (esporos) no ambiente do laboratório;
26) identificar de maneira clara e completa os materiais particulares (por exemplo: tipo de
amostra, data, nome da equipe, turma, método, meio de cultivo, microrganismo inoculado, entre
outras informações pertinentes);
27) todo material contaminado deve ser obrigatoriamente esterilizado antes do descarte;
110
28) todo material deve ser pipetado com cuidado, lentamente e com peras específicas;
29) nunca pipetar com a boca qualquer que seja a natureza da solução (mesmo que seja
água);
30) em caso de quebra ou derramamento de culturas, cobrir toda a área com toalhas de papel
e derramar sobre elas o líquido desinfetante disponível no laboratório. Após 15 minutos, remover
as toalhas e descartá-las de forma indicada pelo professor;
31) relatar imediatamente ao professor todo e qualquer acidente, ferimento, cortes, ocorridos
durante a aula;
32) colocar, ao final de cada aula, todas as culturas e materiais no local indicado pelo
professor;
33) falar claramente, manter atenção constante nas ações executadas, evitando
movimentação e conversas desnecessárias que possam causar distrações e provocar acidentes;
34) ao sair do laboratório fechar os registros de gás e as torneiras, desligar as luzes e
equipamentos (devidamente limpos), limpar todo o material e organizá-lo para equipes de trabalho
posteriores;
35) trabalhar atentamente e com responsabilidade!!!
111
Materiais usados nos Laboratórios de Microbiologia
2. VIDRARIAS:
2.1 Tubo de cultura ou de ensaio:
São tubos de vidro, sem borda ou com tampa de plástico rosqueável. Seu tamanho pode variar de
acordo com o trabalho a ser realizado. São utilizados no cultivo de microrganismos em pequeno
volume de meio de cultura, trazendo a vantagem de economizar meio e espaço físico.
2.2 Placas de Petri
São recipientes redondos, de vidro ou plástico, com tampa rasa. Geralmente é recomendado
determinar-se o seu diâmetro e altura, de acordo com o tipo de trabalho a ser realizado. As mais
usadas medem cerca de 100 mm de diâmetro por 10 mm de altura. Servem para conter meio de
cultura sólido; Sua superfície extensa facilita o isolamento de espécies microbianas distintas.
2.3 Pipetas graduadas (sorológicas):
São utilizadas para diluições, inoculações, distribuições de meio, etc. Em microbiologia estas
pipetas devem ser esterilizadas com uma porção de algodão hidrófobo na parte superior. As
pipetas para uso com substâncias químicas devem ser separadas das microbiológicas. As pipetas
microbiológicas são usadas preferencialmente com dispensadores automáticos.
2.4- Pipetas de Pasteur:
São tubos de vidro ou polipropileno, não graduados, estirados em capilar. Servem para
transferência de pequenos volumes de líquidos. Podem ser usadas com uma pequena pera de
borracha na extremidade superior (tetina).
2.5- Alça de Drigalsky:
É obtido pela manipulação de uma vareta de vidro à chama do maçarico. Serve para espalhar
suspensões de microrganismos na Placa de Petri contendo meio de cultura sólido. Deve ser
flambada á chama antes e após o uso.
2.6- Lâminas de vidro:
São de vidro claro e transparente, com formato retangular. São utilizadas para exame dos
microrganismos em microscópio óptico.
2.7- Lâminas escavadas:
É uma lâmina específica, usada no “ensaio em gota pendente”, onde o material é observado
suspenso em uma gota de líquido. Utilizada na observação da mobilidade dos microrganismos.
2.8- Lamínulas:
São pequenas lâminas de vidro transparente, quadradas, finas, destinadas a cobrir as
preparações contidas nas lâminas, nos ensaios a fresco. Também são usadas para o preparo de
lâminas fixadas para uso por longos períodos.
2.9- Hematocitômetro de Newbauer:
Lâmina de contagem ou câmara de Newbauer. São escavadas, milimetradas e permitem contar o
número de células contidas em um volume determinado de suspensão microbiana.
2.10- Frascos de Cultivo Microbiano:
De vidro borossilicato e tampa rosqueada de polipropileno, autoclavável. São vidrarias utilizadas
para análises de água e alimentos.
112
2.11- Erlenmeyer:
É um frasco em balão, usado como recipiente no laboratório. Feito de material de vidro, plástico,
policarbonato transparente ou polipropileno transparente, é ideal para armazenar e misturar
produtos e soluções, cultivo de organismos e tecidos e em titulações.
2.12- Garrafa de Roux:
Garrafas “achatadas” usadas para multiplicação de células (cultivo) e de esporos fúngicos.
2.13-Béquer
Recipiente usado para experimentos ou misturas. Pode ser feito de vidro, plástico, policarbonato
transparente ou polipropileno transparente. Pode ser usado, de modo grosseiro, para realizar
medidas, pois é impreciso.
2.14- Tubos de Durham:
São tubos de vidro pequenos e cilíndricos. Servem para captar o gás formado em uma
fermentação.
2.15-Termômetros:
São utilizados em estufas microbiológicas, de secagem e esterilização, banhos de água (banhos-
maria), etc. Deve-se dar preferência a termômetros de álcool (bulbo vermelho).
2.16 Bastão de vidro
Utilizado para auxiliar na dissolução de sal, agitações e na transferência de um líquido de um
recipiente para outro, evitando perdas.
2.17 Tubos Capilares
É um tubo de vidro de dimensões muitíssimo mais pequenas. Tem esta designação uma vez que
só se podem introduzir no seu interior substâncias que ocupem muito pouco volume semelhante
ao de um capilar. São usados em experiências que envolvam uma grande precisão e rigor e usam
quantidades microscópicas de substâncias.
3. ACESSÓRIOS:
3.1 Bico de Bünsen:
É um aquecedor a gás com chama, cuja temperatura varia de acordo com a regulagem. É suprido
com gás liquefeito de petróleo (GLP) e proporciona uma chama que permite a realização da
manipulação das análises microbianas. Deve-se verificar com freqüência se não há vazamentos
de gás nas conexões.
3.2 Cabo de Kolle:
É um cilindro metálico, contendo um material isolante térmico na extremidade, usado para
manipulação microbiana da alça de platina (ou níquel-cromo). Na outra extremidade metálica há
um orifício onde é colocada a alça ou agulha que são fixadas mediante encaixe rosqueável,
utilizado como suporte para este fim.
3.3 Alça de Platina e agulhas:
É um fio de platina ou outra liga metálica, medindo aproximadamente cinco centímetros,
recurvado em uma de suas extremidades. É adaptado ao cabo de Kolle. Este material é utilizado
para transferir inóculos sólidos ou em suspensão. A agulha é um fio de platina ou de outra liga,
que fixado ao cabo de Kolle, é utilizada para semear meio sólido em profundidade.
3.4 Espátulas e pinças:
Estes utensílios são normalmente produzidos em aço inoxidável. A espátula é utilizada para
pesagem de pequenas massas, enquanto a pinça para manipulação de lâminas, lamínulas, etc...
3.5 Grampo de madeira:
Utilizado para segurar e prender tubos de ensaio.
3.6 Lamparina:
Utilizada para aquecer pequenas coisas em laboratório, que não exijam temperaturas muito altas,
por meio da combustão do álcool.
3.7 Pera de sucção:
É usada para auxiliar nos procedimentos de pipetagem ao ser acoplada as pipetas.
3.8 Tetina:
Instrumentos de borracha para retirar líquidos do interior de frascos com pipetas Pasteur.
3.9 Pisseta (Pissete ou Frasco Lavador):
Com jatos de líquido dirigido, é utilizado para lavagem de precipitado, cristais, recipientes e para
113
completar e aferir volumes.
3.10 Tampão de algodão e gaze (chuchu):
Tampões de diversos tamanhos que são utilizados para fechar vidrarias como erlenmeyers e
tubos de ensaio para proceder a autoclavagem e/ou evitar o contato com outros meios de
contaminação (como o ar, por exemplo).
3.11 Barra magnética (peixinho):
Utilizada dentro de recipientes de vidro (erlenmeyers, balões e béqueres) que são colocados em
agitadores magnéticos. Por meio da sua agitação, líquidos e sólidos podem ser misturados de
modo mais homogêneo.
3.12 Swab:
É um primo do cotonete, só que feito com uma haste de madeira com uma das pontas envoltas
em algodão estéril. O "swab" inteiro é esterilizado em autoclave e usado para coletar amostras de
material para culturas de fungos e bactérias.
3.13 Estilete:
Formado por um cabo e uma lâmina. Utilizado para realizar pequenos cortes em estruturas e
facilitar a visualização em lupas e microscópios.
3.14 Escovas:
Usadas para limpeza de tubos de ensaios e outros recipientes de vidro.
4 EQUIPAMENTOS UTILIZADOS:
4.1- Agitador do tipo rotatório (Shaker):
É munido de uma plataforma onde os recipientes contendo o meio líquido são fixados O mesmo
gira de modo circular, agitando o meio continuamente durante a incubação e também expondo
maior superfície do meio à fase gasosa.
4.2- Contador de colônias:
É utilizado para contagem de colônias em Placa de Petri. É constituído de um suporte onde é
colocada a placa e acima desta, em distância definida, situa-se uma lente (lupa) que possibilita o
aumento de 1,5 vezes. Pode acompanhar uma caneta para contagem. Quando o equipamento
está funcionando, a placa é iluminada, permitindo assim maior nitidez e realce das linhas que
subdividem o suporte.
4.3 Estufa incubadora (Microbiológica):
É um tipo específico de estufa que apresenta além da porta metálica, uma porta de vidro.
Apresenta um sistema de aquecimento controlado por resistência elétrica. O aquecimento é
controlado através de um termostato e a temperatura acompanhada com termômetro analógico ou
digital. A temperatura não deve ter uma variação superior à ±0,5ºC. Para determinar a
temperatura, coloca-se um termômetro com o bulbo submerso em líquido (glicerina, água, etc.)
para maior homogeneidade da medida. Esse equipamento é utilizado como auxiliar no
crescimento e reprodução dos microrganismos, uma vez que fornece a temperatura adequada a
cada espécie microbiana.
4.4- Incubadora de banho de água (banho-maria):
É um equipamento indispensável para realizações dos ensaios de coliformes termotolerantes
(44,5ºC ± 0,2ºC). O mesmo é dotado de um termômetro, termostato e tampa para o controle de
temperatura do banho.
4.5- Estufa de Esterilização:
É um tipo específico de estufa que apresenta um sistema de aquecimento controlado por
resistência elétrica, é munida de termostato e termômetro para o controle de temperatura. Em
geral este equipamento é utilizado para esterilizar vidrarias.
4.6- Potenciômetro;
É um equipamento muito utilizado no laboratório de Microbiologia para se determinar o pH dos
diferentes tipos de meios de culturas e soluções tampão. É constituído por eletrodos, botões de
ajuste e é dotado de um sistema eletrônico capaz de fornecer leituras diretas com exatidão de
±0,1 unidades de pH.
4.7- Balanças:
São destinadas a pesagens das diferentes substâncias usadas no preparo dos vários tipos de
meios de cultura, soluções e corantes. Podem ser analógicas ou digitais. As balanças devem ser
114
mantidas sobre uma base sólida protegidas de vibrações, e também de umidade e mudanças
bruscas de temperatura.
4.8- Autoclave:
É um equipamento destinado à esterilização pelo calor úmido (vapor d´água sob pressão).
Normalmente, são utilizados para esterilizar águas de diluições, meios de cultura que suportem
temperaturas elevadas (115-120ºC), materiais contaminados que vão ser descartados e outros. O
autoclave de laboratório pode ser do tipo horizontal ou vertical, contendo os seguintes acessórios:
caldeira cilíndrica hermeticamente fechada por uma tampa de bronze ou cobre, dotada de
manômetro, válvula de escape de ar e de segurança. Em seu interior existe uma cesta metálica
(móvel) onde são colocados todos os materiais a serem esterilizados. É empregado o uso de
bioindicadores ou fitas de controle para se testar a eficiência deste equipamento.
4.9 Geladeiras e Congeladores (Freezers):
As geladeiras são utilizadas para a conservação de meios de cultura estéreis, soluções e
amostras de contra-prova. As culturas microbianas e soluções não devem ser colocados no
mesmo equipamentos que as amostras. Jamais poderá guardar refeições, lanches, bebidas ou
qualquer outro alimento que irá ser consumido. Se contiver material com risco biológico deverá ser
identificada com o pictograma adequado. Culturas vivas não devem ser congeladas. A verificação
diária da temperatura é regra geral de controle destes equipamentos.
4.10 Agitador Magnético:
É munido de uma plataforma metálica onde o recipiente contendo o meio líquido e uma barra
magnética revestida de material inerte é colocado. O mesmo gira barra magnética de modo
circular, agitando o meio continuamente durante a incubação e também expondo maior superfície
do meio à fase gasosa,
4.11 Microscópio Ótico:
Equipamento utilizado para o estudo dos microrganismos. Os equipamentos mais usados
permitem o aumento de até 1.250 vezes e podem ser monocular ou binocular. Deve-se ter
cuidado para não utilizar preparações a fresco com a objetiva de imersão.
4.12 Auxiliar de Pipetagem (pipeting aide):
Equipamento utilizado para pipetar líquidos viscosos tais como meios de cultura e culturas
microbianas. As pipetas devem ter uma proteção de algodão hidrófobo para proteger o auxiliar de
possíveis contaminações.
4.13 Cabines de Fluxo Laminar Horizontal (A) e Vertical (B):
As cabines de fluxo laminar podem ser horizontais ou verticais. São usadas para a manipulação
de materiais estéreis como meios de cultura esterilizados, amostras de materiais estéreis
(soluções injetáveis, nutrição parenteral, etc), culturas puras de microrganismos,.... As cabines de
fluxo laminar horizontais não devem ser usadas para materiais muito contaminados ou culturas
puras de microrganismos, pois o fluxo de ar é direcionado no sentido do operador.
4.14 Lupa:
Instrumento óptico munido de uma lente com capacidade de criar imagens virtuais ampliadas. É
utilizada para observar com mais detalhe pequenos objetos ou superfícies.
4.15 Espectrofotômetro:
Determinar a concentração de uma espécie em solução a partir do gráfico da variação de
absorvância (ou transmitância) em função da concentração de várias soluções-padrão.
4.16 Destilador
equipamento utilizado para a destilação de água
4.17 Agitador mecânico
Promove agitação mecânica em fluido, líquidos semi-viscosos e material em suspensão através
de movimento circular de hélices.
4.18 Micro-ondas:
Utilizado para aquecer soluções.
4.19 Meios de cultura
Utilizados para o crescimento e manutenção de microrganismos.
4.20 Corantes
As soluções corantes são utilizadas para preparação de microrganismos para a observação
microscópica.
115
4.21 Soluções Desinfetantes:
As soluções desinfetantes são utilizadas para antissepsia das mãos (álcool 70% m/m), ou
desinfecção das bancadas (hipoclorito de sódio 2,5%, álcool 70% m/m ou álcool 70% m/m+ Iodo
0,1-0,5% m/v), ou ainda para descarte de resíduos líquidos e de pipetas contaminadas (não usar
solução inflamável com álcool 70%). Antes de iniciar qualquer atividade as bancadas devem ser
desinfetadas e providenciado recipiente com solução de hipoclorito de sódio para descarte das
pipetas. As soluções podem ser armazenadas em pissetas plásticas.
116
117
Microscopia
1. Introdução
Os microrganismos são seres vivos muito pequenos. O olho humano é incapaz de vê-los
de forma clara e individualizados. Para observá-los, é preciso aumentá-los, o que se consegue
com o uso de um microscópio óptico composto.
O microscópio óptico composto ou microscópio de luz é um instrumento de precisão que
permite a visualização de microrganismos. Ele se constitui, basicamente, de uma parte mecânica
e de uma parte óptica.
118
Os bons microscópios ópticos podem superar bastante esse limite, distinguindo em até 0,2 μm.
O sistema de iluminação é representado pelo condensador, que dirige os raios de luz para
o objeto, e por uma fonte de luz que pode ser direta ou refletida por um espelho. O condensador
possui um diafragma com a finalidade de controlar a quantidade de luz desejada. A refração é o
desvio da luz quando ela passa de um meio para outro de densidades diferentes.
3. Objetivos
- Reconhecer as partes e aprender a manusear o microscópio óptico;
- Aprender a focalizar preparados no microscópio;
- Observar atentamente os cuidados a serem tomados com o microscópio de luz;
- Observar e reproduzir na forma de desenhos a morfologia dos objetos examinados durante a
aula.
4. Materiais
Lâminas; microscópio óptico composto; óleo de cedro (óleo de imersão); papel absorvente.
5. Métodos
- Reconhecer as partes do microscópio;
- Focalizar as lâminas, repetindo a focalização tantas vezes quantas forem necessárias;
- Observar a morfologia dos objetos examinados.
119
6. Cuidados com o microscópio após o uso
- Distanciar a objetiva da lâmina;
- Retirar a lâmina da platina;
- Limpar todas as lentes com papel absorvente macio;
- Caso tenha sido utilizado óleo de imersão, limpar a objetiva de imersão com papel absorvente;
- Colocar a platina na posição totalmente abaixada;
- Colocar a menor lente objetiva apontada;
- Desligar o sistema de iluminação;
- Retirar o aparelho da tomada;
- Recobrir o aparelho com a respectiva capa protetora.
7. Aula prática
Focalize as estruturas em cada lâmina e esquematize a morfologia observada no espaço
correspondente.
Objeto:_________________________ Objeto:_________________________
Aumento final:___________________ Aumento final:___________________
Objeto:_________________________ Objeto:_________________________
Aumento final:___________________ Aumento final:___________________
120
PARA CASA
1) Descreva o procedimento de focalizar com óleo de imersão.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
121
Averiguação da presença de microrganismos no ambiente e experimento de Price
1. Introdução
O meio aquático foi, provavelmente, o ambiente de origem dos microrganismos que,
posteriormente, se especializaram e colonizaram o ambiente terrestre. Hoje, eles são encontrados
em toda parte, em suspensão ou assentados com poeira em várias superfícies. Como os
microrganismos estão presentes nas partículas de poeira, são passíveis de entrar no organismo
do indivíduo cada vez que se respira. O ar deposita-se nos cabelos, nas roupas, na pele e nas
mucosas. Do ar passam para o alimento e para a bebida. Felizmente, na sua maioria, os
microrganismos são inócuos ou benéficos. São relativamente poucos os que causam prejuízos ao
homem. É função do microbiologista estimular e otimizar o desenvolvimento de microrganismos
benéficos e inibir aqueles que causam doenças ou deterioram os alimentos e o ambiente.
As mãos, por outro lado, constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção
cruzada. A quantidade de microrganismos constituintes da microbiota normal da pele deve ser
reduzida, de modo a eliminar possíveis microrganismos patogênicos aí presentes.
A desinfecção é definida como a eliminação parcial dos microrganismos presentes em um
determinado ambiente. Os métodos de desinfecção visam, principalmente, destruir as formas
microbianas patogênicas ao homem, através da utilização de um agente desinfetante ou agente
microbiano. Os diversos tipos de agentes antimicrobianos poderiam ser divididos em três grupos:
agentes físicos, agentes químicos e agentes quimioterápicos. O grau de eficiência de cada agente
é dependente da concentração, das condições do ambiente e do estado das células.
2. Objetivos
Reconhecer materiais, equipamentos e normas do laboratório de microbiologia;
Averiguar a presença de microrganismos no ambiente;
Averiguar a presença de microrganismos na pele humana e as alterações no seu número e na sua
diversidade com as práticas de higienização das mãos.
3. Materiais
3.1 Meios de cultura e soluções
Ágar batata dextrosado (BDA – batata dextrose ágar)
Álcool 70%
Sabonete líquido
4. Procedimento
4.1 Verificação de contaminação ambiental
Pegar duas placas de Petri com meio de cultivo e identificá-las com nome do grupo, data e
número da placa (1 ou 2 – que identificará a condição de inoculação) na parte de trás da placa
com canetinha, de modo que não comprometa a visualização dos resultados (seguindo a
circunferência da placa);
Remover o filme transparente de PVC ao redor de uma placa de Petri com BDA e expô-la em uma
determinada condição preestabelecida:
122
GRUPO 1:
placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________
(escolher um local no Instituto)
placa 2: pele – passar os dedos em vários pontos da superfície do meio de cultivo.
GRUPO 2:
placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________
(escolher um local no Instituto)
placa 2: cabelo – agitar vigorosamente os cabelos em direção à superfície da placa.
GRUPO 3:
placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________
(escolher um local no Instituto)
placa 2: respiração – inocular na placa, tossindo ou espirrando, diretamente sobre a superfície do
meio de cultivo.
GRUPO 4:
placa 1: ar – deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos no (a) __________
(escolher um local no Instituto)
placa 2: cabelo – inocular na placa falando diretamente sobre a superfície do meio de cultivo.
123
RELATÓRIO:
1) Em relação às placas com meio de cultivo BDA inoculadas de diferentes formas pelos 4 grupos,
enumere e caracterize as colônias que cresceram na superfície das placas, quanto a tamanho, cor
e forma, nos esquemas a seguir:
GRUPO 1 – PLACA 1 GRUPO 1 – PLACA 2
124
2) Em relação às placas de Petri do experimento de Price, esquematize o resultado obtido:
Tratamentos
Grupo / nome
Avaliações A B C D
do aluno
T F B T F B T F B T F B
Grupo 1 No de colônias
Grupo 2 No de colônias
Grupo 3 No de colônias
Grupo 4 No de colônias
T = total, F = fungos, B = bactérias
4) O que ocorreu com a área de controle da placa de Petri usada no “Experimento de Price”
(onde o dedo não foi colocado)? Justifique seus resultados.
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5) O que ocorreu com a placa de Petri usada como controle no experimento “Verificação de
contaminação ambiental”? Justifique seus resultados.
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125
Preparo de materiais e vidrarias para esterilização em autoclave
1. Introdução
O acondicionamento correto de materiais e de vidrarias é de vital importância para a
esterilização eficiente em autoclave. O sucesso das análises depende da obtenção de materiais
livres de contaminação iniciais, a fim de que se possa determinar apenas o microrganismo
presente em determinada amostra. Assim, pipetas, placas de Petri, tubos de cultura e demais
instrumentos usados em microbiologia devem estar corretamente embalados, para que, depois de
esterilizados, possam ser guardados sem que sofram nenhum tipo de contaminação subsequente.
Placas e pipetas devem ser acondicionadas em papel de embrulho, ou em papel kraft, e
identificadas antes da esterilização (Fig. 1 e 2). Tubos de ensaio e erlenmeyers (balões de fundo
chato) com meio de cultura devem possuir tampão de algodão e gaze (boneca / chuchu) obtido
por meio da técnica de “embuchamento” (Fig. 3 e 4). Em seguida, as bonecas de gaze devem ser
cobertas por uma coifa, feita com um pedaço de papel kraft, que será amarrada com um fio ou
elástico (Fig. 4).
Para testar a eficiência da esterilização, pode ser realizado um processo químico com uma
fita própria para autoclave (fita adesiva; Fig. 5) ou um processo biológico, com uma ampola
contendo Bacillus stearothermophillus (um bastonete esporulado muito resistente ao calor; Fig. 6).
Após a esterilização, a ampola com o microrganismo é incubada em estufa regulada a 37 oC, por
24 horas. Se não houver mudança na cor inicial (rosa) da ampola, a esterilização foi eficiente.
Caso ocorra mudança da cor inicial, de rosa para amarelo, a esterilização não foi eficiente (Fig. 6).
A mudança da cor inicial rosa para amarelo indicará ocorrência de fermentação de carboidratos
existentes no líquido da ampola, demonstrando, portanto, que o microrganismo continua vivo.
Compreende-se por esterilização a completa destruição de qualquer organismo vivo. Essa
destruição pode ser realizada pelo chamado controle de microrganismos, sendo que o mais
frequentemente usado é o que utiliza o calor como agente. O emprego de calor se faz por meio de
flambagem e estufa (calor seco) e de água fervente, autoclavagem e tindalização (calor úmido). O
calor seco provavelmente exerce a maioria de seus danos pela oxidação das moléculas. O calor
úmido destrói os microrganismos principalmente pela desnaturação proteica, pela presença de
moléculas de água, que ajudam a romper as pontes de hidrogênio, outras interações fracas que
mantêm as proteínas em suas conformações tridimensionais, além de romperem membranas
lipídicas.
126
alcança 121 oC, que é alta o suficiente para matar os esporos, como também organismos
vegetativos, e para romper a estrutura dos ácidos nucleicos nos vírus.
Na tindalização, o material é submetido a três sessões de exposição a vapor de água a
100 oC, durante 20 a 45 minutos; durante 45 minutos; e durante 20 a 45 minutos, com um tempo
de repouso entre elas de 24 horas. Consegue-se a esterilização visto que os esporos germinam
entre duas sessões e depois são destruídos. Essa técnica é usada para soluções açucaradas ou
que contenham gelatina.
2. Objetivo
- Aprender a preparar materiais de forma correta para esterilização;
- Observar o funcionamento de uma autoclave.
3. Materiais
1) placas de Petri 6) papel kraft 11) gaze
2) pipetas 7) canetinhas 12) barbante
3) erlenmeyer 8) fita crepe 13) elástico
4) béquer 9) tesoura 14) folha de papel A4
5) tubos de ensaio 10) algodão 15) autoclave
4. Métodos
4.1 Preparação da vidraria para esterilização
Placas de Petri
- Separar as placas limpas e secas;
- Embalar as placas (mínimo 4 e máximo 10) para facilitar a estocagem);
- Colocar as placas no centro do papel e começar a embrulhá-las firmemente, para evitar a
absorção de umidade em excesso; fechar com fita crepe (Fig. 7).
Pipetas
- Colocar um pedaço pequeno de algodão no bocal de cada uma das pipetas;
- Embrulhá-las uma a uma, identificando-as de acordo com as orientações do professor (Fig. 8).
Tubos de ensaio e erlenmeyers
- Preparar os tampões de algodão e gaze de acordo com o tamanho da boca de cada vidraria;
- Colocar os tampões na boca dos tubos de ensaio e dos erlenmeyers de forma que fiquem firmes
mas não muito apertados;
- Colocar um pedaço de papel kraft sobre o tampão em cada tubo de ensaio e em cada
erlenmeyer, prender com elástico ou barbante (Fig. 4).
Béqueres
- Colocar um pedaço de papel kraft sobre a boca do béquer e prender com elástico ou barbante.
127
- Em seguida, abrir os manípulos em cruz e retirar os materiais, colocando-os em estufa de
secagem, e incubando-os a 100 oC por 30 minutos.
Observações:
• Não abrir o registro antes que o manômetro atinja a posição zero, para evitar que o
material esterilizado fique muito molhado e que os papéis que o envolvem se rasguem;
• Nunca abandonar o local de esterilização, conferindo sempre a temperatura da autoclave,
e evitando a quebra de materiais e o RISCO DE EXPLOSÃO.
líquido
líquido
rosa
amarelo
5) Métodos de esterilização frequentemente usam o calor. Cite os meios que podem ser empregados.
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10) Por que se deve esperar sempre que a autoclave escoe todo o vapor (posição zero do manômetro)
antes de proceder a abertura da tampa?
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134
EXERCÍCIOS DO LIVRO
1) Qual o significado e a definição de:
- PMT:
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- TMT:
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- TRD ou valor D:
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3) O tempo de morte térmica para uma suspensão de endosporos de Bacillus subtilis é de 30 minutos
em calor seco e menos de 10 minutos em autoclave. Que tipo de calor é mais efetivo? Por quê?
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6) Por que os tratamentos pasteurização clássica, HTST e UHT são chamados de tratamentos
equivalentes?
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CURIOSIDADE SOBRE ESTERILIZAÇÃO COMERCIAL
A esterilização comercial é um método utilizado para destruir endosporos da bactéria
Clostridium botulinum e não é tão rigorosa como a esterilização completa. A razão é que se os
endosporos de C. botulinum são destruídos, então qualquer outra bactéria deteriorante significativa ou
patogênica também será destruída.
Para garantir a esterilização comercial, aquecimento suficiente é fornecido ao tratamento 12D
(12 reduções decimais), pelo qual uma população teórica de endosporos de C. botulinum irá diminuir
em 12 ciclos logarítmicos. Isso significa que se existem 10 12 (1.000.000.000.000) endosporos em uma
lata, após o tratamento haveria somente 1 sobrevivente. Como 10 12 é uma população supostamente
grande, esse tratamento é considerado quase seguro.
Algumas bactérias termofílicas que formam endosporos, possuem endosporos que são mais
resistentes ao aquecimento que os de C. botulinum. Entretanto essas bactérias são termófilos
obrigatórios e, geralmente, sem mantêm dormentes em temperaturas abaixo de 45 oC. Logo, elas não
são um problema de deterioração em temperaturas normais de armazenamento de alimentos
enlatados.
136
O mundo dos fungos
1. Introdução
Também conhecidos como bolores, mofos, leveduras, cogumelos, orelhas-de-pau, os
fungos contribuem de forma fundamental para o ciclo da matéria nos ecossistemas, pois muitos
são decompositores de matéria orgânica, o que gera a reciclagem dos nutrientes. Alguns são
causadores de doenças, outros são comestíveis e outros usados na indústria para fabricação de
bebidas e do pão. Alguns fungos são venenosos, como o cogumelo branco da espécie Amanita
muscuria, que pode matar uma pessoa, e espécies do gênero Psilocybe, que provocam efeitos
alucinógenos semelhantes ao LSD, causando sérios danos ao sistema nervoso. Algumas
espécies de fungos vivem em associações mutualísticas com raízes de plantas, formando as
micorrizas. Os fungos também podem se associar a algas verdes e a cianobactérias, formando os
liquens, que se instalam em troncos de árvores, rochas, muros, etc. Eles podem ser unicelulares,
como as leveduras, ou pluricelulares, como os fungos filamentosos. Nesta aula prática, você terá
oportunidade de observar algumas estruturas dos fungos.
2. Objetivos
- Entender a diversidade dos fungos;
- Observar macroscopicamente e microscopicamente a estrutura dos fungos.
3. Materiais
– Exemplares de fungos – microscópio
(mofos, cogumelos,orelhas de pau,...) – lupa
– lâmina – estilete
– lamínula – durex
– pinça
4. Procedimentos
4.1 Estrutura macroscópica e microscópica de fungos
- Selecione alguns tipos de fungos e observe sua estrutura macroscópica, faça pequenos cortes e
observe as estruturas em uma lupa.
- Para observação microscópica, faça lâminas pela técnica do Imprint e observe no microscópio.
137
5. Resultados e discussão
Estrutura macroscópica e microscópica de fungos
Desenhe os aspectos macroscópicos e as estruturas microscópicas dos fungos que você
observou. Descreva as principais características observadas!
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138
O mundo dos fungos – fermentação
1. INTRODUÇÃO
A fermentação alcoólica é realizada por um fungo unicelular, também chamado de fungo da
cerveja ou fermento de padaria, cientificamente chamado de Saccharomyces cerevisiae. A S.
cerevisiae é uma levedura que fermenta o açúcar, produzindo álcool etílico e gás carbônico.
Essa levedura é utilizada na fabricação de bebidas alcoólicas (vinhos, cervejas, aguardentes, etc.)
e na fabricação de pães - na qual o gás carbônico é o responsável pelas bolhas que tornam a
massa mais macia.
Reação: a levedura S. cerevisiae é o agente biológico da fermentação alcoólica, na qual os
açúcares são transformados em etanol e dióxido de carbono, segundo a reação química:
C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + energia
Glicose Etanol Dióxido de carbono
2. OBJETIVO
Observar a reação química na fermentação da levedura S. cerevisiae em diferentes proporções de
açúcar (alimento) e de levedura.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
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3.2 MÉTODOS
Montar o experimento como indicado na tabela a seguir:
139
- Aguarde o início do processo de fermentação.
- Agite o frasco e retire uma alíquota de leveduras com auxílio de espátula e capilar.
- Faça o esfregaço em uma lâmina com essa alíquota e cubra com lamínula.
- Observe no microscópio.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
a) O que aconteceu com os balões de ar quando colocados na boca dos tubos? Por que?
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f) O que aconteceu nos controles? Por que é importante montar esses controles?
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140
g) Explique por que o fermento biológico faz crescer as massas de pães.
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6. CONCLUSÃO
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141
Preparações Microscópicas a Fresco e Fixadas Simples
Objetivos:
– Preparar lâminas para observação de microrganismos (bactérias e fungos);
– Realizar técnicas de esfregaço, fixação e coloração simples;
– Visualizar os microrganismos em microscópio.
Preparações microscópicas
A perfeita visualização dos microrganismos e/ou das suas estruturas só é possível se a
preparação estiver adequada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e do
microrganismo a ser avaliado. Duas técnicas gerais são empregadas:
- A fresco
Preparações deste tipo permitem o exame de organismos nas condições normais de vida e são
preferencialmente utilizados para verificar mobilidade, morfologia (quando a morfologia da célula é
distorcida por processos de fixação/coloração), processos fisiológicos (divisão celular, formação de
esporos). As preparações a fresco podem ser realizadas com ou sem coloração. Geralmente são
utilizados corantes vitais que não comprometem a viabilidade celular. Ex.: azul de metileno.
- Fixados e corados
As preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas dos
microrganismos. As etapas essenciais dessas preparações são: preparo de esfregaço, fixação e
coloração. O esfregaço é uma camada muito fina de material sobre a lâmina que deve ser secada ao
ar. A fixação pode ser feita pela ação do calor e serve para imobilizar os constituintes celulares, ou
seja, para fixar o esfregaço pela precipitação ou coagulação de proteínas. A coloração pode ser
simples (1 corante, ex.: azul de metileno) ou diferenciais (mais de um corante, ex.: Gram)
142
3) Micélio fúngico
- flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama da
lamparina;
- flambar a agulha de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama;
- tomar a placa de Petri com o micélio e, com auxílio da agulha, retirar uma pequena porção de micélio;
- fechar a placa;
- pegar a lâmina e depositar em seu centro uma porção do micélio;
- pingar uma gota de azul de metileno a pequena distância da suspensão e, sobre a lâmina, colocar
uma lamínula;
- observar ao microscópio na objetiva de 40x.
Resultados
Desenhar e descrever as estruturas observadas nas 5 lâminas!
LÂMINA 1
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LÂMINA 2
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LÂMINA 3
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143
Técnica de Coloração de Gram.
Objetivos
144
2) Iogurte
- flambar rapidamente uma lâmina de microscopia nos dois lados, “cortando” lentamente a chama
da lamparina;
- flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar perto da chama;
- tomar o béquer com iogurte e introduzir a alça de platina no interior dele até tocar o iogurte;
- transferir uma pequena alíquota da cultura com a alça para a lâmina e espalhar o material com
movimentos circulares (esfregaço);
- secar ao ar;
- “cortar” lentamente a lâmina na chama da lamparina 3 vezes para que o material fique bem
aderente à lâmina (fixação). A fixação é feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano;
- corar a lâmina pela Técnica de Gram (descrita anteriormente);
- observar ao microscópio na objetiva de 100x com óleo de imersão.
145
Resultados
Desenhar e descrever as estruturas observadas nas 3 lâminas!
LÂMINA 1
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LÂMINA 2
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LÂMINA 3
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146
Atividades extras
Microbiologia
Geral
(MIG)
147
Resumo (individual e manuscrito) sobre o vídeo “O mundo das bactérias”
Globo Repórter - Edição do dia 18/02/2011
Parte 1 (9 min e 12 s):
1) Mulher limpa a casa três vezes por dia e passa no teste de infectologistas
148
Anatomia Funcional das Células Procarióticas e Eucarióticas.
Apesar de sua complexidade e variedade, todas as células vivas podem ser classificadas
em dois grupos: procarióticas e eucarióticas, com base em sua ultraestrutura vista ao microscópio
eletrônico. Plantas e animais são inteiramente compostos de células eucarióticas. No mundo
microbiano, as bactérias e as arquibactérias são procariotos. Outros microrganismos como fungos
(leveduras e bolores), protozoários e algas são eucariotos. Os vírus, como elementos acelulares,
não se encaixam em classificações das células vivas.
– Células procarióticas:
* Glicocálice
* Flagelos
* Fímbrias
* Pili
* Parede Celular
* Membrana Plasmática
* Citoplasma
* Área Nuclear
* Ribossomos
* Inclusões
* Endosporos
– Células eucarióticas
* Flagelos
* Cílios
* Parede Celular
* Glicocálice
* Membrana Plasmática
* Citoplasma
* Núcleo
* Retículo endoplasmático
* Ribossomos
* Complexo de Golgi
* Lisossomos
* Vacúolos
* Mitocôndrias
* Cloroplastos
* Peroxissomos
* Centrossomos
149
Microbiologia Geral (MIG)
Assista ao Filme “Osmosis Jones – Uma aventura radical pelo corpo humano” e responda as
perguntas. Manuscrito e individual – entrega dia __________).
a) Frank:
b) Ozzy:
c) Drix:
d) Thrax:
e) Prefeito Catarroso:
2) Cite 3 erros e/ou maus hábitos de Frank referentes à higiene pessoal e hábitos alimentares que
contribuíram para que ele ficasse doente.
4) De que forma os mecanismos e recursos de que nosso corpo é dotado, reagem a entrada de
microrganismos estranhos em nosso organismo?
5) De que forma os mecanismos e recursos de que nosso corpo é dotado, reagem a medicamentos
que colocamos em nosso organismo?
7) Que conhecimentos você adquiriu assistindo ao filme que podem ser úteis para a sua vida?
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Microbiologia Geral (MIG) - LABORATÓRIO INFORMÁTICA
1) Acesse http://www.butantan.gov.br/home/museu_microbiologia.php#
Caso tenha tempo, assista a Aula 3: Vírus da AIDS e Vírus da Gripe, e a Aula 4: Vacinas e Soros: qual
a diferença?
http://www.butantan.gov.br/home/micro_cd_aula3.php
http://www.butantan.gov.br/home/micro_cd_aula4.php
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