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Copyright2004 by Maria Antonia Malajovich Texto atualizado em 2009

Edies BIBLIOTECA MAX FEFFER do INSTITUTO DE TECNOLOGIA ORT do Rio de Janeiro Rua Dona Mariana 213 Rio de Janeiro, 22280-020 RJ-Brasil Tel.:(5521) 2539-1842; FAX: (5521) 2286-9174

MARIA ANTONIA MALAJOVICH

BIOTECNOLOGIA PRIMEIRA PARTE: OS FUNDAMENTOS


SUMRIO
CAPTULO 1. O QUE BIOTECNOLOGIA?
A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL A BIOTECNOLOGIA MODERNA AS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIA O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO CRONOLOGIA DE ALGUNS ACONTECIMENTOS MARCANTES NA HISTRIA DA BIOTECNOLOGIA

Pg. 1

CAPTULO 2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS

A CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS Unidade estrutural Unidade funcional Relao entre as estruturas celulares e sua funo Tcnicas laboratoriais Toda clula deriva de outra preexistente OS CROMOSSOMOS A TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADE AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

Pg. 9

CAPTULO 3. OS MICRORGANISMOS
A DIVERSIDADE MICROBIANA As eubactrias As arqueas Os protistas Os fungos Os vrus, na fronteira do vivo e do no vivo AS TCNICAS MICROBIOLGICAS BIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADE OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

Pg. 21

CAPTULO 4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOS


AS PROTENAS Estrutura As bases de algumas tcnicas laboratoriais eletroforese, espectrometria de massa) AS ENZIMAS A catlise enzimtica Os diversos tipos de enzimas Importncia econmica OS ANTICORPOS A molcula de anticorpo A produo de anticorpos no organismo A produo de anticorpos no laboratrio A utilizao dos anticorpos (Cromatografia,

Pg. 31

CAPTULO 5. OS CIDOS NUCLEICOS E OS GENES


OS CIDOS NUCLEICOS

Pg. 43

A DUPLA HLICE
O CDIGO GENTICO A AO GNICA

A REGULAO DA AO GNICA Clulas procariticas Clulas eucariticas


A GENMICA O genoma humano A genmica brasileira

CAPTULO 6: OS PROCESSOS FERMENTATIVOS


OS PROCESSOS FERMENTATIVOS E A INDSTRIA OS MICRORGANISMOS INDUSTRIAIS Noes sobre o metabolismo As linhagens industriais A ESCOLHA DA MATRIA-PRIMA OS PROCESSOS TRADICIONAIS OS PROCESSOS SUBMERSOS Os fermentadores ou biorreatores A mudana de escala A conduo do processo A recuperao do produto

Pg. 53

OS BIOPROCESSOS NA INDSTRIA DE BIOFERTILIZANTES Pg. 63 CAPTULO 7: A CULTURA DE CLULAS E TECIDOS


A MICROPROPAGAO DE PLANTAS As etapas Os meios de cultura As diferentes modalidades Melhoramento econservao da biodiversidade vegetal A difuso da tecnologia A CULTURA DE CLULAS ANIMAIS A manipulao in vitro das clulas animais As aplicaes da cultura in vitro de clulas de mamferos

CAPTULO 8: A TECNOLOGIA DO DNA

AS FERRAMENTAS DISPONVEIS AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIO A ELETROFORESE DO DNA Hibridizao e sondas gnicas A tcnica de Southern O fingerprint A SNTESE E AMPLIFICAO DE DNA Sntese de oligonucleotdeos Sntese de cDNA A reao em cadeia da polimerase O SEQUENCIAMENTO DO DNA OS ARRAYS

Pg. 73

CAPTULO 9: A ENGENHARIA GENTICA


O NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA As primeiras experincias Mitos e realidades As bibliotecas de genes A CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Encontrar o gene Inserir o gene Identificar os microrganismos recombinantes A CONSTRUO DE PLANTAS TRANSGNICAS O transgene A transferncia dos genes a clulas vegetais O problema dos marcadores seletivos Do laboratrio ao campo CLULAS E ANIMAIS TRANSGNICOS

Pg. 83

O supermouse Os animais como modelos para a experimentao Os animais como biofbricas


O TAMBO FARMACUTICO ARGENTINO

BIBLIOGRAFIA

Pg. 99

CAPTULO 1. O QUE BIOTECNOLOGIA?


A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL
Cultivar vegetais, domesticar animais, transformar os alimentos ou aproveitar as propriedades curativas de algumas plantas so atividades que remontam alvorada da humanidade e se desenvolveram com base no conhecimento emprico, ignorando a existncia dos microrganismos ou das leis da hereditariedade. No incio do sculo XIX, a demanda de mo de obra por uma indstria incipiente estimula a migrao da populao do campo para a cidade. Em condies sanitrias cada vez mais degradadas, as doenas e a fome acompanham o homem. Ao mesmo tempo, o progresso exige processos industriais mais eficientes. A compreenso dos fenmenos naturais torna-se indispensvel para responder s necessidades da sociedade. A partir de 1850 surgem novas reas do conhecimento; nascem a Microbiologia, a Imunologia, a Bioqumica e a Gentica. A Qumica Industrial se desenvolve aceleradamente e, tambm, aumenta a interveno da Engenharia Agrcola e da Pecuria no gerenciamento do campo. Em 1914, Karl Ereky, um engenheiro agrcola hngaro, desenvolve um gigantesco plano de criao de sunos visando substituir as prticas tradicionais por uma indstria agrcola capitalista baseada no conhecimento cientfico. Deve-se a Ereky (1919) a primeira definio de biotecnologia, como a cincia e os mtodos que permitem a obteno de produtos a partir de matria-prima, mediante a interveno de organismos vivos. Para ele, a era bioqumica substituiria a era da pedra e do ferro. O sculo XX assiste a um desenvolvimento extraordinrio da cincia e da tecnologia (eletrnica, informtica). Da convergncia entre ambas resultam logros extraordinrios em vrios setores produtivos, onde os seres vivos constituem a base de itens to diversos como a produo de variedades vegetais mais produtivas, a fabricao de novos alimentos, o tratamento do lixo, a produo de enzimas e os antibiticos.

A BIOTECNOLOGIA MODERNA
A proposta de Watson e Crick (1953) de um modelo helicoidal para a molcula de DNA representa, sem dvida, um marco fundamental na histria da Biologia Molecular. Mas a divisria entre a Biotecnologia clssica e a Biotecnologia moderna uma srie de experincias realizadas por H. Boyer e S. Cohen que culmina em 1973 com a transferncia de um gene de sapo a uma bactria. A partir desse momento possvel mudar o programa gentico de um organismo transferindo-lhe genes de outra espcie. A importncia e os riscos inerentes nova tecnologia no passaram despercebidos para as pessoas envolvidas. Fato indito na histria, em 1975 os cientistas reunidos em Asilomar (USA) estabeleceram uma moratria em seus trabalhos at serem definidas as condies de segurana adequadas, o que aconteceu pouco tempo mais tarde. Na passagem de uma biotecnologia de laboratrio a uma biotecnologia industrial, a Engenharia Gentica ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora. Em alguns casos, como os da insulina e do hormnio do crescimento, a inovao consiste em substituir os mtodos de obteno tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonais ou do Golden Rice, um arroz com vitamina A, trata-se de produtos inteiramente novos. Entretanto, a manipulao gnica no a nica ferramenta disponvel. A Biotecnologia abrange hoje uma rea ampla do conhecimento que decorre da cincia bsica (biologia molecular, microbiologia, biologia celular, gentica etc.), da cincia aplicada (tcnicas imunolgicas e bioqumicas, assim como tcnicas decorrentes da fsica e da eletrnica), e de outras tecnologias (fermentaes, separaes, purificaes, informtica, robtica e controle de processos). Trata-se de uma rede complexa de conhecimentos onde cincia e tecnologia se entrelaam e complementam.

Copyright Maria Antonia Malajovich

Autora: Maria Antonia Malajovich

AS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIA
O impacto causado pelas primeiras experincias de Engenharia Gentica estimulou numerosas tentativas de redefinio do campo da Biotecnologia. Mediante a substituio da expresso interveno de organismos vivos por utilizao de processos celulares e moleculares tratou-se de diferenciar a Biotecnologia clssica da moderna. Porm, devido enorme difuso das tcnicas de manipulao gnica, elas acabam se superpondo, e, fora do contexto histrico, difcil distinguir o limite entre ambas. Por outro lado, como a definio de um setor de atividades depende dos interesses dos grupos envolvidos, muitas vezes reflete a viso dos setores profissionais predominantes. Por isso, se revisitarmos os textos da dcada de 1980, anos em que a expresso biotecnologia se expande, encontraremos mais de uma dzia de definies diferentes do termo. Levantamos, entre as definies encontradas com maior frequncia, as seguintes: OECD - Organisation for Economic Co-Operation and Development: A aplicao dos princpios da cincia e da engenharia no tratamento de matrias por agentes biolgicos na produo de bens e servios (1982). OTA Office of Technology Assessment: Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer tcnica que utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microrganismos para usos especficos (1984). EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioqumica, da microbiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, clulas cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indstria, na sade e nos processos relativos ao meio ambiente (1988). E.H. Houwink: o uso controlado da informao biolgica (1989). Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia "bio" + "tecnologia", isto o uso de processos biolgicos para resolver problemas ou fazer produtos teis (2003).

Observa-se que, com o tempo, o conceito ganha uma expresso mais simples. As definies mais recentes no fazem mais referncia aos processos tecnolgicos envolvidos; talvez porque, alm de complexos e diversos, estes evoluam muito rapidamente. Neste texto consideraremos a biotecnologia de uma maneira ampla, definida como uma atividade baseada em conhecimentos multidisciplinares, que utiliza agentes biolgicos para fazer produtos teis ou resolver problemas. Esta definio suficientemente abrangente para englobar atividades to variadas como as de engenheiros, qumicos, agrnomos, veterinrios, microbiologistas, bilogos, mdicos, advogados, empresrios, economistas etc.

Figura 1.1: O campo da Biotecnologia.

BIOTECNOLOGIA / Captulo 1: O que Biotecnologia?

O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA
J no se trata de promessas ou de perspectivas futuras; os produtos e processos biotecnolgicos fazem parte de nosso dia a dia, trazendo oportunidades de emprego e investimentos. Trata-se de plantas resistentes a doenas, plsticos biodegradveis, detergentes mais eficientes, biocombustveis, e tambm processos industriais menos poluentes, menor necessidade de pesticidas, biorremediao de poluentes, centenas de testes de diagnstico e de medicamentos novos. Tabela 1.1: Produtos e servios de origem biotecnolgica, em diferentes setores. SETORES ENERGIA INDSTRIA MEIO AMBIENTE AGRICULTURA TIPOS DE PRODUTOS OU SERVIOS Etanol, biogs e outros combustveis (a partir de biomassa). Butanol, acetona, glicerol, cidos, vitaminas etc. Numerosas enzimas para outras indstrias (txtil, de detergentes etc.). Recuperao de petrleo, biorremediao (tratamento de guas servidas e de lixo, eliminao de poluentes). Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenas, mudas de rvores para reflorestamento. Plantas com caractersticas novas incorporadas (transgnicas): maior valor nutritivo, resistncia a pragas e condies de cultivo adversas (seca, salinidade, etc.). Embries, animais com caractersticas novas (transgnicos), vacinas e medicamentos para uso veterinrio e humano. Panificao (pes e biscoitos), laticnios (queijos, iogurtes e outras bebidas lcteas), bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos diversos (shoyu, monoglutamato de sdio, adoantes etc.); protena de clula nica (PUC) para raes, alimentos de origem transgnica com propriedades novas. Antibiticos e medicamentos para diversas doenas, hormnios, vacinas, reagentes e testes para diagnstico, tratamentos novos etc.

PECURIA ALIMENTAO

SADE

BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO
Por se tratar de uma coleo de tecnologias diversas, o uso das biotecnologias no se restringe necessariamente aos pases desenvolvidos. Existe um espao que os pases emergentes podem ocupar, em funo de suas riquezas naturais, desde que existam prioridades econmicas e polticas definidas claramente. A condio fundamental contar com instituies competentes que formem uma massa crtica de pesquisadores e pessoal tcnico treinado. A China e a ndia contam hoje com uma indstria biotecnolgica avanada e diversificada. Assim como a Amrica Latina, onde esta se concentra principalmente na Argentina, no Brasil, no Chile, na Colmbia, em Cuba e no Mxico. Pases como Uruguai e Venezuela tambm tm atividade em algumas reas, assim como, em menor escala, Equador, Costa Rica, Paraguai, Peru e Bolvia. Na regio, umas 500 empresas incidem em vrios setores: meio ambiente e indstria, agroalimentos e pecuria, sade animal e humana. No entanto, a Biotecnologia suscita ainda opinies e sentimentos controversos. Enquanto alguns setores a percebem como uma tecnologia baseada em um slido conhecimento cientfico, para outros se trata de uma atividade antinatural e perigosa. O enfrentamento de partidrios e opositores ocorre com menos frequncia no terreno das razes que no das paixes, sejam elas polticas, religiosas ou ideolgicas. Ao discutir se a biotecnologia progressista ou reacionria, boa ou ruim, se esquece que o que caracteriza uma tecnologia o uso que fazemos dela.

Autora: Maria Antonia Malajovich

Produtos e processos inimaginveis trinta anos atrs entram em nosso cotidiano antes que os alicerces cientficos e tecnolgicos correspondentes se insiram em nossa cultura, atravs de uma divulgao ampla que atinja tambm o sistema educativo em todos os seus nveis. No existe possibilidade alguma de construir uma sociedade moderna se os seus integrantes ignorarem os aspectos mais gerais de cincia e tecnologia. O desconhecimento aumenta o risco de rejeitar tecnologias promissoras, capazes de abrir perspectivas novas, com vistas a um desenvolvimento sustentvel em reas to crticas como a sade, a produo de alimentos, a energia e o meio ambiente. A proposta deste livro revisar os fundamentos das biotecnologias e mostrar como esses se aplicam em diversos setores produtivos da sociedade, destacando como exemplos alguns empreendimentos latino-americanos bem sucedidos. Esperamos que ele seja de ajuda para todos os que nos preocupamos com os alcances desta fascinante (r)evoluo tecnolgica.

CRONOLOGIA DE ALGUNS ACONTECIMENTOS MARCANTES NA HISTRIA DA BIOTECNOLOGIA


DATA ACONTECIMENTOS FUNDAMENTAIS

ANTIGUIDADE

Preparao e conservao de alimentos e bebidas por fermentao (po, queijo, cerveja, vinho e vinagre); cultivo de plantas (batata, milho, cevada, trigo etc.); domesticao de animais; tratamento de infeces (com produtos de origem vegetal tais como p de crisntemo e derivados de soja com fungos).

IDADE MDIA Sculo XII IDADE MODERNA Sculo XVI Sculo XVII Sculo XVIII Cronistas registram a colheita de algas para alimentao, nos lagos de Mxico, pelos astecas. Incio da produo comercial de cerveja; extrao de metais por ao microbiana na Espanha; cultivo de fungos na Frana; Hooke descobre a existncia de clulas (1665). Invento da mquina a vapor (1752). Entre 1750 e 1850, aumenta o cultivo de leguminosas na Europa e se difunde a prtica de rotao de cultivos que aumenta a produtividade e melhora o uso da terra. Destilao do lcool.

IDADE CONTEMPORNEA 1797 1809 1835 a 1855 1863 a 1886 Jenner inocula uma criana com um vrus que o protege contra a varola. Appert utiliza o calor para esterilizar e conservar comida, processo que ser utilizado nas campanhas napolenicas. Schleiden, Schwann e Virchow enunciam a teoria celular. Pasteur inventa um processo para conservar alimentos sem alterar suas propriedades organolpticas (Pasteurizao, 1863), derruba a teoria da abiognese (1864), investiga as doenas do bicho-da-seda (1865), identifica a levedura como o agente responsvel pela fermentao alcolica (1876), usa microrganismos atenuados para obter vacinas contra o antraz e a clera (1881), faz os primeiros testes de uma vacina contra a raiva (1881). Paralelamente, Koch inicia o desenvolvimento de tcnicas fundamentais para o estudo dos microrganismos (1876), e enuncia quatro postulados sobre os agentes infecciosos como causa de doenas. Em 1865 Mendel apresenta o seu trabalho Experincias de hibridizao em plantas.

1887

Inaugurao em Paris do Instituto Pasteur.

BIOTECNOLOGIA / Captulo 1: O que Biotecnologia?

1892 1897 1899 1900 1905 1906 1910 1912 a 1914 1915 1916 1918 1919 1927 1928 1933 1936 1938 1940 a 1950 1944 1951 1953 1959 1960 1961 1962 1967 1968 1973

1975

1976

Descoberta do vrus do mosaico do tabaco; introduo do trator na agricultura. Bchner mostra que enzimas extradas da levedura podem transformar acar em lcool. Primeiro transplante de um rgo: o rim de um cachorro a outro cachorro. Redescobrimento das leis da hereditariedade, j enunciadas por Mendel em 1865, porm esquecidas. O primeiro transplante de crnea se realiza com sucesso; isto porque a crnea no tem antgenos. Ehrlich descobre o primeiro agente quimioterpico, chamado Salvarsan, que ser utilizado contra sfilis. Em Manchester, na Inglaterra, comeam a ser introduzidos os sistemas de purificao de esgoto baseados na atividade microbiana. Rhm obtm a patente de uma preparao enzimtica para a lavagem de roupas; Weizmann consegue a produo de acetona e butanol por microrganismos. Morgan publica Mechanism of Mendelian Heredity. Imobilizam-se as enzimas, uma tcnica que facilita sua utilizao em processos industriais. Morrem de gripe espanhola mais de vinte milhes de pessoas, um nmero de vtimas superior ao da Primeira Guerra Mundial. Constroemse biodigestores para a produo de metano (China e ndia). O engenheiro agrcola hngaro Ereky utiliza pela primeira vez a palavra biotecnologia. Muller descobre que os raios X causam mutaes. F. Griffith descobre a transformao, isto a transferncia de informao gentica de uma linhagem bacteriana a outra. Comercializao do milho hbrido, isto de sementes de um milho mais produtivo. Obteno de cido ctrico por fermentao. Na Frana, produo comercial de um biopesticida (Bacillus thuringiensis). Avanos na mecanizao do trabalho agrcola. Produo em grande escala da penicilina (descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida por Florey e Chain). Inseminao artificial de gado utilizando smen congelado. Descoberta da presena de genes saltatrios no milho por Brbara Mc Clintock. Watson e Crick propem um modelo da estrutura do ADN Reinart regenera plantas de cenoura a partir de uma cultura de clulas (calo). Aumento da produo de cido lctico, cido ctrico, acetona e butanol por via fermentativa. Descoberta do cdigo gentico. Desenvolvimento de uma protease alcalina para uso em sabes para a lavagem de roupas pela empresa dinamarquesa Novo. Plantio de novas variedades de trigo mais produtivas, no Mxico, dando incio ao que ser chamado de Revoluo Verde. Primeiro transplante de corao, na frica do Sul. O paciente sobrevive 18 dias. Produo industrial de aminocidos utilizando enzimas imobilizadas. Havendo desenvolvido tcnicas de corte e reunio do DNA, Cohen e Boyer transferem um gene a um organismo de outra espcie. Lanado no Brasil o programa de produo de lcool a partir de biomassa (Prlcool) Khler e Milstein desenvolvem a tecnologia de hibridomas e obtm anticorpos monoclonais. A empresa Novo produz xarope com alto contedo de frutose por via enzimtica como adoante alternativo sacarose. A Conferncia de Asilomar pede ao National Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas normas para a regulao dos experimentos com DNA-recombinante, o que acontecer meses mais tarde. Utilizao da tcnica de hibridizao molecular no diagnstico pr-natal da alfa talassemia.

Autora: Maria Antonia Malajovich

1978

1979 1980

1981 1982

1983

1984

1986

1987

1988

1989 1990

1992

Genentech, Inc., a primeira empresa biotecnolgica, fundada um ano antes por Boyer e Swanson, obtm a protena somatostatina (hormnio de crescimento) mediante a tecnologia do DNA-recombinante. Nasce na Inglaterra Louise Brown, o primeiro beb de proveta. Produo do hormnio de crescimento humano, utilizando a tecnologia do DNA-recombinante. A Suprema Corte de Justia dos Estados Unidos aprova o princpio de patentes para as formas de vida de origem recombinante. As primeiras patentes so de Chakrabarty, para um microrganismo para biorremediao de petrleo, e de Cohen e Boyer, pelo processo de 1973. Mullis inventa a tcnica da Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) cuja patente ser obtida por Cetus, Inc. em 1985 e vendida em 1991 a Hoffman-LaRoche, Inc. por 300 milhes de dlares. Obteno da primeira planta geneticamente modificada. Obteno da primeira linhagem de clulas-tronco de camundongo. A insulina humana de origem recombinante da Genentech, Inc. comercializada. Uma licena ser obtida mais tarde pela empresa Ely Lilly, que a vender com o nome de Humulina. A primeira vacina de DNA-recombinante para o gado comercializada na Europa. Realizam-se as primeiras experincias de Engenharia Gentica em plantas (petnia). Syntex Corporation recebe a aprovao da Food and Drug Administration (FDA) de um teste para Chlamydia trachomatis baseado na utilizao de anticorpos monoclonais. Isolado o vrus HIV no Instituto Pasteur (Frana) e no NIH (National Institute of Health, Estados Unidos). Jeffrey introduz a tcnica do Fingerprint (impresses digitais), que, um ano depois, ser utilizada pelos tribunais para a identificao de suspeitos. Clonagem e sequenciamento do genoma do HIV pela empresa Chiron Corp. A Environmental Protection Agency (EPA) dos Estados Unidos aprova a liberao de plantas de tabaco transgnicas. Um grupo de especialistas em segurana em Biotecnologia da Organizao para a Cooperao Econmica e o Desenvolvimento (OECD) declara que a previsibilidade das mudanas genticas obtidas por Engenharia Gentica frequentemente maior que a correspondente s tcnicas tradicionais, e que os riscos associados com organismos transgnicos podem ser avaliados do mesmo modo que os riscos associados aos outros organismos. Aprovada a primeira vacina biotecnolgica para uso humano, trata-se de Recombivax-HB, contra a hepatite B. Advanced Genetic Sciences libera em campo bactrias DNArecombinante (Frostban) que inibem a formao de gelo nos cultivos de morango, na Califrnia; a FDA aprova o fator ativador de plasminognio, obtido por engenharia gentica, para o tratamento de ataques cardacos. A Universidade de Harvard obtm a patente de um rato transgnico desenvolvido especialmente para o estudo do cncer; na mesma dcada, os europeus obtero a patente de outro rato transgnico, sensvel a substncias carcinognicas. Genencor International Inc. obtm a patente de um processo que permite obter enzimas (proteases) resistentes a alvejantes (processo bleach) para a fabricao de sabes para a lavagem de roupa. Com a criao do National Center for Human Genome Research se inicia o mapeamento do genoma humano. Primeira experincia de terapia gnica para uma doena rara (ADA) em uma menina de quatro anos. Pfizer comercializa Chy-Max TM, uma enzima de origem recombinante para a preparao de queijos. GenPharm International, Inc. consegue uma vaca transgnica que produz no leite protenas humanas para alimentao infantil. A Universidade da Califrnia (UCSF) e a Universidade de Stanford contabilizam 100 patentes relativas ao DNA-recombinante. Uma tcnica, elaborada por cientistas americanos e britnicos, permite testar anormalidades como a fibrose cstica e a hemofilia em embries in vitro. A FDA declara que os alimentos de origem transgnica no demandam uma regulao especial.

BIOTECNOLOGIA / Captulo 1: O que Biotecnologia?

1993 1994 1995 1996 1997 1998

1999 2000

2001

2002

2003 2004

2005 2006

2007 2008

2009

Aprovada a utilizao do hormnio de crescimento bovino rBGH/rBST, produzido por Monsanto Co., para aumentar da produo de leite. Lanamento no mercado do tomate FlavSavr, que, devido inativao de um gene, amadurece na planta. Decifrado o primeiro genoma de uma bactria, Haemophilus influenzae. Sequenciado o primeiro genoma de um organismo eucarionte, a levedura Saccharomyces cerevisiae. Desenvolve-se o primeiro GeneChip (Stanford, Affymetrix). Nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses mais tarde, uma segunda ovelha, Polly, clonada e geneticamente modificada. Os cultivos transgnicos so introduzidos em vrios pases. Contabilizam-se mais de 1.500 empresas de Biotecnologia nos Estados Unidos e mais de 3.000 no mundo. Clulas-tronco embrionrias so utilizadas para regenerar tecidos. Sequenciamento do primeiro genoma animal, o verme Caenorrabditis elegans. Isolada a primeira linhagem de clulas-tronco embrionrias humanas. Sequenciamento do primeiro cromossomo humano. Pesquisadores descobrem que as clulas-tronco podem ser induzidas a se diferenciar em diversos tipos celulares. O rascunho do sequenciamento do genoma humano anunciado simultaneamente por Collins, do Consrcio do Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc. Sequenciados tambm o genoma da mosca Drosophila melanogaster, o primeiro genoma de uma planta (Arabidopsis thaliana) e, no Brasil, o de uma bactria que ataca os ctricos (Xylella fastidiosa). O rascunho do sequenciamento do Genoma Humano publicado simultaneamente nas revistas Science e Nature. Sequenciamento do genoma de plantas de interesse agronmico para os pases em desenvolvimento (arroz, banana). Sequenciamento do genoma de bactrias de importncia agronmica. Obteno de clulas sanguneas a partir de clulas-tronco embrionrias. Completados o rascunho do proteoma funcional da levedura e o sequenciamento do genoma do agente e do vetor transmissor da malria. Identificam-se mais de 200 genes envolvidos na diferenciao das clulas-tronco. Descoberta da participao de molculas de RNA na regulao de vrios processos celulares. Em diversos pases inicia-se a utilizao de clulas-tronco adultas para o tratamento experimental de diversas doenas (leucemia, mal de Chagas, diabetes e anemia falciforme). A venda, como mascote, do GloFish, um peixe transgnico que brilha na escurido, originalmente criado para detectar poluentes. Clonagem de vrios tipos de animais e de espcies ameaadas de extino. Sequenciado o genoma do frango. Um grupo de pesquisadores coreanos anuncia a obteno de uma linhagem de clulas-tronco embrionrias pluripotentes, aps uma transferncia nuclear; descobrindo-se mais tarde que este resultado era uma fraude. Novos medicamentos e testes de diagnsticos entram no mercado. A Alemanha aprova os primeiros cultivos de plantas transgnicas. Publicado o genoma da vaca. Obteno de clulas-tronco a partir de clulas da pele. Videiras geneticamente modificadas so testadas na frica do Sul. O grupo de pesquisadores liderado por S. Yamanaka consegue induzir a pluripotencialidade celular introduzindo, mediante um vetor viral, quatro genes em clulas somticas murinas. As autoridades europeias de segurana alimentar concluem que os genes marcadores de resistncia aos antibiticos no apresentam riscos relevantes para a sade humana ou animal nem para o meio ambiente. Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul, geneticamente modificada. Cultivam-se plantas transgnicas em 25 pases, includos sete da Unio Europeia. Yamanaka anuncia a obteno de clulas pluripotentes induzidas utilizando um plasmdeo como vetor. Pesquisadores canadenses e britnicos conseguem reprogramar clulas da pele, murinas e humanas, utilizando um transposon como vetor de um pacote de quatro genes.

Autora: Maria Antonia Malajovich

CAPTULO 2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS


A CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS
UNIDADE ESTRUTURAL
A clula a unidade estrutural dos seres vivos. Trate-se de bactrias, amebas, espermatozoides ou neurnios, todas as clulas so formadas por gua, ons inorgnicos e molculas orgnicas (protenas, carboidratos, lipdios e cidos nucleicos). E todas elas apresentam uma membrana plasmtica que separa o citoplasma do meio externo e permite o intercmbio de molculas entre ambos. As clulas procariticas se encontram exclusivamente no Reino Monera. Pequenas (0,001 a 0,005 mm) e com requerimentos nutricionais simples, estas clulas se multiplicam rapidamente. A informao gentica se encontra em um cromossomo circular formado por uma molcula de DNA e associado a uma invaginao da membrana plasmtica (mesossomo); pequenas molculas circulares adicionais (plasmdeos) podem tambm estar presentes. Numerosos ribossomos asseguram a sntese proteica (Figura 2.1). Bem mais complexa a estrutura das clulas eucariticas, presentes nos quatro Reinos restantes (Protista, Fungo, Planta e Animal). Com um tamanho variando entre 0,01 e 0,10 mm, estas clulas so dez vezes maiores que as procariticas. A presena de compartimentos diferenciados, ou organelas, que cumprem atividades especficas, resulta em uma subdiviso do trabalho que garante a eficincia do funcionamento celular (Figura 2.2). Figura 2.1: Representao esquemtica de uma clula procaritica.

O citoplasma percorrido por um sistema de membranas, o retculo endoplasmtico, que est associado aos ribossomos e, por conseguinte, sntese de protenas. Processados no aparelho de Golgi, os produtos celulares so secretados ou distribudos em outras estruturas (lisossomos, membrana celular). O metabolismo energtico est associado a organelas citoplasmticas, complexas e rodeadas de membranas (mitocndrias, cloroplastos e peroxissomos). Um citoesqueleto, formado por tbulos e filamentos proteicos, mantm a forma da clula, alm de assegurar o transporte interno das organelas e os movimentos celulares.

Copyright Maria Antonia Malajovich

Autora: Maria Antonia Malajovich

A informao gentica est distribuda em cromossomos, cada um deles formado por uma molcula linear de DNA associada a protenas. Os cromossomos e o nuclolo se encontram no ncleo, que funciona como um centro de controle celular. A membrana nuclear, um envoltrio com poros que separa o ncleo do citoplasma, permite o intercmbio de substncias entre ambos. Apesar de ter uma organizao muito parecida, as clulas animais diferem das clulas vegetais em alguns aspectos. Nas clulas vegetais encontramos uma parede celular ao redor da membrana plasmtica; o citoplasma contm cloroplastos, onde ocorre a fotossntese, e grandes vacolos, onde se armazenam substncias e degradam macromolculas. Nenhuma dessas estruturas se observa nas clulas animais; estas tm um centrolo que falta nas clulas vegetais. Figura 2.2: Representaes esquemticas da estrutura celular eucaritica, animal e vegetal.

Clula animal

Clula vegetal

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 2: As clulas e os cromossomos

UNIDADE FUNCIONAL
A clula tambm a unidade funcional de um organismo. O citoplasma uma soluo viscosa onde continuamente ocorrem reaes de sntese e degradao de substncias, consumindo ou liberando energia. Estas reaes constituem o que denominamos metabolismo. As reaes metablicas so facilitadas por protenas com atividade cataltica, denominadas enzimas. Assim como as protenas estruturais, as enzimas se sintetizam nos ribossomos, que so organelas citoplasmticas pequenas no membranosas. A estrutura das protenas depende da informao gentica codificada no cido desoxirribonucleico (DNA) e transcrita no cido ribonucleico (RNA), que a leva do ncleo at o citoplasma. As semelhanas de estrutura e funcionamento celulares decorrem de uma origem evolutiva comum, aproximadamente 3,8 milhes de anos atrs. Os dois tipos celulares que reconhecemos hoje, as clulas procariticas e as eucariticas, apareceram entre um e um milho e meio de anos mais tarde.

RELAO ENTRE AS ESTRUTURAS CELULARES E SUA FUNO


Tabela 2.1: A funo e a distribuio das estruturas celulares.
ESTRUTURA PAREDE CELULAR MEMBRANA PLASMTICA FUNO Manuteno da forma e proteo da clula. Manuteno da estabilidade do meio intracelular; controle das trocas entre a clula e o meio extracelular. Controle do fluxo de substncias entre o ncleo e o citoplasma. Controle da estrutura e do funcionamento celular. Formao de ribossomos. Formao de clios e flagelos; participao na diviso celular. Sntese de protenas. Sntese de protenas. Sntese de lipdios; armazenamento e inativao de substncias. Secreo celular. Digesto intracelular. Equilbrio osmtico e armazenamento. Respirao celular aerbia. Fotossntese. Manuteno da forma celular; contrao; ancoragem de organelas. Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Presente Presente Presente Ausente CLULA BACTERIANA Presente ou ausente CLULA ANIMAL Ausente Presente CLULA VEGETAL Presente

CARIOTECA ou MEMBRANA NUCLEAR CROMOSSOMO(S) NUCLOLO(S) CENTROLOS

Presente

nico e circular; apenas DNA. Ausente Ausente

Mltiplos e lineares; ADN e protenas. Presente Presente Ausente

RIBOSSOMOS RETCULO ENDOPLASMTICO RUGOSO RETCULO ENDOPLASMTICO LISO

Presente

Ausente

Presente

COMPLEXO DE GOLGI LISOSSOMOS VACOLO CENTRAL MITOCNDRIAS CLOROPLASTOS CITOESQUELETO

Presente

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TCNICAS LABORATORIAIS
O estudo das clulas se v facilitado por um conjunto de tcnicas laboratoriais, tais como: Tcnicas microscpicas que permitem uma visualizao detalhada da clula: Microscopia ptica, que se utiliza para observar os cortes de tecidos. Geralmente, estes so fixados (lcool, cido actico, formaldedo) e tingidos com corantes que reagem com as protenas ou com os cidos nucleicos, aumentando o contraste da imagem. Microscopia de contraste de fase, que transforma as diferenas de espessura ou de densidade do fragmento observado em diferenas de contraste. Microscopia fluorescente, que associa anticorpos especficos a um reagente como o PVF (protena verde fluorescente de medusa), de forma a marcar as molculas e visualizar sua distribuio nas clulas. Microscopia confocal, que combina a microscopia fluorescente com a anlise eletrnica da imagem, fornecendo uma imagem tridimensional. Microscopia eletrnica, que permite a observao em um plano de cortes tingidos com sais de metais pesados (microscopia de transmisso) e a observao tridimensional de clulas (microscopia de varredura). Microscopia de tunelamento, com os diversos tipos de microscpios de varredura por sonda (SPM, do ingls scanning probe microscope) que, alm de fornecer uma imagem de molculas e tomos, permitem medies e a manipulao de molculas e tomos.

Tcnicas fsicas como a centrifugao diferencial (ultracentrifugao, centrifugao em gradiente) para separar os componentes celulares para estudos bioqumicos posteriores. Tcnicas instrumentais que possibilitam a contagem de clulas e a separao de populaes celulares (cell sorter) ou de cromossomos (flow sorter). Tcnicas de cultura de clulas com objetivos diversos.

TODA CLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTE


Assim como uma planta se forma a partir de outra planta e um animal de outro animal, toda clula deriva de outra preexistente. Este conceito, enunciado por R. Virchow em 1855, no foi plenamente aceito at dez anos mais tarde, quando L. Pasteur mostrou experimentalmente que a proliferao de microrganismos em um meio orgnico estril se deve contaminao deste com os microrganismos presentes no ar, que, ao encontrar um meio propcio, se multiplicam rapidamente. Todo organismo multicelular se forma a partir da multiplicao de uma nica clula-ovo ou zigoto. As contribuies dos genes maternos e paternos para o desenvolvimento do embrio no so idnticas (imprinting). As clulas embrionrias se diferenciam, formando mais de 200 tipos de clulas em animais, e um pouco menos nos vegetais. Os diferentes tipos celulares cumprem funes especficas que, integradas, asseguram a unidade do organismo. Nos vegetais, a persistncia de tecidos embrionrios totipotentes (meristemas) na planta adulta permite o crescimento e a regenerao durante a vida toda do organismo. Em condies apropriadas, clulas especializadas podem reverter a um estado no diferenciado e regenerar um organismo completo e diferenciado. Nessas propriedades se fundamenta a propagao de plantas in vitro. Nos animais superiores, a totipotncia se restringe s clulas do embrio com menos de quatro dias, que so as nicas capazes de regenerar um organismo inteiro. No entanto, no embrio de mais de quatro dias, algumas clulas internas do blastcito (clulas-tronco embrionrias) podem originar todos os tecidos do organismo, sendo consideradas pluripotentes (Figura 2.3).

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Figura 2.3: As clulas-tronco embrionrias.


As clulas-tronco podem ser extradas do blastcito com 5 a 7 dias e cultivadas in vitro; colocadas em condies experimentais adequadas, diferenciam-se nos distintos tipos celulares.

Tambm tecidos adultos (medula ssea, sangue, crnea e retina, polpa dentria, fgado, pele, trato digestivo e pncreas) apresentam clulas-tronco. Elas podem permanecer nos tecidos, multiplicando-se durante longos perodos de tempo sem que ocorra a diferenciao. No entanto, em determinadas condies fisiolgicas, estas clulas-tronco adultas originam clulas especializadas de vrios tipos, assegurando a manuteno e o reparo do tecido onde se encontram. Um nico tipo de clula-tronco multipotente da medula ssea, por exemplo, gera todas as clulas sanguneas (hemcias, leuccitos e plaquetas). Clulas-tronco unipotentes se diferenciam em uma nica linhagem celular como, por exemplo, os queratincitos da pele. Por ser mais fceis de conseguir, as clulas-tronco adultas encontraram rapidamente aplicaes teraputicas promissoras. No aconteceu o mesmo com as clulas-tronco embrionrias. Estas podem ser obtidas seja a partir de um embrio, obtido por transferncia de um ncleo a um ovcito anucleado, seja a partir dos embries supernumerrios congelados nas clnicas de fertilizao assistida. Os dois mtodos suscitaram grandes debates ticos em torno de quem forneceria os ovcitos e do status do embrio. A polmica deveria esmorecer com o desenvolvimento de uma tecnologia que permite obter, a partir de clulas somticas, a obteno de clulas iPS (do ingls, induced pluripotent stem cells) com propriedades equivalentes s das clulas-tronco embrionrias. A induo de pluripotencialidade mediante a insero de alguns genes em clulas adultas um passo importante para acabar com a necessidade de dispor de embries congelados. Entender os mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciao celular um dos maiores desafios atuais, porque as clulas-tronco possibilitaro novos tratamentos de regenerao celular para doenas cardacas, diabetes e doena de Parkinson. A tecnologia de reprogramao celular se desenvolve rapidamente, aumentando nosso conhecimento sobre o controle gentico da diferenciao e abrindo uma nova senda para a implementao de testes, medicamentos e tratamentos novos.

OS CROMOSSOMOS
Cada cromossomo est formado por um filamento de DNA enrolado, a espaos regulares, sobre protenas (histonas). Durante a maior parte do ciclo celular, os cromossomos se encontram distendidos, formando uma rede de filamentos finos (cromatina). Na diviso celular, a cromatina se condensa, possibilitando a observao microscpica dos cromossomos. Do ponto de vista morfolgico, estes se caracterizam pelo tamanho e a posio do centrmero, uma constrio que divide o cromossomo em dois braos.

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O nmero de cromossomos n constante em todos os indivduos de uma mesma espcie; n = 4 em Drosophila melanogaster e n = 23 no homem, por exemplo. Como nas clulas somticas os cromossomos se encontram sempre em pares, na espcie humana o nmero de cromossomos (2n) de 46, sendo que um par determina o sexo. Os cromossomos sexuais so idnticos na mulher (46, XX) e diferentes no homem (46, XY). Em outras espcies, a determinao do sexo segue mecanismos diversos. Um pouco antes da diviso de uma clula, os cromossomos se duplicam, de maneira que cada uma das clulas filhas recebe 2n cromossomos. A mitose mantm constante o nmero de cromossomos nas clulas somticas dos indivduos de uma mesma espcie. J nas clulas reprodutivas, a meiose reduz a n o nmero de cromossomos; na fecundao, a fuso dos gametas ir restaurar o nmero n caracterstico da espcie. Durante a meiose, o entrecruzamento dos cromossomos permite a permuta e recombinao dos genes (Figura 2.4). Durante a formao dos gametas, erros na disjuno dos cromossomos podem dar origem a indivduos com frmulas cromossmicas alteradas. Na sndrome de Down, por exemplo, a pessoa apresenta geralmente um cromossomo 21 adicional. (mulheres 47, XX + 21; homens 47, XY + 21). Estima-se que a percentagem de recm-nascidos com alguma anomalia cromossmica estaria em torno de 0,85%, dos quais 0,65% apresentariam algum sintoma. Alteraes cromossmicas tambm podem ser relacionadas com alguns tipos de cncer. Na leucemia mieloide crnica, por exemplo, se observa a translocao recproca de dois pedaos dos cromossomos 9 e 22. De um modo geral, frequente encontrar alteraes no nmero de cromossomos das clulas cancerosas. Figura 2.4: Mitose e meiose.
Durante a meiose, a permuta de fragmentos cromossmicos homlogos possibilita a recombinao dos genes.

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A TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADE


Em 1865, Gregor Mendel apresentou seu trabalho Experincias de hibridizao em plantas; este reunia os resultados experimentais realizados com ervilhas (Pisum sativum), durante sete anos, no jardim do monastrio Agostino de Brno (Morvia). Apesar de passar quase despercebido, o trabalho acabou sendo distribudo por vrias bibliotecas da Europa e Amrica, graas a sua publicao um ano mais tarde nos Anais da Sociedade de Histria Natural. No texto figuram algumas generalizaes. Conhecida como Primeira Lei de Mendel, Lei de Segregao ou Monoibridismo, a primeira delas se refere segregao dos fatores (alelos) de um par (um gene) na formao de gametas. A segunda, que conhecida como Segunda Lei de Mendel, Lei de Segregao Independente ou Diibridismo, se refere segregao dos fatores (alelos) de dois ou mais pares (dois ou mais genes) independentes na formao de gametas. Em 1900, depois de chegar de maneira independente a concluses semelhantes, os pesquisadores K. Correns, E. Von Tschermak e H.de Vries redescobriram nas bibliotecas o trabalho de Mendel. Nesse intervalo de 35 anos tinha sido descrita a diviso celular (mitose, 1875; meiose, 1890); o prximo passo correspondeu a Sutton e Boveri (1902), sugerindo que os fatores hereditrios de Mendel estariam nos cromossomos. A confirmao desta hiptese decorreu dos trabalhos de T.H.Morgan e sua brilhante equipe na Universidade de Columbia (Nova York), com a mosca da fruta, Drosophila melanogaster (Figura 2.5). Figura 2.5: Drosophila melanogaster, a mosca do vinagre.

Em 1910, depois de uma srie de cruzamentos e de anlises estatsticas, Morgan mostrou que a herana da cor branca do olho do mutante white est associada transmisso do cromossomo X, que determina o sexo. Morgan e seus colaboradores identificaram numerosos outros mutantes de Drosophila melanogaster com um padro mendeliano de hereditariedade (Figura 2.4). Alm de moscas com olhos brancos em vez de vermelhos, encontraram outras com asas curtas em vez de longas, com corpo de cor marrom ou preta em vez de amarela etc. Os genes correspondentes se classificam em quatro grupos de ligao, sendo que cada um deles est associado a um dos quatro pares de cromossomos da Drosophila. Como durante a meiose se produzem permutas entre segmentos cromossmicos, nos cruzamentos aparecem indivduos recombinantes, isto , com outras combinaes gnicas diferentes das previstas pelas leis mendelianas. A partir dos dados obtidos em milhares de cruzamentos sobre a recombinao dos genes de um mesmo grupo de ligao chega-se a estabelecer a distncia gentica entre estes. Com a descoberta de clulas com cromossomos gigantes (politnicos) nas glndulas salivares das larvas de Drosophila, comearam os primeiros trabalhos de mapeamento, associando os dados genticos aos dados fsicos. A observao microscpica das bandas nos cromossomos mostrou com enorme riqueza de detalhes uma sucesso consistente de bandas largas e estreitas. Da associao entre os mtodos genticos e os mtodos citolgicos surgiram os primeiros mapas fsicos, associando uma regio cromossmica a cada gene.

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Das descobertas de Morgan e sua equipe, nasce a Teoria do Gene, segundo a qual: Os caracteres de um indivduo correspondem a elementos pares, os genes. Os genes esto ligados uns aos outros nos cromossomos, formando um determinado nmero de grupos de ligao. Os genes de cada par se separam durante a gametognese, de acordo com a Primeira Lei de Mendel e, em consequncia, cada gameta fica contendo apenas um conjunto de genes (Figura 2.5). Os genes pertencentes a grupos de ligao diferentes segregam independentemente, de acordo com a Segunda Lei de Mendel (Figura 2.6). Entre os elementos pertencentes a cada grupo de ligao, ocorre uma troca ordenada chamada permuta ou crossing-over, que leva recombinao dos genes (Figura 2.4). A frequncia da permuta fornece a prova da linearidade dos genes em cada grupo de ligao e permite determinar sua posio relativa.

Figura 2.5: Monoibridismo.


A cor do corpo da Drosophila depende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e = corpo preto ou ebony, e+= corpo amarelo). O cruzamento entre duas linhagens puras de moscas que diferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) gera, na primeira gerao (F1), moscas de corpo amarelo, mostrando a recessividade do alelo e. Do cruzamento entre indivduos da F1 nasce uma segunda gerao (F2) com uma proporo fenotpica de 3 moscas amarelas: 1 mosca preta. Esta proporo decorre da segregao dos alelos de um gene, na formao de gametas.

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Figura 2.6: Diibridismo.


A cor do corpo da Drosophila depende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e = corpo preto ou ebony; e+= corpo amarelo). A presena ou ausncia de olhos depende de um gene, localizado no cromossomo IV, com dois alelos (ey = sem olhos, ey += com olhos). O cruzamento entre duas linhagens puras de moscas que diferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) e a presena ou ausncia de olhos gera, na primeira gerao (F1), moscas com olhos e de corpo amarelo, mostrando a recessividade dos alelos ey e e. Do cruzamento entre moscas da F1 nasce uma segunda gerao (F2) com uma proporo fenotpica de 9 moscas amarelas com olhos: 3 moscas amarelas sem olhos, 3 moscas pretas com olhos: 1 mosca preta sem olhos. Esta proporo decorre da segregao independente dos alelos dos genes localizados em diferentes cromossomos homlogos na formao de gametas.

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Os estudos posteriores mostraram a complexidade dos padres de hereditariedade, que incluem casos de: Alelismo mltiplo, quando um gene admite mltiplos alelos; dominantes, recessivos ou codominantes (Sistema ABO, por exemplo). Pleiotropia, quando um gene determina diversos caracteres (pelagem e sobrevivncia em ratos, por exemplo). Herana polignica, quando um carter est determinado por vrios genes de efeito cumulativo (altura, cor dos olhos). Interao gnica, quando uma caracterstica depende da ao de muitos genes.

Finalmente, deve-se destacar que o fentipo de um indivduo o resultado da interao entre o gentipo e o ambiente em que este se expressa.

CLULAS E CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOS


Um dos testes pioneiros de diagnstico gentico est baseado na observao microscpica dos cromossomos de clulas somticas durante a diviso celular (mitose). A identificao se v facilitada pela presena de regies ou bandas reveladas mediante algumas tcnicas de colorao. O nmero e a estrutura dos cromossomos so analisados e apresentados em um arranjo (caritipo) que segue uma classificao convencional (Figura 2.7). Figura 2.7: Representao dos cromossomos humanos.
O arranjo segue uma classificao convencional que leva em conta o tamanho, a posio do centrmero (tracejado no esquema) e o padro das bandas de cada cromossomo. Fonte: http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/data/502/karyotype.png

Os testes de diagnstico gentico envolvendo a anlise de caritipos esto amplamente difundidos na prtica mdica, sendo facilitados atualmente pela utilizao de corantes especficos para cada par cromossmico. Como agentes biolgicos, as clulas encontram outras aplicaes (Tabela 2.2). Clulas vegetais cultivadas in vitro produzem substncias de alto valor agregado, importantes para as indstrias alimentar, cosmtica e farmacutica. Tambm se utilizam para regenerar plantas. A multiplicao de vrus em cultivos de clulas de insetos permite a comercializao de prticas de controle biolgico.

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A sntese de algumas substncias importantes para a indstria farmacutica, como o fator ativador de plasminognio, depende do cultivo in vitro de clulas animais. Estas tambm substituem os animais nos testes toxicolgicos e so utilizadas na multiplicao de vrus para a preparao de vacinas. Tambm possibilitam a produo de anticorpos. Combinando as tcnicas de cultivo celular com o desenvolvimento de materiais biolgicos semelhantes ao colgeno, uma rea nova de engenharia de tecidos visa a reparao ou substituio de tecidos lesionados. Os enxertos de pele artificial, cultivada in vitro, saram ferimentos e/ou queimaduras em seres humanos.

Tabela 2.2: As clulas como agentes biolgicos.

Vegetais CLULAS Animais e/ou humanas

Indstria alimentar e cosmtica (Adoantes, corantes, flavorizantes e aromatizantes) Indstria farmacutica (Alcaloides e esteroides) Estudos toxicolgicos Diagnstico clnico Indstria farmacutica (Produo de anticorpos, soros e vacinas) Medicina regenerativa (Produo de tecidos de substituio)

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CAPTULO 3. OS MICRORGANISMOS

A DIVERSIDADE MICROBIANA
O termo microrganismos se aplica a um grupo heterogneo de seres que vivem como clulas independentes ou como agregados celulares: bactrias, arqueas, protozorios, algas e fungos e, tambm, vrus. Salvo estes ltimos, que esto na fronteira entre o vivo e o no vivo, os encontramos dentro dos trs domnios em que se classificam os seres vivos: Bacteria, Archaea e Eukarya (Tabela 3.1). Os microrganismos mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida. Alguns so procariontes, como as bactrias; outros eucariontes, como os protozorios, as algas e os fungos. Os aerbios crescem se houver oxignio, os anaerbios se no o houver. Formas livres colonizam todos os ambientes terrestres, desde o cume das montanhas at as profundidades dos oceanos. Mas h tambm parasitas que crescem custa de outros seres vivos, onde encontram abrigo e alimento, e os que mostram diversos graus de dependncia de outros seres vivos. Os auttrofos sintetizam seus alimentos a partir de dixido de carbono; os fotossintticos utilizam a luz como fonte de energia e os quimiossintticos, algumas reaes qumicas inorgnicas. Os hetertrofos dependem das molculas orgnicas elaboradas pelos auttrofos, que absorvem ou ingerem. O fato de mant-los agrupados sob a denominao de microrganismos talvez obedea menos a uma questo de semelhana que a razes prticas; j que os mesmos mtodos bsicos de estudo (isolamento, cultura in vitro, identificao) podem ser aplicados, com pequenas variaes, a esses grupos. Tabela 3.1: Os microrganismos dentro do marco da uma classificao biolgica atual.
DOMNIO REINO TIPO DE CLULA ESTRUTURA CELULAR BACTERIA EUBACTERIA Procaritica Parede celular com peptidoglicano ARCHAEA ARCHAEBACTERIA Procaritica Parede celular sem peptidoglicano PROTISTA Eucaritica Parede celular de celulose, em alguns; cloroplastos, em alguns Uni ou pluricelular Autotrfica ou Heterotrfica Protozorios e Algas FUNGI Eucaritica Parede celular de quitina EUKARYA PLANTAE Eucaritica Parede celular de celulose; cloroplastos ANIMALIA Eucaritica Sem parede celular nem cloroplastos

ORGANIZAO NUTRIO

Unicelular Autotrfica (*) ou Heterotrfica (**) Eubactrias

Unicelular Autotrfica (*) ou Heterotrfica (**)

Uni ou pluricelular Heterotrfica (absoro)***

Pluricelular Autotrfica

Pluricelular Heterotrfica (ingesto)***

EXEMPLOS

Arqueas

Leveduras, Mofos, Bolores e Cogumelos.

Brifitas (musgos), Pteridfitas (samambaias), Gimnospermas e Angiospermas.

Invertebrados e Cordados

* Nutrio autotrfica: o organismo produz seu prprio alimento a partir de substncias inorgnicas e de uma fonte de energia. Os seres autotrficos podem realizar fotossntese (para a qual a fonte de energia a luz solar) ou quimiossntese (para a qual a fonte de energia uma reao qumica exotrmica). **Nutrio heterotrfica: o organismo se alimenta de molculas orgnicas elaboradas por outros seres vivos por absoro (captao de nutrientes dissolvidos na gua), ou ingesto (entrada de partculas de alimentos no dissolvidas). *** A absoro permite a captao de nutrientes dissolvidos na gua; a ingesto se refere s partculas de alimentos no dissolvidas.

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AS EUBACTRIAS
As eubactrias ou bactrias so organismos unicelulares procariticos em que uma parede celular pode cumprir uma funo protetora. Alm do DNA cromossmico, podem apresentar molculas circulares extras de DNA denominadas plasmdeos. Em condies favorveis de umidade, acidez e temperatura, as bactrias se multiplicam rapidamente por fisso celular produzindo milhes de clulas em poucas horas (Figura 3.1). Em uma de suas acepes, a palavra clone se aplica s clulas que derivam de uma nica clula Algumas espcies bacterianas tambm mantm formas de reproduo sexuada, possibilitando a recombinao do material gentico.

Figura 3.1: Bactrias e clones. Por diviso binria de uma bactria gera-se um clone de bactrias semelhantes.

As eubactrias formam um grupo com mais de 5.000 espcies conhecidas. Pequenas (0,0005-0,005 mm) e de formas diversas (esfricas, bastonetes, helicoidais), elas podem ser encontradas isoladas ou em pares, cadeias ou agregados. Algumas se locomovem livremente, mediante um ou mais flagelos distribudos na superfcie celular, outras se aderem mediante pelos ou fmbrias a um organismo hospedeiro. O grupo inclui tambm as cianobactrias, que sero comentadas mais adiante junto com as algas. Em condies desfavorveis, algumas bactrias formam esporos que resistem em forma latente at que a situao mude, germinando e retomando sua atividade fisiolgica. Um exemplo interessante, na Europa do sculo XIX, o da existncia de campos malditos, campos em que as ovelhas no deviam transitar, devido ao alto risco de contrair o carbnculo ou antraz. De fato, os bacilos presentes nos animais vitimados pela doena e enterrados nesses campos formavam esporos que, trazidos superfcie pelas minhocas, contaminavam as pastagens. Uma tcnica laboratorial (colorao de Gram) permite diferenciar as bactrias pela estrutura da parede celular. Entre as Gram-positivas, cuja parede celular mais simples, encontramos gneros como Clostridium, Bacillus, Mycobacterium (com algumas espcies que causam a tuberculose e a lepra) e os Actinomicetes, como Streptomyces, produtora de antibiticos como a estreptomicina. Entre as Gram-negativas, encontramos os micoplasmas, Escherichia coli, uma colonizadora do trato digestivo de muitos organismos, Salmonella, um agente de muitas intoxicaes alimentares, as cianobactrias fotossintticas, os espiroquetas (Treponema pallidum e Borrelia burgdorferi, causa da sfilis e da doena de Lyme, respectivamente) e as clamdias (responsveis por tracoma e uretrites). Estima-se que as bactrias sejam responsveis por aproximadamente metade das doenas humanas. As Gram-negativas resultam mais difceis de tratar que as Gram-positivas, devido a uma camada adicional na parede celular que as protege e dificulta a entrada de antibiticos. Assim como o homem, os animais e as plantas tambm so afetados por patgenos bacterianos. O dano decorre da invaso dos tecidos do hospedeiro ou da liberao de substncias txicas (exo e endotoxinas). Mas nem todas so patognicas.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 3: Os microrganismos

A participao das bactrias na reciclagem dos elementos fundamental do ponto de vista ecolgico, possibilitando o tratamento de resduos e de guas servidas e, tambm, a eliminao de compostos recalcitrantes (biorremediao) e a extrao de minrios (biolixvia). Por outro lado, a fixao de nitrognio e a produo de toxinas pesticidas contribuem para melhorar as prticas agrcolas. Devido a suas propriedades metablicas, muitas eubactrias so utilizadas na produo de alimentos (laticnios, vinagre, picles e azeitonas) e de aditivos (vitaminas, aminocidos, gomas emulsificantes e estabilizantes), na indstria qumica (acetona, butanol e plsticos biodegradveis) e na indstria farmacutica (vacinas, toxinas e antibiticos). Tambm se utilizam na produo de enzimas para uso industrial e mdico (Tabela 3.2).

AS ARQUEAS
As arqueobactrias, ou arqueas, diferem das eubactrias pela estrutura da parede celular e, tambm, por alguns aspectos metablicos relacionados com a sntese de protenas que as aproximam dos eucariontes. Algumas vivem em habitats inspitos, como as solfataras dos vulces ou giseres, a temperaturas superiores a 60-800C (Islndia, Costa Rica). Outras prosperam em lagos onde a concentrao salina altssima, como o Grande Lago Salgado (Estados Unidos) ou o Mar Morto (Israel). Entre as arqueas existem tambm gneros com vias metablicas peculiares que as tornam dependentes de enxofre ou produtoras de metano. Devido a estas propriedades, nos ltimos anos tem-se acelerado a prospeco de arqueas com propriedades potencialmente interessantes, para serem utilizadas em processos industriais que exijam condies ambientais extremas. No entanto, estudos recentes de ecologia molecular mostram que as arqueas no se limitam a ambientes extremos, sendo sua diversidade bem maior do imaginado previamente. Tabela 3.2: As bactrias (Eubactrias e Arqueas) como agentes biolgicos.

Tratamento de resduos e de guas servidas Produo de energia Ex: Metano Biorremediao, extrao de minrio Indstria qumica Ex: Acetona, butanol, cido lctico, cido actico BACTRIAS Enzimas industriais Agricultura Ex: Rizbios, biopesticidas Alimentos Ex: Laticnios, vinagres, picles, azeitonas, silagem Indstria de alimentos Ex: Vitaminas B12 e -caroteno, aminocidos lisina e cido glutmico; polissacardeos xantana e dextrana* Indstria farmacutica Ex: Enzimas de uso mdico, antibiticos, vacinas e toxinas (*) A dextrana tambm tem usos mdicos

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OS PROTISTAS
Os Protozorios se classificam no reino Protista, um grupo mal definido de seres eucariticos unicelulares ou pluricelulares, auttrofos ou hetertrofos, de reproduo sexuada ou assexuada. Trata-se de organismos unicelulares heterotrficos, cujo tamanho varia entre 0,002 e 1mm. Alguns vivem livres em ambientes marinhos, de gua doce, ou simplesmente muito midos. Outros parasitam outras espcies, nas quais causam doenas: Girdia, Amoeba, Trichomonas, Plasmodium, Toxoplasma, Leischmania etc. De importncia fundamental para o ser humano do ponto de vista mdico, sua caracterizao molecular pode dar origem a testes diagnsticos e vacinas. Classificadas junto com os protozorios no reino Protista, as algas so organismos uni ou pluricelulares, autotrficos e aquticos. Situadas na base das cadeias alimentcias aquticas, as algas cumprem um papel fundamental na biosfera por serem capazes de fixar gs carbnico e produzir oxignio. Algumas participam na formao de solos e na fixao de nitrognio. Apesar de no ter rgos diferenciados, as macroalgas marinhas (algas pardas, algas vermelhas e parte das algas verdes) formam filamentos e talos que podem chegar a medir mais de trinta metros. So utilizadas na alimentao humana (Porphyra ou nori e Laminaria, como o kombu, no Oriente; cochayuyo no Chile); e, tambm, como adubo. Devido a sua capacidade de formar gis e emulses, os ficocoloides extrados delas (Agar, carragenina, alginato) so empregados em anlises clnicas (preparao de meios de cultivo para cultivo de bactrias e fungos) e em vrias indstrias, tais como a alimentcia (sorvetes, cremes, geleias etc.), a farmacutica (laxantes, cpsulas de remdios) e a cosmtica (cremes, sabonetes, xampus, dentifrcios etc.). As microalgas representam um grupo extremamente diversificado de umas 25.000 espcies das quais s um pequeno grupo est bem estudado. Este compreende aproximadamente cinquenta espcies de microrganismos fotossintticos, tanto eucariontes (diatomceas, dinoflagelados, euglenoides e outras algas verdes) como procariontes (cianobactrias, antigamente algas azul-esverdeadas).

Tabela 3.3: As algas como agentes biolgicos.


Tratamento de efluentes, biomonitoramento de poluio, energia Ex: Biomassa para a produo de energia. Agricultura Ex: Adubo. ALGAS Produo de alimentos Ex: Alimentao humana, rao para avicultura e aquicultura. Indstria de alimentos Ex: Aditivos, espessantes e emulsionantes, substitutos proteicos e complementos nutricionais. Indstria de cosmticos Ex: cidos graxos e outras substncias tais como ficocoloides, pigmentos, glicerol, abrasivos finos etc. Indstria farmacutica Ex: Compostos biologicamente ativos, antibiticos, antivirais e antitumorais. tais como toxinas,

Biomassa

Molculas

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 3: Os microrganismos

A proliferao de microalgas como floraes na natureza (mars vermelhas) ou em reservatrios, geralmente devido eutrofizao das guas, causa a morte de outros organismos, sendo muito perigosa se estiver acompanhada pela liberao de toxinas. Porm, em alguns sistemas de tratamento de efluentes as microalgas so incorporadas nos tanques para remover nutrientes inorgnicos e adicionar oxignio. Tambm so usadas como indicadores de poluio. O metano, um gs combustvel, resulta da degradao de biomassa de algas por microrganismos anaerbios. Por outro lado, a produo de hidrognio por algas representa uma alternativa energtica promissora. As microalgas so aproveitadas na alimentao animal como rao para a avicultura e a aquicultura. Algumas das substncias que elas sintetizam so includas na alimentao humana como complementos nutricionais e substitutos proteicos; trata-se de aminocidos, cidos graxos e vitaminas (B12, -caroteno ou provitamina A). Tambm so utilizadas na formulao de cosmticos e na indstria farmacutica (Tabela 3.3). OS FUNGOS

O Reino Fungi comporta mais de 100.000 espcies. Os fungos so organismos eucariticos, uni ou pluricelulares, com uma parede celular formada por quitina. Todos eles so hetertrofos e podem se reproduzir sexuada ou assexuadamente. As leveduras so fungos unicelulares que se desenvolvem em lugares midos e se reproduzem por brotamento. Pertence a este grupo um dos microrganismos de maior importncia econmica: Saccharomyces cerevisiae, o popular levedo de cerveja (ou, simplesmente, levedura) utilizado tradicionalmente na preparao de alimentos e de bebidas, assim como na produo de etanol, vitaminas e outros metablitos. Transformada mediante tcnicas de engenharia gentica, esta levedura produz uma vacina contra a hepatite B (Tabela 3.4). Entretanto, nem todas as leveduras so benficas; Candida albicans, um microrganismo oportunista da flora normal humana pode, em certas condies, proliferar de maneira anormal, tornando-se patognica.

Tabela 3.4: Os fungos como agentes biolgicos. Agricultura Ex: Controle biolgico de insetos e nematoides, micorrizas. Produtos de fermentao Ex: Etanol, glicerol, cido ctrico. Enzimas industriais Biomassa FUNGOS Ex: Fermento de padaria, micoprotena. Indstria de alimentos Ex: Panificao, queijaria. Indstria de bebidas Ex: Cervejas e vinhos, destilados. Produtos metablicos Ex: Extrato de levedura, hormnios de crescimento vegetal. Indstria farmacutica Ex: Antibiticos, vitaminas, vacinas, esteroides.

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Nos bolores e mofos, as clulas formam um emaranhado de filamentos ou hifas, denominado miclio. Os mofos crescem rapidamente por fragmentao do miclio e se disseminam mediante esporos; como Aspergillus niger, um produtor de cido ctrico; ou como Rhizopus, o fungo preto do po, que se expande sobre a superfcie deste apesar dos conservantes acrescentados; ou ainda como Aspergillus flavus, um bolor que ataca as sementes de leguminosas (amendoim, feijo, soja) e produz uma toxina poderosa, a aflatoxina, causando graves intoxicaes. Neste grupo tambm se encontra o Penicillium, um gnero que conta com diversas espcies, uma das quais utilizada na indstria farmacutica, para a produo de penicilina, e outras na indstria de alimentos, para a maturao de queijos como o Roquefort, o Gorgonzola e o Camembert. Os cogumelos so os corpos reprodutivos de muitos fungos. Alguns so venenosos (Ammanita), outros produzem substncia alucingena, tais como a psilobicina, utilizada por grupos nativos mexicanos em rituais religiosos, ou a ergotamina, sintetizada quimicamente no sculo XX com o nome de LSD (cido lisrgico). Mas tambm os h comestveis como o Agaricus ou champignon, o Shiitake e o Pleurotus, que so cultivados e comercializados pelo homem. Em termos ambientais, um quarto da colheita de frutas e vegetais destrudo pelos fungos; pragas como a ferrugem do caf, o esporo do centeio e a vassoura-de-bruxa afetam gravemente a agricultura. Na Irlanda no sculo XIX, o Phytophtora infestans atacou a batata, destruindo a fonte bsica de alimentao; a praga causou um milho de mortes e a emigrao forada de boa parte da populao. Os liquens resultam da simbiose entre um fungo e uma alga. Alguns so comestveis, supondo-se que a Lecanora esculenta seja o man referido na Bblia. O grupo no tem sido muito explorado economicamente, apesar de ter encontrado aplicaes como corantes (tintura de tornassol, um indicador de pH), no tingimento de tecidos e como fixadores na indstria de perfumes. Tambm so indicadores de poluio (biomonitoramento). Em contrapartida, outra associao, desta vez entre um fungo filamentoso e as razes das plantas vasculares, as micorrizas, ocupam um lugar de destaque na agricultura em solos tropicais por facilitarem a solubilizao dos fosfatos. OS VRUS, NA FRONTEIRA DO VIVO E DO NO VIVO

Os vrus so partculas inertes sem nenhuma atividade metablica, no limite entre o vivo e o no vivo. Os menores medem 20 nanmetros (1nm = 10-4 mm). Podem atravessar filtros extremamente finos e cristalizar. Sua estrutura muito simples: um cido nucleico (ADN ou ARN, como filamento simples ou duplo) dentro de uma capa proteica ou capsdeo. Muitos possuem enzimas que sero liberadas dentro da clula hospedeira (Figura 3.2) Figura 3.2: Alguns tipos de vrus.
Os adenovrus e o HIV parasitam clulas humanas; o bacterifago, bactrias.

Como parasitas obrigatrios de bactrias, plantas ou animais, ao infetar uma clula viva passam a utiliz-la para sua prpria reproduo. Alguns se integram no genoma da clula infetada (bacterifagos, retrovrus). Devido a esta propriedade, os vrus tm sido utilizados como vetores para introduzir genes em uma clula hospedeira (Figura 3.3).

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Figura 3.3: A multiplicao de um bacterifago.


A infeco da bactria pelo bacterifago destri a clula (ciclo ltico). Em alguns casos, o DNA viral se integra no cromossomo sendo transmitido s clulas filhas; em determinadas condies o vrus retoma sua atividade, reiniciando o ciclo ltico.

Vrias doenas humanas so causadas por vrus, tais como o poliovirus, o HIV, o coronavirus responsvel pela SAR (sndrome aguda respiratria) etc. Ao infectar as clulas animais normais, alguns vrus as transformam em clulas cancerosas. Os vrus que infectam insetos podem ser utilizados no controle de pragas. Na luta contra a lagarta da soja, o Baculovrus evita a aplicao de 1,2 milho de litros de inseticidas por ano nas lavouras brasileiras.

AS TCNICAS MICROBIOLGICAS
Diversos tipos de tcnicas, muitas das quais datam do sculo XIX, facilitam o trabalho laboratorial. A identificao de um microrganismo demanda a observao microscpica e a utilizao de alguns mtodos especficos de colorao, complementados por testes bioqumicos e eventualmente genticos e imunolgicos. Encontrar e manter um microrganismo no laboratrio demanda a aplicao de tcnicas bacteriolgicas aplicveis tambm, com algumas variaes, a fungos e algas. Cultivar microrganismos exige, alm do desenho de um meio nutriente que satisfaa suas necessidades metablicas, um cuidado especial com as condies de temperatura e iluminao em que este ser incubado. Os meios nutrientes se empregam lquidos ou solidificados com agar, uma substncia que lhes confere uma consistncia gelatinosa. Os recipientes mais comuns so tubos de ensaio e placas circulares de vidro com tampa (Placas de Petri); e, para inocular os meios, se utilizam alas de platina e pipetas de diferentes tipos (Figura 3.4). Figura 3.4: Material clssico de Microbiologia

A grande dificuldade do laboratrio microbiolgico est em conseguir a multiplicao do

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microrganismo desejado evitando as contaminaes, isto a multiplicao de outros microrganismos. Trabalha-se em condies asspticas, o que demanda a esterilizao prvia do material de vidro, dos meios nutrientes e dos instrumentos (alas, pipetas) que sero utilizados. E na transferncia do material biolgico, evita-se cuidadosamente toda contaminao com os microrganismos do ar. Equipamentos especialmente desenhados para trabalhar sob um fluxo de ar esterilizado ajudam o profissional. Tambm se evitam as contaminaes na hora de eliminar o material utilizado, a fim de no liberar microrganismos prejudiciais no ambiente. Os microrganismos so isolados a partir de amostras de solo, gua, ar ou fluidos corporais. As linhagens obtidas se conservam como culturas puras. Microrganismos com caractersticas diferentes so obtidos induzindo mutaes e selecionando as linhagens mutantes. Cada laboratrio mantm os estoques microbianos necessrios, que tambm podem ser solicitados a centros especializados (Colees de cultura). O nmero de microrganismos em uma amostra pode ser estimado por diversos mtodos: contagem microscpica, contagem eletrnica, contagem em placa, turvao do meio, massa seca, contedo de nitrognio ou medidas indiretas da atividade microbiolgica. Em geral, as tcnicas clssicas so trabalhosas e muito demoradas para o diagnstico clnico, por isso esto sendo substitudas por tcnicas miniaturizadas mais rpidas que identificam os microrganismos com base em algumas reaes bioqumicas em kits padronizados. A tendncia geral de automatizao do laboratrio microbiolgico. Em outra linha de ao, a partir do incio do sculo XX surge a Microbiologia Ambiental, trazendo uma nova viso em relao s populaes microbianas presentes na natureza. No entanto, nossa ignorncia em relao aos microrganismos ainda enorme. O nmero de espcies que conseguimos cultivar no laboratrio no representa ainda mais do que 1 a 5 % da totalidade existente; dependemos dos avanos na rea da genmica para ampliar nosso conhecimento das comunidades microbianas do ambiente.

BIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADE
Os microrganismos so classificados segundo o risco de causarem danos aos profissionais que trabalham com eles e coletividade. Os critrios so: a patogenicidade para o homem, a virulncia, o modo de transmisso, a endemicidade e a existncia ou no de uma teraputica eficaz. Definem-se assim quatro grupos de risco: Grupo 1: Baixo risco individual e coletivo. Microrganismos que nunca foram descritos como agente causador de doenas para o homem e que no constituem risco para o meio ambiente. Exemplos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli (algumas linhagens). Grupo 2: Risco individual moderado, risco coletivo limitado. Microrganismos que podem causar doenas no homem, com pouca probabilidade de alto risco para os profissionais do laboratrio. Exemplos: Salmonella, Toxoplasma, Schistosoma mansoni, vrus do sarampo, vrus da hepatite B. Grupo 3: Risco individual elevado, risco coletivo baixo. Microrganismos que podem causar doenas graves aos profissionais do laboratrio. Exemplos: Mycobacterium tuberculosis e HIV. Grupo 4: Srio risco para os profissionais do laboratrio e para a coletividade. Microrganismos que causam doenas graves para o homem. Exemplos: vrus Ebola, vrus Marburg. A cada grupo de microrganismos correspondem normas estritas de trabalho, que abrangem desde a arquitetura do laboratrio e as caractersticas dos equipamentos at as precaues que devem ser tomadas pelos profissionais e a forma em que o lixo ser descartado. O conceito de biossegurana se complementa com o de biosseguridade, isto , o conjunto de medidas necessrias para evitar a remoo intencional de material biolgico valioso como, por exemplo, em caso de bioterrorismo.

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OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOS


Tabela 3.5: Principais destaques entre os agentes biolgicos microbianos.

EUBACTRIAS Bactrias lcticas

UTILIZAO
Os gneros Lactobacillus e Streptococcus so responsveis por vrios processos, tais como a elaborao de queijos e de iogurtes, o envelhecimento dos vinhos, a conservao de alimentos (sauerkraut ou repolho fermentado, silagem para o gado); a produo de cido lctico, um aditivo utilizado na indstria de alimentos como acidulante e estabilizante. Este microrganismo prolifera no solo e na superfcie das plantas, sintetizando uma toxina fatal para as larvas de insetos. Esta produzida comercialmente h mais de 40 anos, representando 90% das vendas de inseticidas biolgicos e reduzindo a necessidade de aplicao de pesticidas qumicos nas lavouras. Nos ltimos anos, o gene codificador da toxina tem sido transferido a plantas (algodo, milho) para que estas sintetizem diretamente o inseticida. Alm do cheiro caracterstico da terra removida, este gnero de bactrias do solo produz substncias antibiticas (estreptomicina, tetraciclina, eritromicina), antifngicas (nistatina), herbicidas, antitumorais e supressoras de rejeio a transplantes . Vrias linhagens se utilizam na eliminao de poluentes. Algumas quebram molculas de hidrocarbonetos, como os existentes nos acidentes de derramamento de petrleo; outras podem remover o mercrio aqutico. Agente patognico para as plantas dicotiledneas que desenvolvem um tumor ou galha quando infetadas. Com a remoo de um gene, perde a capacidade de provocar tumores, conservando a capacidade infecciosa, utilizada na engenharia gentica de vegetais . Na indstria txtil, Clostridium butiricum libera as fibras vegetais durante a macerao do cnhamo e do linho. Clostridium acetobutyricum utilizado na produo industrial de acetona e butanol. Clostridium botulinum produz uma toxina poderosssima; calcula-se que um grama desta bastaria para matar um milho de pessoas. A ingesto de conservas contaminadas e mal esterilizadas resulta quase sempre em um desfecho fatal. Devido a sua ao inibitria da contrao muscular, a toxina botulnica utilizada em concentraes muito pequenas, para reduzir as rugas e marcas de expresso durante certo tempo (efeito cosmtico).

Bacillus thuringiensis

Streptomyces

Pseudomonas

Agrobacterium tumefaciens

Bactrias butricas

Escherichia coli

Descoberta em 1855, esta bactria Gram-negativa vive no

trato digestivo do homem e de outros animais. Tm forma de bastonete (0,002 mm de comprimento, 0,0008 mm de dimetro), 1 a 4 molculas de DNA e 15.000 a 30.000 ribossomos. Flagelos e pelos lhe permitem movimentar-se rapidamente. Algumas linhagens so patognicas, podendo contaminar os alimentos (carne, leite, vegetais) que devem ser cozidos adequadamente. Os seus requerimentos nutricionais bsicos so simples: gua, sais minerais, uma fonte de nitrognio e uma fonte de energia. Em condies adequadas, se divide a cada 20-40 minutos; tambm pode se reproduzir de maneira sexuada (conjugao). Devido facilidade com que ela pode ser cultivada no laboratrio, Escherichia coli tem se tornado uma ferramenta indispensvel para estudos bioqumicos e genticos, incluindo a Engenharia Gentica. O seu genoma compreende 4,6 milhes de pares de bases que codificam em torno de 4.000 protenas diferentes. A introduo de transgenes em Escherichia coli K12, uma linhagem inofensiva de laboratrio, possibilitou os primeiros processos de produo de insulina, de interferon e de hormnio de crescimento. Entretanto, por se tratar de uma clula procaritica, nem sempre a melhor opo de "fbrica" para a sntese de produtos de origem animal ou vegetal, tendo sido aos poucos substituda por outras clulas eucariticas, como a levedura.

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ARQUEOBACTRIAS Thermus aquaticus

UTILIZAO
Isolada em uma poa do parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos), esta bactria produz uma enzima que copia o DNA a uma temperatura alta. Esta enzima permite obter milhes de cpias de um fragmento de DNA em um processo automatizado que revolucionou a Biotecnologia, chamado PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reao em cadeia da polimerase). Vivem em lugares onde h ausncia de oxignio, seja no tubo digestivo de alguns animais (gado, cupins) ou nos pntanos. Estas bactrias transformam o acetato resultante da degradao de celulose por outras bactrias em metano, um gs combustvel.

Bactrias metanognicas

ALGAS Spirulina

UTILIZAO
O seu alto teor proteico, que corresponde a 60% do peso seco, lhe confere um elevado valor nutritivo; as protenas representam aproximadamente 2% do peso seco da batata e 6-10% do trigo. Quando da chegada dos espanhis, os astecas j preparavam umas bolachas (tecuitlatl) com a Spirulina coletada no lago Texcoco. Na frica, no lago Tchad, ainda hoje ela coletada e consumida como alimento. Spirulina, assim como Chlorella, so vendidas em tabletes como complemento nutritivo. Acumula glicerol em condies de alta salinidade, com o qual consegue evitar a desidratao. Pode crescer no Mar Morto, sendo tambm cultivada em tanques ou lagoas, perto do Mar Vermelho, para extrao do glicerol e de -caroteno, outro produto metablico.

Dunaliella

FUNGOS Saccharomyces cerevisiae

UTILIZAO
Conhecido como levedo de cerveja ou levedura, utilizado na preparao de alimentos (po, biscoitos, fermento de padaria) e de bebidas (cerveja, vinho e destilados), assim como na produo de outras substncias de importncia industrial (etanol, vitaminas e outros metablitos). A levedura cresce facilmente em laboratrio. Tambm pode ser manipulada geneticamente. Nos fermentadores ou biorreatores industriais onde se multiplica rapidamente a partir de matrias-primas de baixo custo, ela permanece ativa durante perodos longos e, ao concluir o processo, pode ser separada por filtrao ou centrifugao. Com 12.000.000 de pares de bases e 6.000 genes em 16 cromossomos, Saccharomyces cerevisiae foi, em 1997, o primeiro organismo eucaritico a ter o seu genoma sequenciado. Algumas espcies alcanam grande importncia industrial, como A.niger, utilizada para a produo de cido ctrico ou de enzimas (em linhagens modificadas geneticamente). Algumas espcies so utilizadas na indstria farmacutica (penicilina) ou indstria de alimentos (queijos azuis, como o Roquefort e o Gorgonzola; queijo Camembert).

Aspergillus Penicillium

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CAPTULO 4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOS

AS PROTENAS
Todos os organismos esto formados por gua e molculas de diversos tipos, inorgnicas e orgnicas (Figura 4.1). Entre estas ltimas, se encontra um grupo de macromolculas, as protenas, que participam em numerosas atividades, cumprindo um papel fundamental para os seres vivos. Pertencem a este grupo as enzimas, molculas de ao cataltica, e os anticorpos, molculas que participam na defesa do organismo.

Tabela 4.1: As funes das protenas no organismo.


FUNO Componentes estruturais Substncias de reserva Ao cataltica Outras EXEMPLOS Queratina do cabelo, colgeno da derme, actina e miosina das fibras musculares. Albumina do ovo, casena do leite. Enzimas que controlam as reaes qumicas celulares. Transmisso de informao (hormnios proteicos), participao nos mecanismos de defesa (anticorpos, citocinas), transporte e armazenamento de pequenas molculas (hemoglobina).

Figura 4.1: A composio qumica de uma bactria.


Apesar de algumas diferenas nas propores de alguns componentes, a composio qumica de outros microrganismos ou das clulas eucariontes comparvel de uma bactria.

ESTRUTURA As protenas so macromolculas formadas por 20 aminocidos diferentes. Estes se caracterizam por ter, unidos ao tomo de carbono, um grupo amino (bsico), um grupo carboxila (cido) e um radical varivel (Figura 4.2 A). A presena de um carbono assimtrico resulta em duas formas moleculares (L) e (D) que diferem por suas propriedades pticas. Os aminocidos que compem as protenas correspondem forma (L).

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A reao de condensao entre o grupo carboxila de um aminocido e o grupo amina de outro cria uma ligao peptdica (Fig.4.2 B). A unio de vrios aminocidos forma uma cadeia peptdica que se caracteriza no s pelo nmero e tipo de aminocidos que a compem, como pela sequncia em que estes se encontram, denominada estrutura primria. Ao se estabelecerem ligaes entre os grupos que formam os enlaces peptdicos, a cadeia adota uma estrutura regular ou estrutura secundria, geralmente em forma de hlice ou de folha. As interaes entre as cadeias laterais dos aminocidos causam o dobramento da protena, resultando uma configurao espacial que chamada de estrutura terciria. A forma final de uma protena depender ainda da associao entre vrios polipeptdios, no que se denomina de estrutura quaternria (Figura 4.2 C). Quando sintetizada dentro da clula, uma protena adotar espontaneamente a configurao espacial que decorre de sua estrutura primria. Entretanto, fatores ambientais como o pH, a concentrao salina ou a temperatura podem causar alteraes momentneas ou definitivas na forma da molcula.

Figura 4.2: Aminocidos e protenas

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 4: As protenas e os anticorpos

AS BASES DE ALGUMAS TCNICAS LABORATORIAIS Cromatografia

Esta tcnica permite separar as substncias de uma mistura com fins analticos e preparativos. Est baseada na migrao diferencial das molculas de uma mistura, colocada em uma fase mvel, sobre um suporte estacionrio ou matriz. Em funo das caractersticas da fase estacionria, distinguem-se diferentes modalidades: cromatografia em papel, em camada delgada, cromatografia em gs, cromatografia lquida etc. Na cromatografia em coluna, por exemplo, a separao das protenas de uma mistura depende da estrutura da matriz, slida e permevel, que se encontra imersa em um solvente (Figura 4.3). A separao obedece a trs tipos de mecanismos: Troca inica. A matriz est formada por pequenas partculas carregadas que retm as molculas de carga contrria. Como a associao depende de fatores como o pH e a fora inica da soluo, a modificao destes fatores permite controlar a separao. Filtrao em gel. A matriz consiste em partculas porosas que separam as protenas em funo de seu tamanho, como uma peneira molecular. Afinidade. As partculas da matriz esto unidas por ligaes covalentes a molculas (enzimas, anticorpos) que interagem com a protena de interesse. Para liberar a protena retida na coluna, muda-se o pH ou a concentrao salina. Desse modo se consegue a protena purificada.

Figura 4.3: Cromatografia em coluna


O processo est baseado na velocidade de migrao diferencial das molculas proteicas em uma matriz imersa em um solvente.

Eletroforese Molculas ionizadas colocadas em um campo eltrico migram de acordo com suas cargas e pesos moleculares. Se a carga for positiva, elas migraro para o plo negativo ou ctodo e, inversamente, se ela for negativa, a migrao ocorrer na direo do plo positivo ou nodo. Este o fundamento de outra tcnica analtica, a eletroforese. Se uma mistura de peptdeos for colocada em um campo eltrico, eles migraro de acordo com sua carga, forma e tamanho, formando cada um deles uma banda caracterstica que ser visualizada mediante um corante ou uma reao qumica especfica (Figura 4.4). Observe-se que a carga de um peptdeo resulta da soma das cargas correspondentes aos grupos amina e carboxila terminais e dos radicais dos aminocidos que o compem, e que essa carga varia com o pH do meio.

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A eletroforese permite separar os componentes de uma mistura. Existem numerosas variaes desta tcnica em funo do suporte (papel de filtro, slica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida), da disposio da cuba (horizontal ou vertical), da direo da migrao (unidirecional ou bidirecional) etc.

Figura 4.4: Eletroforese


Separao dos peptdeos de uma mistura, por migrao diferencial em um campo eltrico.

Espectrometria de massa

Esta tcnica analtica mede a massa molecular a partir da razo entre a massa e a carga de molculas ionizadas, medida que permite a identificao de uma substncia. Com a descoberta de mtodos de ionizao adaptados s molculas biolgicas como o MALDI (do ingls Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization), a espectrometria de massa se tornou nos ltimos anos uma ferramenta indispensvel na identificao de protenas, acares, cidos nucleicos, lipdios e outros compostos orgnicos. Aplicada s protenas, a espectrometria de massa identifica a molcula por comparao com outras de um banco de dados. Tambm fornece uma anlise estrutural da molcula indicando a sequncia de aminocidos. Com esta tcnica possvel estudar o conjunto de protenas de um organismo (proteoma) e dissecar as interaes das protenas com outras molculas. Por ser um mtodo automatizado e rpido, tem alcanado mltiplas aplicaes em farmacologia e diagnstico.

AS ENZIMAS
A CATLISE ENZIMTICA
As reaes qumicas que ocorrem nos seres vivos dependem da atividade cataltica das enzimas. Estas molculas agem diminuindo a energia de ativao necessria de uma reao qumica, sendo capazes de promov-las e aceler-las, sem ser alteradas ou destrudas. A molcula de enzima reconhece um substrato especfico, formando com ele um complexo molecular ou estado de transio. O encaixe no stio ativo da molcula facilita a transformao do substrato no(s) produto(s) da reao. A enzima recuperada no fim da reao, podendo atuar inmeras vezes. O processo pode ser representado como a seguir:

S+E

SE

P+E

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 4: As protenas e os anticorpos

A primeira caracterstica das enzimas a especificidade; uma enzima como a lactase, que opera sobre a lactose, no agir sobre a sacarose; duas enzimas que hidrolisem o amido podero faz-lo cortando a molcula de maneira diferente, como a -amilase e a -amilase. A segunda que, em funo de sua origem biolgica, as enzimas so biodegradveis e agem em condies brandas de temperatura e pH. A ao enzimtica depende do pH, da temperatura, da presena de cofatores inorgnicos (zinco, ferro, cobre) e/ou orgnicos (coenzimas, muitas das quais so vitaminas). Os metais pesados alteram a estrutura molecular da enzima de maneira irreversvel impedindo sua ao cataltica (desnaturao). Uma inibio da atividade enzimtica ocorre quando molculas muito parecidas com o substrato competem com este para ocupar o stio ativo da enzima (inibio competitiva). Ou quando outras molculas se ligam a determinadas partes da enzima, alterando a estrutura espacial e dificultando o encaixe com o substrato (inibio no competitiva). Figura 4.5: O mecanismo da atividade enzimtica.
A atividade enzimtica no modifica o equilbrio da reao.

OS DIVERSOS TIPOS DE ENZIMAS Uma forma de classificar as enzimas pelo tipo de reao que catalisam, acrescentando o sufixo ase ao nome do substrato que transformado: protease, lactase, amilase, lipase, celulase. Tambm se pode adicionar ase ao nome da reao catalisada: hidrolase, oxirredutase. Quando combinadas as duas regras anteriores, se mencionam o nome do substrato e da reao catalisada adicionando ase como, por exemplo, em DNA-polimerase. Porm, algumas enzimas, como a renina ou a trombina, conservam seus nomes tradicionais.

Tabela 4.2: A classificao internacional das enzimas


CLASSE Oxirredutases Transferases Hidrolases Liases Isomerases Ligases TIPO DE REAO CATALISADA Reaes onde se transferem eltrons. Reaes onde se transferem grupos qumicos. EXEMPLOS Desidrogenases, oxidases. Transaminases, fosforilases.

Reaes de hidrlise, isto , de transferncia de grupos Proteases, carboidrases, funcionais para a gua. peptidases, lipases. Adio de grupos a duplas ligaes ou formao de Decarboxilases (renina, duplas ligaes por eliminao de grupos. trombina). Produo de ismeros por transferncia de grupos Isomerases, mutases. dentro de molculas. Formao de ligaes C-C, C-S, C-O e C-N por reaes Sintetases. de condensao.

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IMPORTNCIA ECONMICA
As enzimas apresentam numerosas vantagens quando utilizadas como agentes biolgicos em processos tecnolgicos: especificidade, operao em condies facilmente controlveis e biodegradabilidade. De um modo geral, os tratamentos enzimticos diminuem a carga poluidora dos efluentes industriais. Das 25.000 enzimas que, segundo as estimativas, existiriam na natureza, at o momento s foram classificadas umas 2.800, sendo comercializadas 400. O mercado se distribui fundamentalmente entre as proteases (59%), as carboidrases (28%) e as lipases (3%), trs grandes conjuntos de enzimas que so utilizadas por diversas indstrias; os 10% restantes do mercado correspondem s enzimas analticas e farmacuticas (Tabela 4.3).

Tabela 4.3: As enzimas como agente biolgico


Indstria de alimentos e bebidas Ex: clarificao de vinhos e sucos de frutas, substituio da maltagem pelo tratamento do amido na elaborao de cervejas, fabricao de po, biscoitos e bolachas, produo de adoantes, fabricao de laticnios, suplementao de raes animais. Produtos de limpeza Ex: detergentes e lava-roupas para a remoo de manchas difceis, produtos para limpar dentaduras e lentes de contato. ENZIMAS Indstria txtil Ex: desengomador de tecidos, acabamento de jeans. Curtumes Ex: amaciamento de couros. Indstrias de papel e celulose Ex: branqueamento de polpa de celulose. Indstria farmacutica Ex: reagentes para uso em anlises clnicas, nucleases para a manipulao gnica. Tratamentos mdicos Ex: combate de inflamaes, edemas e leses; dissolventes de cogulos sanguneos, agentes teraputicos em transtornos digestivos. Nos sabes lava-roupas, as enzimas prometem ao consumidor roupas limpas e com aparncia de novas. Um exrcito constitudo por proteases, amilases e lipases digere as manchas difceis (sangue, leite, molho de tomate, capim, chocolate, batom etc.), enquanto que as celulases removem as microfibrilas de celulose das roupas. No sendo mais necessrio esfregar as manchas, a limpeza se realiza com pouco esforo e sem desgaste do tecido; como estas molculas trabalham a temperaturas baixas, o consumo de energia menor. Com mais uma vantagem para o fabricante: as enzimas no representam mais que uma frao muito pequena do sabo (0,4-0,8%), correspondente a 1% do seu custo. As enzimas so empregadas tambm no acabamento de roupas. Para conseguir o aspecto usado, os jeans eram lavados com pedras (stone washed), um processo que tinha o inconveniente de causar a abraso da maquinaria e o desgaste do tecido. Nos ltimos anos, as pedras foram substitudas por celulases, com resultados satisfatrios. Os curtumes, em vez de excrementos de cachorro ou de pombo, se valem hoje de enzimas pancreticas para amaciar e desengordurar as peles. Na indstria de alimentos e bebidas, as enzimas participam na produo de adoantes, de po, biscoitos e bolachas, de queijos. Na extrao de sucos de frutas, as pectinases aumentam substancialmente o rendimento do processo, ao liberar o suco retido na pectina das paredes celulares vegetais. Tambm facilitam a clarificao de vinhos e cervejas.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 4: As protenas e os anticorpos

Como medicamentos, as enzimas se aplicam em vrios contextos, especialmente em quimioterapia e nas terapias trombolticas. E muitos entre os mais corriqueiros testes de diagnstico dependem de reagentes enzimticos. As enzimas permitem a resoluo de misturas de molculas racmicas, nas que h duas formas isomricas, tipo mo direita e mo esquerda, com diferente atividade biolgica. Desse modo, podero ser evitados problemas como o da talidomida, um medicamento que causou o nascimento de numerosos bebs com deformaes congnitas, na dcada de 1960. A tragdia teria sido consequncia da presena no produto comercial da forma molecular tipo mo direita, de ao teratognica, junto ao tipo mo esquerda, de ao calmante. Atualmente, esto sendo estudados mtodos enzimticos para eliminar os prons responsveis pela denominada doena da vaca louca. Tambm se cogita a utilizao de enzimas para limpar reas contaminadas com agentes qumicos como o gs sarin.

OS ANTICORPOS
Dentro da estratgia de defesa de um organismo, os anticorpos so elementos importantes no reconhecimento do eu e na eliminao do no eu (antgeno). Uma parte importante da resposta imune envolve a produo de anticorpos que reconhecem o antgeno, desencadeando os mecanismos de destruio adequados. Em condies experimentais de laboratrio, a reao antgeno-anticorpo ocorre quando os reagentes se encontram em meio lquido e nas concentraes adequadas, sendo visualizada como: Uma precipitao, se os antgenos estiverem dissolvidos em um meio lquido ou em um gel (poliacrilamida). Uma aglutinao, se os antgenos estiverem localizados sobre partculas (hemcias ou bactrias).

A MOLCULA DE ANTICORPO

A molcula de anticorpo denominada IgG (Imunoglobulina G) formada por duas cadeias polipeptdicas leves e duas pesadas em forma de Y, ao qual se associa um pequeno nmero de grupos carboidrato. Uma parte da molcula constante; as regies variveis localizadas nas extremidades dos braos do Y respondem pelo reconhecimento do antgeno (Figura 4.6). Este tipo de anticorpo se encontra no soro sanguneo, na frao proteica caracterizada por eletroforese como -globulina.

Figura 4.6: A estrutura da molcula de anticorpo (IgG).

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A UNIO ANTGENO-ANTICORPO
A unio antgeno-anticorpo ocorre quando um anticorpo encontra no antgeno uma forma complementar, geralmente parte de uma molcula livre ou ancorada na membrana celular. Um antgeno pode ter vrias destas formas (eptopos ou determinantes antignicos) e ser reconhecido por anticorpos diferentes (Figura 4.7). Figura 4.7: Os anticorpos e o reconhecimento do antgeno.
Observe-se que, ao compartilhar estruturas (determinantes antignicos ou eptopos), alguns antgenos podem ser reconhecidos por um mesmo anticorpo, dando origem a uma reao cruzada.

A PRODUO DE ANTICORPOS NO ORGANISMO


As clulas responsveis pela produo de anticorpos so os linfcitos B, que se formam na medula ssea. Depois de um processo de diferenciao que envolve uma srie de rearranjos genticos, cada linfcito pode reconhecer um nico eptopo (Figura 4.8). Ao encontrar o eptopo especfico, o linfcito B prolifera, originando um clone de clulas secretoras de anticorpos Uma vez eliminado o antgeno, algumas clulas desse clone permanecero no organismo como clulas-memria. Em um contato posterior com o mesmo eptopo, as clulas-memria daro incio resposta imune, que ser mais rpida e mais intensa que a primeira. Apesar de cada linfcito ser capaz de reconhecer um nico eptopo, todos os linfcitos podem reconhecer aproximadamente 108 eptopos diferentes, o que explica a eficincia da resposta imune.

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Figura 4.8: O encontro do linfcito B e do antgeno, e a seleo clonal.

A PRODUO DE ANTICORPOS NO LABORATRIO

Os anticorpos ocupam um lugar de destaque nos testes de diagnstico clnico, por reunir duas propriedades que os transformam em uma ferramenta ideal: especificidade e diversidade. Ao injetar animais (ratos, ovelhas, coelhos) com um antgeno, se induz em pouco tempo uma resposta imune. Esta envolve a produo de anticorpos contra o antgeno, sendo possvel separ-los do soro sanguneo do animal. Se o antgeno utilizado possuir vrios eptopos, no soro extrado se encontrar uma mistura de anticorpos, chamados policlonais. Estes resultam da ativao de vrios clones de linfcitos B, cada um dos quais reconhece um dos eptopos do antgeno. Observe-se que o soro tambm ter anticorpos contra eventuais impurezas do antgeno, assim como anticorpos contra outros antgenos aos que o animal esteve exposto anteriormente. A purificao de um soro um processo longo e complexo, que dever ser repetido a cada extrao de sangue do animal. Apesar destes problemas, reagentes de laboratrio deste tipo foram utilizados normalmente at a dcada de 1980. No possvel cultivar separadamente os linfcitos porque estes sobrevivem pouco tempo in vitro. A obteno de clones que sintetizem anticorpos especficos contra um nico eptopo, isto monoclonais, s se tornou possvel com o desenvolvimento da tecnologia de hibridomas (Kohler, Milstein, 1975). Um hibridoma resulta da fuso entre um linfcito B e uma clula cancerosa de mieloma. Reunindo as propriedades de ambas as clulas, cada hibridoma capaz de sintetizar um nico tipo de anticorpo (monoclonal) e de se multiplicar indefinidamente no laboratrio, seja em cultivo de tecidos, seja na cavidade do peritoneu de um animal hospedeiro (Figura 4.9).

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Figura 4.9: A produo de anticorpos no laboratrio

4.9.A: A produo de anticorpos policlonais. Recolhe-se o soro de um animal imunizado contra uma mistura de molculas entre as quais est a molcula X. No soro se encontraro misturados anticorpos de diferente especificidade, um dos quais reconhece X. 4.9.B: A produo de anticorpos monoclonais. Injeta-se em um rato a mesma mistura de molculas; dias mais tarde, extrai-se o bao do animal e fusionam-se os linfcitos B (alguns dos quais reconhecem a molcula X) com clulas de mieloma. Os hibridomas so separados, cultivados e testados para identificar os que produzem anticorpos contra X.

A UTILIZAO DOS ANTICORPOS


Os anticorpos monoclonais encontraram imediatamente aplicaes, substituindo praticamente os anticorpos policlonais, tanto na purificao de biomolculas e clulas como nos testes de diagnstico clnico ou ambiental ou no controle de qualidade dos alimentos. Anticorpos especficos fixados nas partculas de uma coluna de afinidade permitem separar molculas de uma mistura que circule por ela. Outra utilizao extremamente engenhosa est na separao de populaes celulares em um aparelho denominado cell sorter. As clulas so marcadas com anticorpos ligados a uma molcula fluorescente; ao passar atravs de raios laser, adquirem cargas eltricas, sendo separadas mediante uma placa defletora do equipamento. A visualizao da reao entre o antgeno e o anticorpo se v facilitada quando estes ltimos recebem alguma marcao. Em cortes histolgicos, o antgeno localizado pelos anticorpos acoplados a uma molcula fluorescente que possa ser identificada microscopicamente (Figura 4.10). Associados a uma molcula radiativa, os anticorpos so utilizados na dosagem de substncias presentes nos fluidos corporais, sendo quantificada a radioatividade por exposio de uma placa sensvel.

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Figura 4.10: Ensaios imunofluorescentes


O anticorpo marcado pode reconhecer diretamente o antgeno (reao direta) ou reconhecer o anticorpo unido ao antgeno (reao indireta).

A obteno de anticorpos contra a frao constante da molcula de anticorpos humanos representa um avano considervel na produo de reagentes para o diagnstico clnico. Nos ensaios imunoenzimticos, utilizam-se estes anticorpos acoplados a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um produto colorido (Figura 4.11).

Figura 4.11: Ensaios imunoenzimticos.


O antgeno pode ser reconhecido por um anticorpo associado a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um produto colorido (reao direta). Tambm pode ser reconhecido por um anticorpo especfico, e este por um anticorpo que reconhece a frao constante do anticorpo. O segundo anticorpo se associa a uma enzima que, ao reagir com o seu substrato especfico, forma um produto colorido (reao indireta).

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A utilizao de anticorpos monoclonais com fins teraputicos demorou muito mais que o esperado. Sendo produzidos por clulas de camundongo ou de rato, eles so reconhecidos como estranhos quando injetados no homem, formando-se complexos imunes que lesionam gravemente os rins. A fim de evitar essas reaes, comearam a serem elaborados anticorpos monoclonais quimricos (33% de protena animal) e humanizados (10% de protena animal). Estes conservam parte das sequncias animais, especialmente nas partes que reconhecem o antgeno, sendo o restante da molcula substitudo por sequncias humanas. Ultimamente, com a obteno de anticorpos monoclonais humanos mediante tcnicas de engenharia gentica, se abriram novos caminhos para o diagnstico e o tratamento de doenas (Figura 4.12). Figura 4.12: Os anticorpos como agentes biolgicos Purificao de molculas Reagentes de laboratrio ANTICORPOS Reagentes para diagnstico Imunoterapias

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CAPTULO 5. OS CIDOS NUCLEICOS E OS GENES


OS CIDOS NUCLEICOS
Embora descobertos em 1869, por Miescher, no pus das bandagens de ferimentos, o papel dos cidos nucleicos na hereditariedade e no controle da atividade celular comeou a ser esclarecido apenas em meados do sculo XX. O cido desoxirribonucleico (DNA) carrega em sua estrutura as instrues necessrias para a construo de um organismo. Estas direcionam o desenvolvimento de suas caractersticas bioqumicas, fisiolgicas, anatmicas e inclusive de algumas das comportamentais. Nas clulas procariticas, uma molcula grande e circular de DNA forma o cromossomo, havendo tambm uma ou duas molculas de DNA extracromossmico, formando estruturas circulares, denominadas plasmdeos. Nas clulas eucariticas, vrias molculas lineares de DNA associadas a protenas formam os cromossomos, localizados dentro do ncleo celular. Tambm h DNA em algumas organelas, como os cloroplastos e as mitocndrias. O cido ribonucleico (RNA) se encontra no ncleo e no citoplasma celular. Do ponto de vista qumico, os cidos nucleicos (cido ribonucleico e desoxirribonucleico) so macromolculas formadas a partir de unidades chamadas nucleotdeos. Um nucleotdeo resulta da associao mediante ligaes qumicas covalentes de trs tipos de elementos: uma molcula de cido fosfrico, um acar de cinco carbonos (pentose: ribose ou desoxirribose) e uma base cclica nitrogenada: adenina, citosina, guanina, timina ou uracila. Da unio dos nucleotdeos mediante unies covalentes entre as extremidades 5' e 3', formam-se cadeias (Figura 5.1).

Figura 5.1: A composio dos cidos nucleicos.


Observe-se a posio dos grupos 3 e 5 no acar.

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A DUPLA HLICE

J na dcada de 1940, vrios trabalhos indicavam claramente que o material responsvel pela hereditariedade era o DNA. Porm, o modo como esta molcula poderia assegurar essa funo s comeou a ser vislumbrado em 1953, quando Watson e Crick formularam um modelo da estrutura tridimensional do DNA que, segundo suas prprias palavras, poderia ter um considervel interesse biolgico. No modelo de Watson e Crick, duas cadeias de nucleotdeos formam uma figura parecida com uma escada de corda torcida, a dupla hlice. Nessa escada, o cido fosfrico e o acar so as partes verticais (corrimos) e as bases nitrogenadas so os degraus (Figura 5.2A). As cadeias so antiparalelas, isto , se uma corre na direo 5' 3' a outra corre na direo 3' 5. Ambas as cadeias esto unidas entre si por pontes de hidrognio entre as bases, sendo que as ligaes ocorrem sempre entre adenina e timina (2 pontes) e entre citosina e guanina (3 pontes). De acordo com o modelo, quando em um filamento a sequncia de bases AGTACG, no outro filamento ela ser TCATGC. Como as sequncias so complementares, cada filamento pode servir como molde para a sntese de uma nova molcula. E, no momento da diviso celular, cada clula-filha poder receber uma molcula semelhante da clula-me (Figura 5.2B).

Figura 5.2: A molcula de DNA


A: A dupla-hlice ( esquerda). O pareamento das bases ocorre sempre entre uma purina e uma pirimidina: adenina e timina ou uracila; guanina e citosina. B: A duplicao do DNA d origem a duas molculas semelhantes ( direita). Observe-se que o processo de duplicao envolve numerosas enzimas, sendo bem mais complexo do que est representado no esquema.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 5: Os cidos nucleicos e os genes

O CDIGO GENTICO
A autoduplicao do DNA permite que cada clula receba uma cpia do material gentico, com as instrues necessrias para a construo e funcionamento do indivduo. O funcionamento de uma clula depende, fundamentalmente, de dois tipos de molculas: os cidos nucleicos e as protenas. Ambos esto relacionados, sendo que a estrutura primria de um polipeptdeo codificada por um gene, isto , um segmento de DNA. O cdigo simples, correspondendo um aminocido a cada trinca de bases. A tabela a seguir nos mostra quais os aminocidos correspondentes aos diferentes cdons ou trincas de bases do mRNA. Alguns so codificados por uma nica trinca, como o triptfano (UGG) ou a metionina (AUG); outros admitem vrios cdons que geram sinonmia como, por exemplo, a prolina (CCU, CCC, CCA, CCG). O incio da sequncia sinalizado por AUG, o cdon correspondente a metionina, sendo este aminocido removido posteriormente; o fim da sequncia sinalizado por UAA, UAG ou UGA, trs cdons que significam stop. Tabela 5.1: O cdigo gentico Segunda Base Primeira Base Uracila (C) Phe Uracila (U) Phe Leu Leu Leu Citosina (C) Leu Leu Leu Ile Adenina (A) Ile Ile Met Val Guanina (G) Val Val Val Citosina (C) Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Adenina (A) Tyr Tyr stop stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Guanina (G) Cys Cys Stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Terceira Base (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G)

Abreviaturas: Asp = cido Asprtico; Glu = cido Glutmico; Ala = Alanina; Arg = Arginina; Asn = Asparagina; Cys = Cistena; Phe = Fenilalanina; Gly = Glicina; Gln = Glutamina; His = Histidina; Ile = Isoleucina; Leu = Leucina; Lys = Lisina; Met = Metionina; Pro = Prolina; Ser = Serina; Tyr = Tirosina; Thr = Treonina; Trp = Triptfano; Val = Valina.

Mudanas na sequncia de bases do DNA podem ter como consequncia a substituio de um aminocido por outro. No exemplo da figura 5.3, se GUG for substitudo por CGU, no peptdeo correspondente a valina ser substitudo por leucina. Mas, em funo da sinonmia do cdigo, se a trinca GUG for substituda por GUA ou GUC, o aminocido codificado continuar sendo a valina. Perdas ou adies de uma base modificam o resto da sequncia do peptdeo. As pequenas mudanas ou mutaes de ponto se devem a erros na duplicao do DNA; sua frequncia aumenta em presena de alguns agentes qumicos e fsicos como a luz UV e os raios X.

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A AO GNICA
A informao codificada no DNA transcrita em uma molcula mensageira que a leva at os ribossomos, onde as indicaes sero traduzidas da linguagem dos cidos nucleicos linguagem das protenas, sendo montado o peptdeo correspondente. Deste modo, se estabelece na clula um fluxo da informao gentica que segue em uma direo nica: do DNA ao RNA, do RNA ao peptdeo (Figura 5.3). Uma exceo a esta regra a dos retrovrus, cujo material hereditrio RNA e que contam com uma enzima (transcriptase reversa) que lhes permite transcrever a informao no sentido RNADNA. Na sntese de protenas intervm, basicamente, trs tipos de RNA: mRNA, rRNA e tRNA. O cido ribonucleico mensageiro, ou mRNA, de tamanho varivel e filamento nico. A molcula de mRNA leva at os ribossomos a informao gentica transcrita em trincas de bases (cdons) complementares a algum segmento de uma das cadeias do DNA. Associado a protenas, o cido ribonucleico ribossmico ou rRNA forma as duas subunidades dos ribossomos, que so as estruturas celulares onde ocorre a sntese proteica. O cido ribonucleico de transferncia tRNA capaz de reconhecer simultaneamente um aminocido e um cdon de mRNA. Existem 61 tipos moleculares diferentes de tRNA. Observe-se que, alm dos genes codificadores de protenas, existem tambm genes codificadores de rRNA e tRNA, cidos ribonucleicos que no so transformados em protenas. Existem outros tipos de RNAs (pequenos RNA nucleares, RNAs nucleolares etc.) que cumprem diversas funes na atividade celular. Figura 5.3: O fluxo da informao gentica Segundo o Dogma Central da Biologia Molecular, a informao gentica codificada no DNA transcrita no mRNA e traduzida no ribossomo com a participao dos tRNAs. O produto final um peptdeo. e microRNAs

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A REGULAO DA AO GNICA

Mecanismos diversos de regulao agem em cada uma das etapas da sntese proteica. O processo apresenta algumas diferenas em clulas procariticas e eucariticas (Figura 5.4). Diversos mecanismos regulam cada etapa.

Figura 5.4: A sntese de protenas em clulas procariticas e eucariticas A) Clula eucaritica B) Clula procaritica

CLULAS PROCARITICAS
Uma bactria pode contar com aproximadamente 2.500 genes; nem todos funcionando simultaneamente. Se houver lactose no meio (e faltar glicose), as bactrias sintetizaro aquelas enzimas que possibilitem sua utilizao. E se faltar o aminocido triptfano no meio, produziro os vrios tipos de enzimas necessrias para sintetiz-lo. Isto se v facilitado pela agrupao dos genes correspondentes em baterias (perons), que so ligadas ou desligadas em conjunto (Figura 5.4). Figura 5.4: A organizao e regulao dos genes nas clulas procariticas.

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Neste processo de ligar e desligar esto envolvidas trs regies anteriores sequncia codificadora: o promotor, o operador e o regulador. A enzima RNA-polimerase encaixa no promotor, desde onde comear a se deslocar ao longo do gene. Protenas sintetizadas pelo gene regulador agem no operador, abrindo ou bloqueando a passagem da RNA-polimerase. Este mecanismo possibilita a induo ou represso da transcrio da sequncia codificadora (Figura 5.5). A organizao dos genes de uma mesma via metablica em perons permite que a clula se adapte rapidamente s condies ambientais, com certa economia de recursos. O funcionamento do peron depende da funo exercida pelos genes (degradao ou sntese). Por isso, a presena de lactose induz a transcrio do peron lac, sendo sintetizadas vrias enzimas necessrias para degrad-la; em ausncia de lactose, o peron deixa de funcionar. J no peron Trp, a presena de triptfano reprime a transcrio das enzimas necessrias para sintetizar esse aminocido. Na clula procaritica, alm dos genes funcionarem em bloco, a sntese proteica comea quando o mRNA est ainda sendo transcrito, de maneira que a transcrio e a traduo so simultneas. CLULAS EUCARITICAS

A transcrio As bactrias no so as nicas que ligam e desligam os seus genes. Uma clula humana com 30.000 a 35.000 genes no expressa mais que 3 a 5% destes, que no sero necessariamente os mesmos ao longo da vida embrionria ou em diferentes tipos celulares. Entretanto, salvo em nematdeos, no foram achados perons nas clulas eucariticas; os genes responsveis por uma sequncia de reaes metablicas se encontram dispersos em um ou em vrios cromossomos. O controle da transcrio comea na compactao do cromossomo e na metilao de algumas bases que podem dificultar o acesso da maquinaria de transcrio ao DNA. Esta inclui fatores de ativao, fatores de transcrio e protenas reguladoras, algumas das quais dependem de outras sequncias, estimuladoras e inibidoras, distantes do gene em at vrios milhares de bases (Figura 5.5). As sequncias reguladoras iniciais determinam quando, por quanto tempo e em que clulas o gene ser transcrito. Figura 5.5: A organizao e regulao dos genes nas clulas eucariticas
Regies denominadas UTR (do ingls untranslated regions), portadoras de sequncias sinalizadoras que no sero traduzidas, se localizam a montante e a jusante da unidade de transcrio.

Ao reconhecer a presena desses fatores e protenas reguladoras na regio anterior ao gene, a RNA-polimerase encaixa nas sequencias promotoras da transcrio. Associada a outros fatores adicionais, a enzima se desloca abrindo a dupla hlice e transcrevendo a sequencia codificadora de um ou outro filamento no RNA. A enzima avana na direo 5- 3, sendo que vrias molculas de RNA-polimerase podem estar transcrevendo o mesmo gene simultaneamente em algo parecido com uma fila indiana.

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A sntese acaba quando a RNA-polimerase encontra uma sequencia finalizadora. Uma vez cumprida sua tarefa, a molcula de RNA-polimerase ser liberada. As sequncias reguladoras terminais indicam qual ser a durao mdia de vida da molcula. O processamento do RNA transcrito Nos organismos eucariticos, a estrutura do gene fragmentada (Figura 5.4). A sequncia gnica transcrita por inteiro no RNA e, posteriormente, um mecanismo de corte e reunio ir eliminar algumas das sequncias intercalares. Estas permanecero no ncleo (ntrons) em quanto que as restantes (xons) formaro o RNA mensageiro que sair do ncleo na direo do citoplasma. Tanto o nmero como a extenso das sequncias intercalares varia em diferentes genes. As consequncias biolgicas deste mecanismo so importantes. Protenas sintetizadas utilizando as vias alternativas de corte e reunio permitem que um nico gene se expresse de maneira diferente em diversos tecidos. O corte e reunio dos fragmentos no a nica modificao do RNA transcrito; este recebe um revestimento inicial ou cap (7-metilguanosina) que o dirigir ao ribossomo, e uma cauda de poli(A) que lhe dar estabilidade na sua viagem at a maquinaria de traduo. A traduo e o destino das protenas A sntese proteica se inicia depois do mRNA atravessar a membrana nuclear e migrar para o citoplasma. Assim como a transcrio, a traduo envolve a participao de numerosas enzimas e protenas reguladoras. Algumas molculas de mRNA levam sequncias sinalizadoras que as dirigem at os ribossomos associados ao retculo endoplasmtico, sendo as protenas sintetizadas secretadas fora da clula. Outras molculas de mRNA sero traduzidas nos ribossomos livres no citosol, sendo as protenas resultantes utilizadas no mesmo lugar ou nas organelas celulares. O mRNA reconhece o ribossomo mediante uma sequncia especfica; a associao entre ambos d incio sntese peptdica. Cada tRNA carrega o aminocido que lhe corresponde at a cadeia peptdica. A complementaridade entre um dos cdons do mRNA e o anticdon do tRNA garante que este coloque o aminocido no lugar adequado na sequncia. Existem vrios mecanismos de regulao envolvendo a ao de protenas associadas ao complexo ribossmico, variaes na vida mdia do mRNA e inclusive a traduo do mRNA por vrios ribossomos ao mesmo tempo. O peptdeo sintetizado passar por diversas modificaes e associaes, at se constituir no produto final ativo, uma protena com uma estrutura quaternria determinada. A Figura 5.6 resume as diferentes etapas da sntese de protenas em clulas procariticas e eucariticas. Figura 5.6: As etapas da sntese de protenas em clulas procariticas e eucariticas

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A GENMICA
O GENOMA HUMANO
O termo genoma designa o conjunto completo de cromossomos haploides que contm toda a informao gentica de um indivduo. O genoma da espcie humana est representado em 24 cromossomos diferentes (22 autossmicos, X e Y) em cada um dos quais h uma molcula de DNA. Em 1990, teve incio o Projeto Genoma Humano (HGP, do ingls Human Genome Project), um dos projetos cientficos mais ambiciosos j realizados, envolvendo pesquisadores de mais de 18 pases na tarefa de mapear e sequenciar o DNA humano e tambm o de outros organismos. Em Junho do ano 2000, o International Human Genome Sequencing Consortium e a Celera Genomics, uma empresa privada norte-americana, anunciaram simultaneamente ter completado o rascunho do genoma humano. Os resultados foram publicados em fevereiro de 2001, nas revistas Nature e Science. Em abril de 2003, cinquenta anos depois da descoberta da dupla hlice, o Consrcio anunciou ter completado 99% do mapeamento. Os seus resultados esto armazenados em bancos de dados pblicos que podem ser acessados via Internet. Entre as principais concluses: O nmero de bases no genoma humano chega a 3,2 bilhes, e o nmero de genes a um valor compreendido entre 30.000 e 40.000; s 2% do genoma codificaria protenas. O nmero de genes em organismos como a mosca Drosophila melanogaster ou o verme Caenorrabditis elegans trs vezes menor. Compartilhamos com estes organismos alguns genes e contamos com outros que so caractersticos dos vertebrados como, por exemplo, vrios dos genes referentes ao sistema imune. A densidade dos genes em diversos cromossomos e em diferentes partes deles varia. Existem grandes espaos entre os genes, s vezes chamados de DNA-lixo. Sequncias repetidas, no codificadoras, cuja funo direta ainda no bem conhecida, ocupam pelo menos 50% do genoma. O tamanho dos genes varivel, sendo na mdia de 3.000 bases. Na realidade, o tamanho no parece ter muita importncia. Como boa parte dos genes poderia ser lida de diversos modos, o nmero de protenas poderia ser bem maior. Independentemente de nossa origem tnica, compartimos com os outros seres humanos 99,9% da sequncia gnica. As diferenas entre os seres humanos se devem a variaes de uma base em 3.000.000 de pontos dentro e fora dos genes. Estas variaes se denominam polimorfismos de um nucleotdeo nico ou SNPs (do ingls, single nucleotide polymorphisms). Os SNPs podem dar informaes sobre a base gentica da susceptibilidade a uma srie de doenas ou servir como marcadores das mesmas (doena cardiovascular, diabetes, artrite e cnceres). Em vrios genes foram encontradas sequncias associadas a doenas (cncer de mama, cegueira, surdez, doenas musculares).

Os laboratrios de sequenciamento modernos esto altamente automatizados, sendo que muito do trabalho feito por robs e computadores. Uma quantidade enorme da informao obtida se encontra na Internet, armazenada em grandes bancos de dados. O desenvolvimento da Bioinformtica, um conjunto de novas tecnologias que utiliza mtodos computacionais e matemticos para analisar as informaes, tem sido fundamental para o progresso dos estudos sobre os genomas. Muitos dos estudos atuais no so mais feitos in vivo nem in vitro, mas in silico.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 5: Os cidos nucleicos e os genes

A Genmica surge como uma nova disciplina que tenta responder a algumas questes fundamentais: Onde esto os genes? O que faz cada gene? Como diferem os organismos em relao a seus genes? Cada uma dessas perguntas a subdivide em especialidades como a Genmica estrutural, a Genmica funcional ou a Genmica comparativa. Paralelamente, se definem outras reas de estudo, tais como: A transcriptmica, concernente ao RNA transcrito ou transcriptoma, isto , aos padres de expresso gnica. A protemica, referente ao conjunto de protenas da clula ou proteoma, que varia ao se diferenciarem as clulas e em resposta a estmulos ambientais. A metabolmica, relativa ao conjunto de substratos e subprodutos de reaes enzimticas que incidem no fentipo celular. A genmica tem aplicaes imediatas no campo mdico e farmacolgico, atravs dos testes genticos e dos novos medicamentos (Tabela 5.2). Estima-se que, entre os 30.000 a 40.000 genes humanos recentemente descobertos, 5.000 a 10.000 poderiam ser o alvo de novos produtos farmacolgicos. Se forem consideradas as protenas, o nmero de alvos pode ser multiplicado por dez. Paralelamente ao mapeamento do genoma humano, mais de 900 outros organismos foram sequenciados (microrganismos, plantas, animais). Em 2009, os mais de 4.500 projetos em andamento abrangem organismos eucariontes (22%), bactrias (53%), arqueas (22%) e metagenomas (3%). Em curto ou mdio prazo, esta informao reverter tambm no desenvolvimento da agricultura, da pecuria e da indstria qumica.

Tabela 5.2: O DNA como agente biolgico.

Identificao de microrganismos patognicos Controle da qualidade dos alimentos Medicina molecular Ex: Diagnsticos, tratamentos personalizados, terapias gnicas. Testes genticos Ex: Diagnsticos, avaliao dos riscos de sade. DNA e GENMICA Agronomia e pecuria Ex: Mtodos seletivos mais eficientes. Indstria farmacolgica Ex: Novos medicamentos (protenas teraputicas), vacinas recombinantes e de DNA. Prtica forense Ex: Identificao das pessoas. Estudos antropolgicos e evolutivos

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A GENMICA BRASILEIRA
Vrios pases de Amrica Latina contam com projetos em andamento (Argentina, Brasil, Chile e Mxico). De um modo geral, estes envolvem parcerias entre instituies pblicas e privadas, sendo beneficiados por acordos internacionais com pases desenvolvidos (Estados Unidos, Frana, Alemanha) ou por redes de cooperao inter-regionais (Brasil, Argentina, Chile, Uruguai e Paraguai). Pioneiro na cincia genmica, o Brasil alcana resultados significativos em diversas reas, tais como:

Sade humana: Sequenciamento de Schistosoma mansoni (um protozorio causador da esquistossomose), de Leischmania chagasi (um protozorio causador do calazar), de Paracoccidioides brasiliensis (um fungo causador de micose), de Trypanosoma cruzi (um protozorio causador da doena de Chagas), de Anopheles darlingi (um mosquito transmissor da malria) de Leptospira interrogans (uma bactria transmitida pela urina do rato e que afeta o homem). Tambm se desenvolvem importantes estudos sobre o Genoma Humano do Cncer e o Genoma Clnico. Sade animal: Sequenciamento de Mycoplasma synoviae (um vrus que afeta os bovinos) e Mycoplasma hyopneumoniae (um vrus que afeta os sunos). Pecuria: Mapeamento de Bos indicus (gado Nelore adaptado ao Brasil), estudos sobre o genoma funcional do boi, do frango, da abelha. Agricultura: Sequenciamento de Xylella fastidiosa (causadora da praga do amarelinho das videiras), de Xanthomonas (uma bactria causadora do cancro ctrico ou tristeza), de Leifsonia xyli (bactria que ataca a cana-de-acar), de Crinipellis perniciosa (um fungo causador da vassoura de bruxa, que ataca o cacau), de Baculovrus anticarsia (um vrus que ataca a lagarta da soja), de Mycosphaerella fijiensis (que causa a sigatoka negra da banana) de Gluconacetobacter diazotrophicus e de Herbaspirillum seropedicae (bactrias fixadoras de nitrognio). Indstria: Sequenciamento de Chromobacterium violaceum (uma bactria que pode originar compostos de interesse farmacolgico) e de vrias plantas industriais (guaran, caf, cana-de-acar, eucalipto, alm de leguminosas como soja, feijo, feijo-caupi e amendoim). Estas realizaes foram possveis graas ao envolvimento pioneiro da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (Fapesp) e criao de Rede Nacional de Sequenciamento do Programa Genoma Brasileiro (CNPq, Ministrio de Cincia e Tecnologia), com 25 laboratrios regionais e um laboratrio de bioinformtica (Laboratrio Nacional de Computao Cientfica), a participao da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) e vrias universidades que deram a infraestrutura necessria e possibilitaram a capacitao profissional. A criao de empresas novas com fundo de capital de risco (Votorantim) visa desenvolver produtos biotecnolgicos que gerem e comercializem patentes na rea da genmica aplicada, com o qual, em um futuro prximo, a participao do Brasil nesta rea se ver afianada. Algumas destas empresas (Allelyx, Canavialis) foram adquiridas em 2008 pela multinacional Monsanto.

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CAPTULO 6. OS PROCESSOS FERMENTATIVOS


OS PROCESSOS FERMENTATIVOS E A INDSTRIA
A produo de vinhos e cervejas o primeiro processo fermentativo desenvolvido em escala industrial. Ao longo do sculo XX, a expanso da Microbiologia Industrial possibilitou, mediante o desenvolvimento de processos baseados no metabolismo microbiano, a produo de diversas substncias (acetona, butanol, etanol, cido ctrico, antibiticos etc.). Atualmente, as fermentaes encontram aplicaes novas, tanto no tratamento ambiental como na produo de alimentos e aditivos, de produtos qumicos e de medicamentos. Por motivos histricos, ainda hoje o termo processos fermentativos se aplica em biotecnologia a qualquer processo microbiano operado em grande escala, independentemente de ser ou no uma fermentao. E o termo fermentador se usa como sinnimo de biorreator, designando o recipiente onde ocorre o processo. Tradicionais ou revigoradas pelas possibilidades oferecidas pela manipulao gnica, as fermentaes ou bioprocessos visam um dos seguintes objetivos: A multiplicao de microrganismos para a obteno de biomassa (leveduras, rizbios, protena de clula nica). A obteno de produtos microbianos (antibiticos, aditivos, lcool, enzimas etc.). A converso de um substrato em outro, por ao de microrganismos ou de enzimas (transformao de esteroides, isomerizao de glicose em frutose). A purificao de um solvente (tratamento de efluentes, transformao de algum poluente em alguma substncia facilmente degradvel etc.).

Um processo fermentativo comea com a escolha do agente biolgico adequado (microrganismo ou enzima); segue com a transformao da matria-prima, em condies que podem exigir esterilizao, aerao e controle do processo (pH, temperatura etc.); e finaliza com a separao e purificao do produto final (Fig.6.1). Figura 6.1: O processo fermentativo genrico.

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Autora: Maria Antonia Malajovich

Para que o processo seja economicamente vivel deve-se contar com uma matria-prima barata, um procedimento passvel de ser bem controlado e uma forma de recuperar o produto que simplifique ao mximo sua purificao. Observe-se que clulas animais e vegetais tambm podem ser cultivadas em grande escala, como ser visto no prximo captulo, junto com as tcnicas de cultura de tecidos.

OS MICRORGANISMOS INDUSTRIAIS
NOES SOBRE O METABOLISMO PRIMRIO E SECUNDRIO
Denominamos metabolismo o conjunto de reaes qumicas de degradao (catabolismo) e de sntese (anabolismo) de substncias em um organismo. As primeiras liberam energia, as outras a consomem. As clulas e a maioria dos microrganismos retiram dos compostos orgnicos a energia que precisam, para a manuteno de sua estrutura e para suas atividades. Nas vias catablicas, a degradao de compostos orgnicos em molculas menores libera energia; uma parte desta ser acumulada sob a forma de ATP (trifosfato de adenosina), e a restante dissipada como calor. Respirao e fermentao so as principais vias catablicas (Figura 6.2). A quantidade de energia liberada e os produtos finais diferem se a oxidao do composto orgnico for total ou parcial. Na gliclise, a glicose degradada at uma molcula de trs carbonos, o piruvato. Em presena de oxignio, a entrada do piruvato no ciclo de Krebs e a fosforilao oxidativa permitem a quebra total da glicose em CO2 e H2O, liberando uma grande quantidade de energia sob a forma de ATP (respirao aerbia). Mediante a reduo do piruvato ou de algum de seus derivados (fermentao), vrios microrganismos geram outras substncias orgnicas: acetona, butanol, etanol, cido lctico, cido actico, glicerol etc. Estas reaes ocorrem geralmente em ambientes onde o substrato abundante, sendo pequena a quantidade de energia obtida. Dependendo das condies ambientais, isto , da presena ou ausncia de oxignio, algumas leveduras e bactrias (assim como as clulas musculares) podem respirar ou fermentar.

Figura 6.2: Respirao e fermentao.


Na respirao, onde o ltimo aceptor de eltrons o oxignio, a oxidao de glicose se completa at chegar a CO2 e H2O, produzindo 36-38 molculas de ATP. Na fermentao, o ltimo aceptor de eltrons o piruvato ou algum outro derivado, produzindo 2 ATP.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 6: Os processos fermentativos

A respirao e algumas fermentaes so representadas mediante equaes, como a seguir:

Respirao aerbia: C6H12O6 + 6 O2 +38 ADP + 38Pi


Glicose

6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP

Fermentao alcolica (leveduras como Saccharomyces cerevisiae e algumas bactrias): C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi
Glicose

CH3 CH2OH
Etanol

+ CO2

2 ATP

Fermentao lctica (bactrias como Streptococcus e Lactobacillus): C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi


Glicose

CH3 CHOH COOH + 2 ATP


cido lctico

No metabolismo, os caminhos de degradao se cruzam com os de sntese. Outras molculas (aminocidos, cidos graxos) podem entrar em determinados pontos da via catablica da glicose, convergindo para a produo de energia e de pequenas molculas simples (CO 2, H2O e NH3). Inversamente, alguns dos compostos intermedirios do catabolismo so os pontos de partida para vias anablicas. Entretanto, as vias metablicas no so reversveis: o caminho seguido na degradao de uma substncia parcial ou totalmente diferente do caminho de sntese correspondente, podendo inclusive ocorrer em compartimentos celulares diferentes. Esta separao facilita a regulao enzimtica do metabolismo que ocorre com o menor desperdcio de matria e energia. Alm das vias metablicas primrias, que so comuns a todos os microrganismos, existem outras vias metablicas secundrias especficas. A ativao de umas e/ou de outras depende do microrganismo e das condies em que ele se desenvolve em seu ambiente natural ou em que ir ser cultivado. Os metablitos primrios esto relacionados com o crescimento dos microrganismos e a transformao de nutrientes em biomassa; sendo os principais exemplos o etanol, o cido lctico ou os aminocidos. J os metablitos secundrios, mesmo sendo desnecessrios no metabolismo microbiano, permitem a sobrevivncia em ambientes extremamente competitivos que contam com escassos nutrientes. So metablitos secundrios os antibiticos, os alcaloides, os pigmentos, algumas enzimas e toxinas. De um modo geral, quando os microrganismos se desenvolvem em um meio com uma quantidade limitada de nutrientes, a populao passa por diversas fases (Figura 6.3). Fase lag: perodo de adaptao em que, apesar de no se multiplicar, os microrganismos sintetizam enzimas e constituintes celulares. Fase log: a populao cresce de maneira exponencial, sendo sintetizados numerosos metablitos primrios. Fase estacionria: devido ao esgotamento dos nutrientes e acumulao de excretas, algumas clulas morrem, enquanto outras se dividem. No fim da fase log e incio da fase estacionria comeam a serem sintetizados os metablitos secundrios. Fase de declnio: sem a renovao dos nutrientes, as clulas morrem em um tempo varivel.

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Figura 6.3: As fases de crescimento de uma populao.


Clulas e metablitos primrios so produzidos na fase log; os metablitos secundrios no fim da fase log e incio da fase estacionria.

Com vistas ao desenvolvimento de um bioprocesso, a escolha do microrganismo ter que ser feita em funo de suas vias metablicas; e as condies de cultivo dependero do objetivo da fermentao, um metablito primrio ou um metablito secundrio (Figura 6.4).

Figura 6.4: A produo de metablitos primrios e secundrios


Os nutrientes do meio permitem a multiplicao celular e a formao do metablito primrio, que pode ser utilizado pelas clulas para sintetizar o metablito secundrio (a); este pode tambm ser sintetizado diretamente a partir de alguma substncia do meio (b).

AS LINHAGENS INDUSTRIAIS
De um modo geral, para que o cultivo em um fermentador resulte economicamente vivel, o microrganismo deve ser capaz de se multiplicar rapidamente, sintetizando grande quantidade do produto a partir de uma matria-prima barata. Existem Bancos e Colees de Cultura que vendem esse tipo de linhagens de microrganismos como culturas puras, geneticamente estveis e aptas para o cultivo em grande escala. Apesar de terem sido isoladas do meio ambiente, as linhagens industriais diferem substancialmente das linhagens originais, em virtude de uma srie de alteraes genticas (mutaes, recombinaes) obtidas no laboratrio. Algumas vias metablicas, especialmente as do metabolismo secundrio, podem ter sido alteradas, de maneira a aumentar ao mximo a sntese do produto desejado e evitar a produo de algumas substncias desnecessrias. Em geral, por estar to selecionadas geneticamente, tendo inclusive algumas vias metablicas anuladas ou desbalanceadas, estas linhagens sobrevivem pouco tempo no meio ambiente. Porm, como norma geral, as linhagens industriais no devem ser patognicas nem produzir toxinas. A produo de medicamentos ou de vacinas um caso especial que exige medidas de segurana estritas. Os microrganismos constituem um grupo biolgico muito diversificado e, ainda, pouco conhecido, por isso existem muitas expectativas em relao prospeco de linhagens em ambientes extremos ou pouco usuais. No se precisa desenvolver um processo novo para cada microrganismo que apresente alguma caracterstica comercial interessante. A tendncia atual de transferir os genes correspondentes a algum dos microrganismos conhecidos, adaptados s condies industriais.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 6: Os processos fermentativos

A ESCOLHA DA MATRIA-PRIMA
A composio do meio de cultura depende das necessidades metablicas do microrganismo escolhido. Este deve conter todos os nutrientes necessrios nas concentraes adequadas, que variam em funo do microrganismo e do objetivo do processo. Em geral, os meios de cultura utilizados no laboratrio incluem: gua. Uma fonte de energia e de carbono: glicose, amido etc. Uma fonte de nitrognio: inorgnica (sulfato de amnia, nitrato de potssio etc.), orgnica (asparragina, succinato de amnia, glutamato, ureia, etc.) ou complexa (farinha de soja, peptona etc.). Sais minerais, tais como fosfato de potssio (K2HPO4 ou KH2PO4), sulfato de magnsio (MgSO4 7H2O), cloreto de clcio (CaCl2) etc. Elementos-trao: ferro, zinco, mangans, cobre, cobalto, molibdnio.

Com vistas a uma explorao comercial, os meios definidos so substitudos na indstria por matrias-primas de baixo custo como, por exemplo, soro de leite, melao de cana ou de beterraba, amido de milho etc. Em alguns casos, a matria-prima passa por um tratamento prvio com mtodos fsicos e/ou qumicos. No caso de se tratar de um processo enzimtico, o meio dever levar, alm do substrato adequado, os elementos necessrios para que a enzima possa desenvolver sua atividade cataltica (precursores, cofatores etc.).

OS PROCESSOS TRADICIONAIS
Algumas fermentaes se desenvolvem sobre resduos agroindustriais ou florestais, como gros, palha, bagao, serragem etc. Este tipo de fermentao em meio slido umedecido utilizada na produo de alimentos como, por exemplo, o levedo da massa na panificao, a maturao de queijos por ao de fungos (Roquefort, Gorgonzola), o cultivo de fungos, a fermentao do cacau, do caf e do ch etc. Na sia, a preparao do koji, soja fermentada, a base de alimentos tradicionais como o tofu, o miss, o shoyu e o sak. Em alguns lugares, estas fermentaes ainda ocorrem artesanalmente, dentro de folhas de bananeira e cestas de bambu ou mesmo em montes; tambm existem hoje equipamentos sofisticado com bandejas, colunas, frascos e tambores rotativos, alguns totalmente automatizados (Figura 6.5)

Figura 6.5: Biorreator para fermentaes em fase slida

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Outra variante interessante do processo fermentativo a produo tradicional de vinagre (Processo Francs ou de Orlans) em barris de carvalho. O vinho inoculado com bactrias do gnero Acetobacter que formam na superfcie a "me do vinagre", uma pelcula que flutua, presa a um quadriculado de madeira que a impede de afundar. Deste modo, o microrganismo cresce na superfcie de um meio lquido, em contato simultneo com o ar e com o meio. O processo fornece excelentes vinagres, mas lento e exige muito espao, sendo a capacidade de cada barril de 200 litros (Figura 6.6). Existem outros processos semelhantes, conduzidos por fungos, que formam uma pelcula de miclio na superfcie do lquido. Figura 6.6: Um processo tradicional, a produo de vinagre (Mtodo de Orlans)

OS PROCESSOS SUBMERSOS
OS FERMENTADORES OU BIORREATORES
Atualmente, a maioria dos processos industriais se desenvolve em cubas de vidro ou de ao de at 20 litros. Os agentes biolgicos se encontram submersos no meio de cultivo que ocupa, aproximadamente, 75% da cuba. s vezes necessrio injetar ar, e em muitas fermentaes se forma espuma. O desenho do biorreator deve se adequar ao objetivo do processo, respondendo eventualmente a diversos imperativos, tais como a esterilizao do sistema, a aerao e homogeneizao do meio, o acrscimo de nutrientes e de aditivos antiespuma, a manuteno do pH etc. Os modelos de fermentadores mais utilizados com microrganismos contam com aerao e agitao mecnica. Esta facilita a distribuio dos nutrientes na cuba, mas gera calor que deve ser eliminado mediante a circulao de gua fria (Figura 6.7). Se o processo exigir assepsia, esta ser conseguida mediante:

A esterilizao do meio, dentro ou fora do fermentador. A desinfeco ou esterilizao do equipamento, por injeo de vapor ou mediante o calor gerado por serpentinas, sendo esta medida extensiva a todos os ductos de entrada e sada e s vlvulas correspondentes. A esterilizao do ar, mediante filtros adequados.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 6: Os processos fermentativos

Em outros tipos de biorreatores, em coluna ou torre, a homogeneizao depende da injeo de ar (Figura 6.7). Os tanques podem chegar a 3.000 m 3 de capacidade como, por exemplo, os fermentadores para a produo de protenas de clula nica, da Imperial Chemical Industries (ICI), no Reino Unido. Os sistemas submersos so apropriados para o cultivo de microrganismos livres, mas resultam pouco econmicos quando se trabalha com clulas ou enzimas caras. A imobilizao em fermentadores menores, seja por adeso a um suporte inerte, seja por incluso dentro de um polmero que permita o contato com o meio de cultura, alm de simplificar a purificao do produto permite a reutilizao das clulas ou das enzimas, que permanecem dentro do biorreator (Figura 6.8). O crescimento da populao microbiana, ou a quantidade do produto formado so monitorados a partir de amostras extradas ao longo do processo.

Figura 6.7: Modelo de biorreator utilizado em fermentaes submersas.

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Figura 6.8: Fermentaes submersas, agentes biolgicos e biorreatores.


Estes ltimos se adaptam s necessidades de cada agente biolgico e de cada tipo de processo.

A MUDANA DE ESCALA
A capacidade de uma cuba varia entre 1 e 10 l para um fermentador de laboratrio, chegando a 5.000 l em uma planta piloto e 100.000 l em uma planta industrial. Uma operao simples de laboratrio pode ser impraticvel, ou pouco econmica, quando realizada em grande escala. No laboratrio, aps as primeiras experincias realizadas na bancada, o processo passa a ser estudado em um biorreator de at 10 litros de capacidade, onde se analisam as variveis fsico-qumicas em outra escala. Ao aumentar o tamanho do equipamento, altera-se a relao superfcie/volume, de modo que as condies de operao do fermentador na planta piloto devero ser ajustadas at se aproximar das correspondentes a um processo comercial. Se a experincia na planta piloto for bem-sucedida, o processo poder ser desenvolvido em um fermentador industrial (Figura 6.9). A automatizao do monitoramento e do controle da fermentao permite que a informao relativa aos parmetros fsicos e qumicos (pH, temperatura, oxignio, velocidade de agitao, o nvel do meio etc.) seja recolhida on-line por sondas e sensores. Para que o processo se aproxime das condies ideais, a informao analisada em relao a um modelo previamente estabelecido. Como este se elabora a partir da experincia obtida com cubas menores (laboratrio, piloto), os ajustes mudana de escala so de grande complexidade.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 6: Os processos fermentativos

Figura 6.9: A mudana de escala do laboratrio indstria.


A mudana de escala entre o processo laboratorial e o processo industrial cria vrios problemas de ndole tecnolgica.

A CONDUO DO PROCESSO
O processo fermentativo pode ser conduzido de maneira contnua ou descontnua (batelada), sendo que ambas as formas apresentam vantagens e inconvenientes. Em um sistema descontnuo de produo, uma vez que o fermentador carregado com a matria-prima e o inculo correspondentes, a fermentao prossegue at o esgotamento dos nutrientes. Concludo o processo e extrado o produto, o fermentador esvaziado, limpo e esterilizado antes de receber outra carga. Apesar do tempo improdutivo entre uma batelada e a seguinte, o sistema relativamente flexvel, j que o mesmo equipamento pode ser utilizado na fabricao de produtos diferentes. A produo em bateladas bastante utilizada na indstria farmacutica porque o risco de contaminao permanece relativamente baixo. J no sistema contnuo de produo, o acrscimo de nutrientes e a retirada do produto ocorrem simultaneamente ao longo do processo, eliminando-se quase totalmente o tempo improdutivo. Como o risco de contaminao aumenta, o sistema se adapta a processos que no exijam assepsia, como a produo de protena microbiana e de lcool e, obviamente, o tratamento de gua. Entre o sistema em batelada e o sistema contnuo existe um sistema intermedirio de batelada alimentada em que, periodicamente, parte do contedo (meio de cultivo + produto) retirada e substituda por meio fresco.

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A RECUPERAO DO PRODUTO
A recuperao do produto representa uma frao considervel do custo de um processo fermentativo. Se o produto for secretado fora da clula, estar disperso em um volume grande de gua e ser necessrio separ-lo por decantao ou filtrao. Mas se o produto permanecer dentro das clulas, estas tero que ser desintegradas para proceder a sua extrao. O produto se concentra por sedimentao, precipitao, filtrao, centrifugao, extrao por solventes, destilao, evaporao do solvente e secagem. Se a purificao for necessria, esta envolver outros procedimentos, como a cristalizao e os mtodos cromatogrficos. Um problema a considerar o despejo dos resduos de uma fermentao, alguns dos quais podem representar um perigo para o meio ambiente como, por exemplo, o vinhoto resultante da produo de etanol ou o soro das indstrias de laticnios. Existem formas de tratamento, como o crescimento de biomassa sobre resduos industriais, que eliminam o problema e ainda permitem a obteno de mais um produto.

OS BIOPROCESSOS NA INDSTRIA DE BIOFERTILIZANTES


Na Amrica Latina, a produo de biofertilizantes envolve numerosas empresas, pequenas e mdias, que contam com um slido suporte tecnolgico originado em universidades e instituies pblicas de pesquisa agronmica. O termo biofertilizante se aplica aos produtos que contm agentes biolgicos capazes de favorecer o desenvolvimento vegetal. Um destes agentes o Rhizobium, uma bactria simbionte das razes de leguminosas que fixa o nitrognio atmosfrico, reduzindo a necessidade de aplicar fertilizantes nitrogenados nas lavouras. Vrios pases produzem inoculantes agrcolas; entre eles: Argentina, Brasil, Chile, Colmbia, Cuba, Mxico, Peru e Uruguai. As linhagens bacterianas so estirpes selecionadas por sua eficincia em uma ampla gama de cultivares e amplamente adaptadas s condies locais. A multiplicao dos microrganismos se realiza em etapas sucessivas, utilizando recipientes cada vez maiores at chegar a biorreatores de 1.500 litros. Uma vez recuperados, os microrganismos so veiculados em meio lquido ou em turfa estril, sendo empacotados e posteriormente vendidos e distribudos aos agricultores. Segundo a legislao do Mercosul, durante o prazo de validade do produto, a concentrao dever ser de 10 8 microrganismos viveis por grama de produto. Com o mapeamento do genoma de microrganismos como o Rhizobium etli (Mxico) e o Gluconacetobacter diazotrophicus (Brasil), a biotecnologia moderna comea a se inserir neste campo. No entanto, at o presente, a indstria baseia a produo dos microrganismos nas tecnologias fermentativas clssicas.

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CAPTULO 7. A CULTURA DE CLULAS E TECIDOS


A MICROPROPAGAO DE PLANTAS
A reproduo assexual utilizada para obter um grande nmero de mudas a partir de uma nica planta. Dependendo do caso, aproveitam-se bulbos (cebola), cormos (gladolo), rizomas (samambaias), tubrculos (batata-inglesa), caules (banana), razes (batata-doce, maa, amora), folhas (begnia, espada-de-so-jorge), estacas (videiras) etc. As plantas obtidas por propagao assexuada ou vegetativa so idnticas planta-me e idnticas entre si. Em outras palavras, so clones. A capacidade de uma clula regenerar rplicas do organismo do qual ela deriva denominada totipotncia. Restringida em animais, esta propriedade caracterstica das plantas. Em funo das condies fisiolgicas e ambientais, as clulas vegetais seguem vias metablicas diferentes. A totipotncia permite a sobrevivncia das plantas superiores aps o ataque de herbvoros, pragas e patgenos ou em condies ambientais desfavorveis. As primeiras tentativas de cultura de tecidos vegetais em laboratrio datam de 1902, no entanto, a primeira experincia bem-sucedida a germinao in vitro de sementes de orqudea (Knudson, 1922). Transferidas assepticamente ao meio de cultura, e incubadas em condies favorveis, as sementes e mais tarde as plntulas se mantiveram protegidas do ataque de fungos e bactrias. Com algumas variaes, o mtodo usado ainda hoje por numerosos floricultores, porque, devido ao tamanho minsculo das sementes e ausncia de reservas nutritivas, as possibilidades de sobrevivncia das plntulas aps a germinao in vivo so muito baixas.

AS ETAPAS
Distintamente das experincias anteriores, a micropropagao se inicia a partir de explantes, isto , de pequenos fragmentos de tecido extrados de diversas partes da planta, tais como folhas, razes, segmentos nodais e gemas axilares, gemas florais e apicais (Figura 7.1).

Figura 7.1: As diversas partes de uma planta angiosperma

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Os explantes se cultivam assepticamente em meios de composio adequada, possibilitando a regenerao direta da planta. O processo envolve quatro etapas: 1. Estabelecimento de uma cultura assptica.
Uma vez retirados da planta-me, os explantes so desinfetados com um agente qumico, geralmente hipoclorito de sdio, que mais tarde lavado. Os explantes so transferidos para o meio de cultura, em condies asspticas semelhantes s utilizadas para a cultura de microrganismos (Figura 7.2). A incubao ocorrer a uma temperatura entre 23 e 28C, com iluminao durante 12 a 14 horas dirias. Os propgulos desenvolvidos so divididos e transferidos para um meio de multiplicao, de maneira a se obter numerosas subculturas (Figura 7.3).

2. Multiplicao.

3. Preparao das plntulas para a transferncia ao solo.


As plntulas das subculturas so transferidas para um meio de enraizamento onde, alm de desenvolver razes, enrijecem e comeam a fotossintetizar. Transferncia das plntulas, primeiro para o solo ou para algum outro substrato, mais tarde para uma casa de vegetao. Protegidas da iluminao solar direta, elas aumentaro sua capacidade fotossinttica adaptando-se lentamente as condies ambientais.

4. Aclimatao.

A capacidade de regenerao maior nas plantas herbceas que nas lenhosas, distribuindose em forma desigual entre algumas famlias de Solanceas, Crucferas, Gesnericeas, Compostas e Liliceas; depende tambm do gentipo e das condies ambientais, diminuindo com a idade da planta. A cultura in vitro tem a vantagem de ser mais rpida e de ocupar muito menos espao que a multiplicao in vivo. As principais aplicaes esto no cultivo de plantas ornamentais, de hortalias e na silvicultura.

Figura 7.2: O procedimento a seguir para se obter uma cultura assptica no laboratrio.

Figura 7.3: Micropropagao.


A micropropagao dos explantes nodais permite a obteno de numerosas subculturas.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 7: A cultura de clulas e tecidos

OS MEIOS DE CULTURA
O meio de cultura inclui gua, uma fonte de carbono, substncias inorgnicas (sais minerais), vitaminas, hormnios e fatores reguladores do crescimento (Ver Tabela 7.1). Alguns destes componentes podem ser substitudos por misturas pouco definidas, mais econmicas ou simples de manipular (gua de coco, suco de tomate, suco de laranja). Geralmente, o pH do meio varia entre 5,0 e 6,5. A composio do meio de cultura varia com as necessidades de cada espcie. O crescimento e a diferenciao celular so controlados modificando a proporo entre os hormnios e reguladores de crescimento. De um modo geral, se a proporo entre citocininas e auxinas for maior que 1, desenvolvem-se brotos, se for menor, razes e, se for igual, calos. A incubao ocorre a uma temperatura entre 23 e 28C, com 12 a 14 horas dirias de iluminao. Tabela 7.1: Os componentes do meio de cultura para clulas vegetais.

Componentes gua destilada Fonte de carbono

Caractersticas e exemplos Representa 95% do meio nutriente. Geralmente se utiliza sacarose. A fonte de carbono necessria porque os explantes no so totalmente autotrficos e a fotossntese in vitro no supre as necessidades das clulas. Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) e microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), em uma proporo que depende da planta escolhida. Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), cido nicotnico (niacina), vitamina B 6 (piridoxina), pantotenato de clcio, cido flico, vitamina B 2 (riboflavina), vitamina C (cido ascrbico), vitamina H (biotina), cido para-aminobenzoico e vitamina E (tocoferol). Auxinas Estas promovem o alongamento celular, a formao de calos e de razes adventcias; inibem a formao de brotos axilares adventcios e, s vezes, a embriognese em suspenses celulares. Exemplos: IAA (cido indolactico), NAA (cido naftalenoactico), IBA (cido indolbutrico), 2,4 D (2,4diclorofenoxiactico). Citocininas Estas promovem a diviso celular, regulam o crescimento e o desenvolvimento dos tecidos vegetais. Exemplos: cinetina, 2iP (2-isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), zeatina. Outras substncias Exemplos: giberelinas, cido abcssico, etileno.

Substncias inorgnicas Vitaminas

Hormnios e reguladores de crescimento

Misturas de substncias pouco definidas Materiais inertes

Exemplos: extrato de levedura, extratos vegetais, hidrolisados de casena, peptona e triptona. A tendncia atual em pesquisa de substitu-los por meios de composio definida. Utilizados como suporte. Exemplos: agar, agarose, outros polissacardeos (Gelrite, Phytagel), l de vidro, papel de filtro, areia, esponjas de poliestireno.

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AS DIFERENTES MODALIDADES
A cultura de meristemas A regenerao de uma planta pode ocorrer a partir de um rgo to pequeno quanto a gema apical (tamanho 0,5 a 2 mm). Nesta, associado aos primrdios foliares e ao tecido subapical, se encontra um pequeno fragmento (0,01 a 0,3 mm) de meristema, um tecido embrionrio a partir do qual se formam todos os outros tecidos das plantas. Por isso, a cultura da gema apical pode ser substituda pela cultura de meristemas (Figura 7.4). Estoques de plantas livres de vrus e de outros patgenos so obtidos associando a cultura de meristemas com a termoterapia, uma incubao a 32-340C, por um tempo determinado (gernio, dlia, crisntemo, cana-de-acar, batata, morangueiro, alcachofra etc.). Recuperam-se com este mtodo algumas plantas que s se reproduzem naturalmente pela via assexuada e se encontram ameaadas de extino devido contaminao por vrus. Os exemplos citados na bibliografia so, no mnimo, impressionantes. Se um tubrculo de inhame de 100 g produz 25 kg de tubrculos em dois anos, por micropropagao produzir 300.000 kg; a partir de uma nica gema apical podem-se obter 4.000.000 de cravos em um ano. A tcnica tambm permite a multiplicao de espcies que se reproduzem lenta e/ou dificilmente, como as orqudeas, e acelerar a produo de mudas em plantas com ciclo anual ou bianual. Outra variao desta modalidade a microenxertia, que se aplica s essncias florestais (eucalipto) e s rvores frutferas (citros). A tcnica gera uma alta produtividade de mudas sadias, que so cultivadas em pouco espao (mais de 1.000 plantas / m 2) sem depender dos fatores climticos e da poca do ano. Do ponto de vista econmico, o custo destas mudas alto porque a cultura em meio slido necessita um trabalho minucioso e uma mo de obra especializada. A multiplicao dos propgulos em biorreatores, anlogos aos fermentadores microbianos, visa reduzir os custos. Ao modelo tradicional de ps giratrias que danifica os tecidos e as clulas, preferem-se pequenas cubas de 1 a 5 l onde os propgulos permanecem em sistemas de imerso permanente ou temporria. Apesar dos custos, a tecnologia interessante quando se planeja introduzir uma espcie em uma regio determinada porque elimina qualquer contaminao prvia. Tambm interessante para iniciar a propagao vegetativa com mudas certificadas, visando a amplificao posterior dos cultivos.

Figura 7.4: A cultura de meristemas

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 7: A cultura de clulas e tecidos

A cultura de calos A cultura de calo a modalidade alternativa para aquelas plantas que no podem ser propagadas diretamente a partir de meristemas. Um calo uma massa de clulas desdiferenciadas que prolifera de maneira irregular a partir de um explante; trata-se de um tecido de tipo tumoral que, in vivo, produzido como resposta aos ferimentos em rgos e tecidos. Uma vez estabelecido em um meio de cultura, o calo pode ser subdividido a cada trs ou quatro semanas, mantendo indefinidamente as clulas em meio nutriente com a mesma composio. Se o calo for transferido a outro meio com uma concentrao diferente de hormnios, formar-se-o rgos ou embries, a partir dos quais podero ser regeneradas numerosas plantas (Figura 7.5). Diferentemente das outras modalidades de cultura de tecidos, na cultura de calos a proliferao celular est acompanhada por um aumento das variaes genticas e da instabilidade cromossmica (variao somaclonal). Devido a esta caracterstica, a cultura de calos resulta menos conveniente que a cultura de meristemas para micropropagao. Contudo, sua utilizao inevitvel no caso de algumas espcies economicamente importantes (cereais, leguminosas, forrageiras, espcies florestais e palmeiras tropicais). Por outro lado, a variao somaclonal permite a seleo de variedades de plantas com propriedades novas, tais como a resistncia ao estresse, ao ataque de insetos, a patgenos, a herbicidas, a concentraes salinas elevadas, a molculas qumicas (Al, Mn). A variabilidade pode ser aumentada pela utilizao de agentes mutagnicos.

Figura 7.5: As diferentes possibilidades dos cultivos de calos.

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A cultura de clulas e rgos vegetais em biorreatores Desagregando um calo em meio lquido se obtm uma suspenso de clulas que podem ser cultivadas em biorreatores industriais visando a produo de metablitos secundrios ou de embrioides. Os embrioides so embries formados a partir de clulas somticas. Podem ser encapsulados em uma substncia gelatinosa contendo nutrientes, envolta por um plstico biodegradvel, formando sementes artificiais. Estas se desenvolvem normalmente quando semeadas na terra, por isso uma das aplicaes desta tecnologia sua disperso por avies para o reflorestamento de regies de difcil acesso. Os metablitos secundrios, ou compostos naturais, so considerados produtos de Qumica Fina, tendo um alto valor agregado no mercado. Trata-se de alcaloides, de glicosdeos cardacos, de substncias antitumorais e antimicrobianas, de hormnios esteroides etc. para a indstria farmacutica e, tambm, de corantes, adoantes e aromas para as indstrias alimentcia e cosmtica. A possibilidade de substituir os mtodos tradicionais de extrao ou de sntese, pela produo mediante o cultivo de suspenses celulares em biorreatores, gerou grandes expectativas comerciais. No incio da dcada de 1990, vrios estudos estimaram as condies necessrias para que a sntese ou a bioconverso de compostos naturais em produtos de alto valor agregado resultasse vantajosa. Os clculos mostraram que se o mercado fosse suficientemente amplo e o valor do produto superasse os US$ 500 ou 1.000 por kg, a produtividade do sistema deveria ser de pelo menos um grama de composto por litro de cultura celular. Estas condies no so to frequentes. Do ponto de vista tecnolgico, as clulas vegetais so grandes (100 m) e sedimentam com facilidade. A tendncia a formar agregados as torna muito sensveis ao cisalhamento. Como o crescimento lento, os riscos de contaminao aumentam. Tambm existem problemas relacionados com a transferncia de oxignio. Existem diversos modelos de biorreatores para o cultivo de clulas vegetais, entre os quais o tradicional de ps giratrias e outros de tipo air-lift ou de leito fluidizado. A conduo do processo pode ser descontnua, semicontnua ou contnua; neste ltimo caso se utilizam clulas imobilizadas. A escolha de uma modalidade ou outra de cultivo depende da substncia estar, ou no, associada ao crescimento celular e, tambm, de se tratar de um produto intra ou extracelular. O cultivo de rgos e especialmente de razes transformadas (hair roots) tem dado bons resultados, apesar de poucos terem alcanado um nvel comercial. Entre eles, a produo de shikonina a partir de razes (Lithospermum erythrorhizon) pela empresa Mitsui Petrochemical Ind. Ltd.; de gingenosdeo (Panax ginseng) e de purpurina (Rubia akane) por Nitto Denko Corp.; e de paclitaxel (Taxos cuspidata), comercializado como Taxol por Phyton Inc., uma empresa associada a Bristol-Myers Squibb. Espera-se que as estratgias para aumentar a produo, combinando o desenvolvimento de novos processos industriais com a engenharia metablica das clulas, possam vir a estabelecer as bases de uma agricultura molecular. Por enquanto, as aplicaes se restringem produo de alguns frmacos e de aditivos para a indstria de alimentos (flavorizantes, corantes e aromas).

MELHORAMENTO E CONSERVAO DA BIODIVERSIDADE VEGETAL


Existem vrias modalidades de cultura de tecidos que contribuem para facilitar a tarefa de melhoramento (Figura 7.6) O mtodo gentico tradicional, isto , a autofecundao das plantas por vrias geraes, demora oito ou 10 anos para obter linhagens puras (homozigotas), em que se manifestem os caracteres recessivos. Esse tempo pode se reduzir a meses mediante a cultura de anteras, gerando-se plantas haploides (n cromossomos), que tratadas com colchicina originam diretamente plantas diploides (2n) homozigotas.

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Os protoplastos se formam por digesto enzimtica da parede celular, que poder ser regenerada novamente no meio de cultura. Durante o perodo em que a clula est sem a parede celular, pode-se introduzir material gentico estranho (transformao) ou conseguir a fuso de protoplastos de diferentes cultivares ou espcies (hibridizao somtica). Como as plantas resultantes destes cruzamentos geram sementes que dificilmente se desenvolvem, frequentemente necessrio retirar os embries do resto da semente e proceder a sua recuperao mediante a cultura in vitro. Protoplastos, clulas, calos, gemas apicais e laterais, meristemas, sementes, embries somticos e zigticos, todos podem ser congelados em nitrognio lquido a 1960C. A criopreservao facilita a preservao de numerosas plantas ornamentais, frutferas, oleaginosas, leguminosas, medicinais e aromticas. Finalmente, deve-se destacar a importncia destas tcnicas de cultura de clulas e tecidos vegetais para a conservao do germoplasma, tanto das espcies cultivadas como das espcies selvagens. A conservao da biodiversidade importante no s do ponto de vista do melhoramento agronmico como do farmacolgico, j que a maioria dos medicamentos de que dispomos contm princpios ativos extrados de plantas. Figura 7.6: As diferentes modalidades da cultura de clulas e tecidos vegetais.
Estas se constituem em uma ferramenta poderosa para o melhoramento e a conservao do germoplasma.

A DIFUSO DA TECNOLOGIA
As tcnicas de cultura in vitro de vegetais foram rapidamente assimiladas por empresas e instituies de pesquisa e desenvolvimento, porque facilitam o melhoramento gentico das variedades comerciais e, tambm, porque representam uma etapa indispensvel na obteno de uma planta transgnica. Sendo tcnicas de domnio pblico, relativamente simples e de baixo custo, numerosas empresas as utilizam no mundo todo para garantir a qualidade gentica e fitossanitria das mudas e sementes comercializadas. Em Cuba, por exemplo, o IBP (do espanhol, Instituto de Biotecnologia de las Plantas) tem desenvolvido, junto com outros centros cientficos, protocolos para batata, cana-de-acar, pltano, banana, goiaba, abacaxi, maracuj etc. O IBP est associado a uma rede de 15 biofbricas com capacidade de produzir 60 milhes de plntulas in vitro e sementes artificiais. A tecnologia est amplamente difundida na Amrica Latina, onde representa o segundo produto mais comercializado da biotecnologia agrcola, com ampla difuso na olericultura, na hortifruticultura, na floricultura e na propagao de plantas ornamentais, assim como na produo de plantas de interesse industrial (cana, caf) e de mudas de essncias florestais para as indstrias de papel.

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A CULTURA DE CLULAS ANIMAIS


A MANIPULAO IN VITRO DAS CLULAS ANIMAIS
Apesar dos primeiros estudos datarem de 1912, o cultivo de clulas animais s comeou a se desenvolver com sucesso na dcada de 1950, quando H. Eagle conseguiu definir os nutrientes necessrios para o crescimento celular. Basicamente, um meio para o cultivo de clulas animais inclui gua, sais minerais, aminocidos, vitaminas, glicose, soro de cavalo ou humano (fatores de crescimento), antibiticos (para prevenir as contaminaes microbianas). As clulas devem ser isoladas, inoculadas e mantidas assepticamente em condies bastante estritas de temperatura (350 a 370 C), pH e umidade.

Tabela 7.2: Os componentes de um meio de cultura bsico para clulas animais


Componentes gua Fonte de carbono Substncias inorgnicas L aminocidos Vitaminas Misturas de substncias pouco definidas Outros Caractersticas e exemplos Desmineralizada, destilada. Glicose. NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2. 6H2O, NaH2PO4.H2O, NaHCO3. Arginina, cistina, fenilalanina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptfano, tirosina, valina. Biotina, cido flico, colina, nicotinamida, cido pantotnico, piridoxal, riboflavina, tiamina. Soro animal de diversa origem, inclusive humano. Antibiticos (penicilina, estreptomicina) e vermelho de fenol (pH 7,2-7,4).

AS APLICAES DA CULTURA IN VITRO DE CLULAS DE MAMFEROS


Uma das primeiras aplicaes a cultura de linfcitos, que fornece em poucos dias um nmero adequado de clulas para a anlise do caritipo. Este visa detectar as alteraes cromossmicas estruturais e numricas que possam ser a causa de distrbios no funcionamento do organismo. Os linfcitos extrados do paciente so colocados em um meio lquido que induz a diviso celular. A adio de colchicina inibe a formao das fibras do fuso mittico, bloqueando as clulas na metfase. Um choque hipotnico provoca a lise das clulas e libera os cromossomos (Figura 7.7). Mas h outros tipos de clulas de mamferos que tambm se cultivam in vitro. Clulas isoladas a partir de fibroblastos ou de tecido epitelial se multiplicam na superfcie de um suporte inerte (vidro, plstico etc.), formando uma monocamada. Mediante a transferncia de algumas clulas a um meio novo (repiques), uma cultura primria gera sucessivas culturas secundrias (Figura 7.8). Entretanto, diferena dos microrganismos que podem ser repicados indefinidamente, as clulas animais sofrem um tipo de morte programada (apoptose) depois de aproximadamente umas cinquenta a cem divises. Deve-se ento reiniciar o cultivo com uma nova amostra. Existem algumas excees que escapam dessa limitao, como as clulas extradas de tumores ou as clulas-tronco; e tambm os linfcitos B imortalizados por infeco com o vrus de Epstein-Barr ou por fuso com clulas de mieloma (hibridomas).

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 7: A cultura de clulas e tecidos

Figura 7.7: As etapas da cultura de leuccitos para a anlise do caritipo.

Figura 7.8: As etapas da cultura de clulas a partir de um fragmento de tecido.

Nas Colees de Culturas se encontram linhagens celulares de diversos tipos, conservadas por criopreservao (Tabela 7.3). A cultura in vitro de clulas animais a rota seguida para a manufatura em grande escala de vrios produtos, tais como as vacinas e os anticorpos monoclonais. Tambm adequada para a produo de citocinas (linfocinas, interferons, eritropoietina) e de outras protenas de origem recombinante (fator ativador de plasminognio, p.ex.) que, por exigir modificaes ps-traducionais complexas, no podem ser produzidas em bactrias ou leveduras transformadas.

Tabela 7.3: Origem e utilizao de algumas linhagens celulares.

Clulas HeLa(*) MDCK 3T3 Nawalwa WI-38 VERO MRC-5

Origem Carcinoma cervical humano Rim de cachorro Tecido conjuntivo de camundongo Linfoma humano Pulmo embrionrio humano Rim de macaco verde africano Pulmo embrionrio humano

Aplicaes Pesquisa Produo de vacinas veterinrias Tcnicas laboratoriais -interferon Produo de vacinas humanas Produo de vacinas humanas Produo de vacinas humanas

(*) Henrietta Lacks, morreu aos 31 anos de um carcinoma uterino. A linhagem de clulas HeLa isolada na poca continua sendo cultivada h mais de 50 anos.

Na hora de passar da escala do laboratrio escala industrial, algumas consideraes devem ser levadas em conta. A cultura de clulas animais exige, alm de um cuidado extremado, meios de cultivo complexos e caros, desenvolvendo-se em condies muito rigorosas. Como as clulas se dividem lentamente (a cada 20 horas aproximadamente), a assepsia deve ser mantida durante perodos prolongados. As concentraes celulares so baixas, o que diminui a produtividade e a rentabilidade do processo. A demanda de oxignio alta e as clulas so muito frgeis e sensveis ao cisalhamento.

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Enquanto algumas clulas podem crescer livremente em suspenso, como os linfcitos, outras s crescem se houver um suporte. No biorreator, este problema pode ser resolvido de diversos modos: mediante o confinamento das clulas dentro de membranas semipermeveis, imobilizao em gis ou cpsulas ou fixao sobre suportes, tal como pequenas partculas de 100 a 400 m em vidro, plstico ou dextrina (Figura 6.8). Biorreatores de tamanho pequeno (at 15 l) e processos descontnuos apresentam menos problemas de contaminao, j os de maior tamanho (at 1.000 l) exigem a substituio da agitao mecnica por sistemas de tipo air lift ou leito fluidificado. Evita-se a apoptose ou morte celular renovando periodicamente parte do meio para retirar os produtos excretados. Nos ltimos anos, as tcnicas de cultura in vitro de clulas animais deram um amplo impulso s pesquisas bsicas e aplicadas, aos testes de diagnstico, s tcnicas de fertilizao in vitro, produo de compostos biolgicos (protenas recombinantes), de tecidos para transplante e de vacinas para uso humano e veterinrio. Nos estudos toxicolgicos, esta tecnologia substitui, ao menos parcialmente, a experimentao com animais, uma atividade que suscita forte resistncia na sociedade devido aos questionamentos ticos levantados. Estima-se que o mercado gerado pela venda de meios de cultivo, soros e reagente chegar a US$ 1,86 bilho em 2010.

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CAPTULO 8. A TECNOLOGIA DO DNA


AS FERRAMENTAS DISPONVEIS
A tecnologia do DNA engloba uma srie de procedimentos para extrair, fragmentar, sintetizar, marcar, identificar, amplificar e sequenciar o DNA. Estas tcnicas foram desenvolvidas ao longo de uma dcada (1985-1995), constituindo hoje um conjunto de ferramentas que utilizado rotineiramente nos laboratrios, geralmente em sistemas automatizados especialmente desenhados para efetuar rapidamente um nmero altssimo de operaes. A extrao de DNA um procedimento relativamente simples. De um modo geral, a quebra de paredes e membranas libera o contedo celular, do qual se eliminam o RNA e as protenas antes de separar o DNA, que se precipita com etanol. Uma vez extrado e purificado o DNA, diversos tipos de tratamento so possveis. Pelo menos uma trintena de empresas j comercializa diferentes tipos de kits para a extrao de cidos nucleicos, substituindo os protocolos tradicionais por sistemas mais fceis de automatizar. Estima-se que este mercado alcance um valor de US$ 158 bilhes, em 2014.

AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIO


Entre as numerosas enzimas utilizadas diariamente nos laboratrios, as nucleases merecem ateno especial. Estas enzimas quebram as ligaes entre os nucleotdeos de uma cadeia de DNA; algumas comeam pelas extremidades eliminando-os um a um; outras cortam a molcula por dentro. Pertencem a este ltimo grupo as enzimas de restrio, que so capazes de cortar o DNA em stios especficos. Normalmente, as enzimas de restrio so produzidas por bactrias, como uma arma de defesa contra o ataque de vrus (bacterifagos), j que ao cortar o DNA viral impedem sua multiplicao. O DNA bacteriano no atacado por suas prprias enzimas, seja porque no possui as sequncias correspondentes, seja porque estas esto camufladas pela adio de um grupo metila. Desde sua descoberta por Werner Arber, na dcada de 1960, j foram isoladas centenas de enzimas de restrio. Todas elas agem como tesouras qumicas que cortam o DNA ao reconhecer, como os seus pontos-alvo, determinadas sequncias de 4 a 8 bases. Por exemplo, a enzima EcoRI, cujo nome deriva de "Escherichia coli linhagem RY13 (R), primeira endonuclease a ser descoberta I" corta o DNA em dois pedaos com pontas lascadas:

As setas indicam o ponto de corte. Observe-se a existncia de um palndromo, isto de uma sequncia que pode ser lida do mesmo modo nos dois sentidos (5- 3 ou 3- 5), de forma anloga a frases como Amor a Roma. Assim como h enzimas que cortam o DNA, outras colam os fragmentos (ligases).

A ELETROFORESE DO DNA
A eletroforese separa os fragmentos de DNA obtidos com uma enzima de restrio. As amostras so colocadas em um gel no qual se aplica um campo eltrico. Os fragmentos de DNA carregados negativamente se movimentam na direo do plo positivo. Ao encontrar uma resistncia menor, os fragmentos menores migram mais rapidamente (Figura 8.1).

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Figura 8.1: A eletroforese do DNA.

O poder de separao varia com o suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida) e com o tamanho do poro, que depende da concentrao do meio. Tambm varia com as caractersticas do campo eltrico aplicado. Os fragmentos de restrio formam bandas que podem ser observadas na luz ultravioleta, aps colorao com uma substncia fluorescente. Fragmentos de tamanho conhecido inseridos no gel, maneira de uma rgua molecular, servem como padro de comparao para estimar o tamanho das bandas do DNA analisado. Uma das primeiras aplicaes da eletroforese dos fragmentos de restrio foi o estudo dos polimorfismos. A modificao do stio de restrio de uma molcula de DNA (como, por exemplo, de GAATTC para GAACTC) origina fragmentos de tamanhos diferentes, denominados RFLPs ou rifleps (do ingls, restriction fragment length polymorphism). Os RFLPs so marcadores que podem ser estudados do mesmo modo que um gene que determine um carter visvel ou uma modificao bioqumica (Figura 8.2). Figura 8.2: Polimorfismos de restrio.
Uma mutao pode gerar dois alelos diferentes, A 1 (nenhum stio de restrio) e A 2 (um stio de restrio). Na eletroforese, o DNA dos indivduos A 1A1 ser visualizado como uma banda, o de A 1A2 como trs bandas e o de A 2A2 como duas bandas.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 8: A tecnologia do DNA

HIBRIDIZAO E SONDAS GNICAS


Quando o DNA colocado em determinadas condies de temperatura, pH ou concentrao salina, os dois filamentos da hlice se separam. A dissociao se deve quebra das pontes de hidrognio entre as bases complementares. Voltando s condies iniciais, essas ligaes se restabelecem e os filamentos se associam novamente. A reao de hibridizao tambm ocorre entre filamentos de DNA ou de RNA de diferentes origens e tamanhos, sempre que houver algumas sequncias complementares. Em funo desta propriedade se constroem filamentos simples, geralmente marcados radiativamente, de DNA ou RNA de sequncia conhecida. Estes se usam como sondas para reconhecer a presena de uma sequncia complementar em um cromossomo ou em um fragmento de DNA (Figura 8.3).

Figura 8.3: Hibridizao de uma sonda com a sequncia complementar.

A TCNICA DE SOUTHERN
Em 1975, E.M. Southern descreveu um mtodo para analisar fragmentos de restrio, utilizando sondas de DNA. Uma vez separados os fragmentos por eletroforese, transferem-se os fragmentos a uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. A hibridizao de uma sonda radiativa com o seu alvo registrada em um filme apropriado (Figura 8.4). O mtodo, denominado Southern blotting, tem sido utilizado para diagnstico de doenas genticas, algumas das quais so causadas por mutaes que, ao eliminar ou criar um stio de restrio, modificam o padro de bandas. Mtodos anlogos foram desenhados para estudos de RNA (Northern blotting) e de protenas (Western blotting). Observe-se que, no primeiro caso, a sonda pode ser um fragmento de cido nucleico, mas no segundo a sonda um anticorpo especfico.

O FINGERPRINT
Descrita por A. Jeffreys em 1985, uma variante do mtodo de Southern focaliza as regies do genoma que no se expressam, acumulando mutaes que conferem a cada indivduo uma sequncia nica (excetuando-se os gmeos). Muitas delas representam sequncias repetidas que esto dispersas ao longo do genoma. Denominadas VNTR ou vinters (do ingls variable-number tandem repeats) estas sequncias se repetem um nmero de vezes que pode variar de um cromossomo ao seu homlogo. Sendo assim, os fragmentos de restrio correspondentes tero um tamanho diferente, o que pode ser visualizado por eletroforese (Figura 8.5). Ao aumentar o nmero de sondas para o reconhecimento de outros tipos de VNTRs, obtmse um padro de bandas individual, parecido com o cdigo de barras do comrcio. Assim como as impresses digitais identificam as pessoas, as sondas revelam a identidade gentica de cada um de ns. O procedimento, no por acaso chamado de Fingerprint, encontrou rpida aplicao tanto na investigao de paternidade (ou maternidade), como na identificao policial ou forense.

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Figura 8.4: O mtodo de Southern.


A sonda identifica a homozigose de I (sem stio de restrio) e de III (com stio de restrio) e a heterozigose de II (um filamento sem stio de restrio e o outro com stio de restrio).

Figura 8.5: Os polimorfismos de VNTRs.

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A SNTESE E AMPLIFICAO DE DNA


SNTESE DE OLIGONUCLEOTDEOS
A sntese de oligonucleotdeos de DNA e RNA se desenvolve hoje em mquinas automatizadas (sintetizadores) capazes de construir, em poucos minutos, molculas com dezenas de pares de bases (Figura 8.6). Estes oligonucleotdeos podem ser utilizados como sondas ou como primers para a PCR (ver um pouco mais adiante). Figura 8.6: A sntese de oligonucleotdeos.

SNTESE DE cDNA
Uma enzima de origem viral transcreve a informao gentica no sentido RNA DNA. Esta enzima, denominada transcriptase reversa, normalmente garante aos vrus com genoma de RNA sua multiplicao no hospedeiro (como o HIV, por exemplo). O rRNA e os tRNAs podem ser isolados facilmente devido a seu tamanho; o mRNA, por sua vez, deve ser isolado dos tecidos onde se expressa. O mRNA da protena da seda ou fibrona, por exemplo, se extrai das glndulas salivares do bicho-da-seda. Como ferramenta de laboratrio, a transcriptase reversa possibilita a construo de filamentos de DNA complementares (cDNA) a qualquer molcula de RNA (Figura 8.7). Notese que, diferente do gene original, no haver ntrons no cDNA reconstrudo a partir de RNA. Figura 8.7: A sntese de cDNA por transcriptase reversa.

A REAO EM CADEIA DA POLIMERASE

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A reao em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction ou PCR) um procedimento que permite obter milhes de cpias de DNA em poucas horas (Figura 8.8). Para isso, se precisa do DNA que contenha a sequncia que se deseja amplificar, de desoxinucleotdeos dos quatro tipos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP), de uma polimerase de DNA e dos primers correspondentes. Estes so pequenos fragmentos sintticos de DNA, complementares s extremidades da sequncia-alvo, sendo indispensveis para que a polimerase comece a sintetizar o filamento de DNA. A chave do processo a DNA-polimerase, uma enzima estvel a altas temperaturas que permite bactria Thermus aquaticus sobreviver em guas termais. Atualmente, esta enzima se produz por engenharia gentica. Em um ciclo pontuado por mudanas de temperatura, os filamentos de DNA so dissociados e anelados com os primers, possibilitando que a polimerase sintetize o resto da sequncia. Repetindo muitas vezes o ciclo, gera-se em pouco tempo um nmero altssimo de cpias que podem ser utilizadas em qualquer tipo de anlise. Uma das grandes vantagens da PCR que no h necessidade de isolar previamente o fragmento a ser amplificado, bastando conhecer as extremidades da sequncia e escolher os primers adequados. Desenvolvendo-se de forma totalmente automatizada, o procedimento admite mltiplas variantes. A empresa Cetus comprou de seu inventor, K. Mullis, a patente da PCR por U$S 10.000, vendendo-a pouco tempo depois a Hoffmann-LaRoche por U$S 300 milhes; hoje se trata de uma tcnica corriqueira em qualquer laboratrio de Biologia Molecular e provavelmente nenhum dos dois fez um bom negcio. Mais tarde, em 1993, K. Mullis recebeu o Prmio Nobel pela inveno da PCR. Como assinalado anteriormente em relao aos sintetizadores de oligonucleotdeos, uma das chaves do xito da PCR o fato de ser um procedimento automatizado que se desenvolve em mquinas rpidas e eficientes, resultado da integrao da Biologia Molecular com a Informtica e a Eletrnica. O sucesso da PCR se deve a sua extraordinria versatilidade, permitindo que seja utilizada, com objetivos diversos, em campos to diferentes como a agricultura, a medicina veterinria, os estudos ambientais, os testes de diagnstico e a medicina forense. Entre suas muitas aplicaes, cabe citar tambm os estudos antropolgicos e evolutivos, tais como a extrao de ADN de mmias egpcias, de animais extintos como o quagga (um tipo de zebra) ou de insetos presos em mbar 40 milhes de anos atrs.

Figura 8.8: A reao em cadeia da polimerase.


Uma mquina de PCR pode desenvolver 25 ciclos em menos de uma hora, amplificando 10 5 vezes o fragmento de DNA.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 8: A tecnologia do DNA

O SEQUENCIAMENTO DO DNA
Desenvolvido por F. Sanger em 1977, o sequenciamento de um fragmento de DNA , tambm, um procedimento de tipo iterativo, possibilitando a construo de mquinas capazes de realizar rapidamente a tarefa (Figura 8.9). Existem sequenciadores automatizados em que o gel colocado nos capilares por um braorob que acrescenta o DNA e efetua a limpeza depois da eletroforese. No ano 2000, tais braos permitiam o tratamento de uma centena de amostras em 4 horas, sem exigir mais do que 15 minutos dirios de ateno humana. Uma vez determinada a sequncia de vrias amostras, inicia-se a montagem da informao armazenada nos bancos de dados. Esta etapa se realiza em supercomputadores, exigindo um tratamento matemtico para ordenar as sequncias, preencher as lacunas e verificar os dados. Calculava-se que, no auge do estudo do genoma humano, uma empresa ligada a Celera (Biosystems Applied) mantinha os computadores funcionando dia e noite, chegando a gastar U$S 1.000.000 mensais com eletricidade. As tcnicas de sequenciamento esto evoluindo muito rapidamente (pirossequenciamento). Os mtodos atuais so 500 vezes mais rpidos que os da dcada passada, tendo cado o custo por par de bases sequenciado de US$ 25, em 1990, a US$ 0,00075, em 2006.

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Figura 8.9: O sequenciamento de um fragmento de DNA.


Um sistema automatizado permite identificar, na corrida eletrofortica, cada um dos quatro didesoxinucleotdeos, fornecendo diretamente a sequncia do fragmento sequenciado.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 8: A tecnologia do DNA

OS ARRAYS
Em consequncia do conhecimento acumulado sobre o genoma do homem e de outros organismos, j podem ser estudados alguns aspectos relacionados com a expresso e a interao dos genes. Lidar com um nmero enorme de informaes demanda novos avanos tecnolgicos, entre os quais a construo de chips de DNA e microarrays. Os microchips so pequenas placas de vidro, nilon ou slica com centenas de sondas por cm2, fixadas mediante diferentes tecnologias (robtica, fotolitografia). Coloca-se a amostra, marcada com um corante fluorescente, sobre a placa; as molculas complementares a alguma das sondas ficaro grudadas, as restantes sero eliminadas na lavagem posterior. Os pontos onde ocorreu a hibridizao so identificados por varredura com um raio laser e um software apropriado para o tratamento da informao (Figura 8.10).

Figura 8.10: Fundamentos da tecnologia de arrays.


Se as sondas representarem ESTs, saberamos que os genes representados por B7, C2, D4, E10, G8 e H5 esto ativados. O tamanho das sondas depende da tecnologia utilizada na construo do array. Observe-se que cada uma das sondas representadas no desenho corresponde a um conjunto de molculas semelhantes.

Escolhem-se as sondas entre os genes codificadores de protenas que se expressam na clula. Desse modo, se excluem os genes que correspondem ao rRNA, aos tRNAs, s sequncias de controle e ao DNA extragnico. A escolha de sequncias transcritas, denominadas ESTs (do ingls, expressed sequence tags), aumenta as chances de detectar os genes que participam de alguma resposta patolgica.

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Atualmente, a tecnologia utilizada para diversos tipos de anlise de DNA e RNA, como, por exemplo: Determinar quais os genes ativados em um tecido, em um momento do desenvolvimento ou em um estado fisiolgico, como o sono. Comparar as sequncias de dois alelos, um deles normal e o outro associado a alguma patologia. Determinar qual o medicamento adequado para um paciente. Prever o risco de uma pessoa adoecer se ela for exposta a determinada substncia etc.

Numerosas empresas fabricam arrays comercialmente; algumas estimam que em pouco tempo sero construdos arrays do tamanho de uma moeda, contendo todo o genoma humano. difcil prever os alcances desta tecnologia to promissora, mas os analistas estimam que, at 2012, o mercado chegar a 1,47 bilho de dlares por ano.

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CAPTULO 9. A ENGENHARIA GENTICA


O NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA
A Gentica e a Biologia Molecular se desenvolveram rapidamente ao trmino da Segunda Guerra Mundial. Em um perodo de 25 anos, foram esclarecidos temas de enorme importncia: a estrutura dos cidos nucleicos, o cdigo gentico, a ao dos agentes mutagnicos, a gentica dos microrganismos, a estrutura e a sntese das protenas, a regulao gnica etc. nesse contexto de rpidos avanos que devemos situar as primeiras experincias que deram origem tecnologia do DNA-recombinante, tambm chamada de engenharia gentica. A utilizao da palavra recombinante nos remete recombinao gnica, um fenmeno que ocorre normalmente durante a meiose, devido permuta de fragmentos cromossmicos homlogos. Mediante o corte e a unio de pequenos pedaos de DNA, a engenharia gentica cria novas combinaes de genes, pertencentes ou no a indivduos de uma mesma espcie. A engenharia gentica um instrumento valioso para o estudo dos genomas, a produo de protenas em organismos modificados geneticamente e a gerao de organismos transgnicos com propriedades novas.

AS PRIMEIRAS EXPERINCIAS
Em 1972, na Universidade de Stanford (Califrnia), Paul Berg conseguira associar o DNA de dois microrganismos diferentes, formando uma molcula mista de DNA. Na mesma Universidade, Stanley Cohen especializava-se na biologia dos plasmdeos microbianos, pequenas molculas de DNA circular, portadoras de alguns genes capazes de se replicar de maneira autnoma. E, na Universidade de Califrnia (San Francisco), Herbert Boyer isolava a primeira das enzimas de restrio que corta o DNA em fragmentos com pontas lascadas, uma caracterstica que simplifica a tarefa de associar (colar) os pedaos. S. Cohen e H. Boyer se encontraram em uma conferncia cientfica no Hava. A ideia de uma colaborao entre ambos teria surgido uma noite, diante da praia de Waikiki, em redor de sanduches e cervejas. As experincias conjuntas comearam assim que eles regressaram a seus laboratrios em San Francisco. Boyer dispunha da enzima de restrio EcoRI, Cohen de dois plasmdeos, um deles com um gene de resistncia a kanamicina (pSC102) e o outro com um gene de resistncia tetraciclina e um stio de restrio para EcoRI (pSC101). Na primeira experincia, os pesquisadores abriram o pSC101 e inseriram fragmentos do pSC102, utilizando a enzima de restrio e uma ligase como tesoura e cola. A seguir, eles introduziram este plasmdeo quimrico na bactria Escherichia coli. A seleo de clones resistentes a ambos antibiticos (tetraciclina e kanamicina) mostrou o sucesso do experimento (Figura 9.1). Boyer e Cohen repetiram a experincia, mas em vez de inserir no plasmdeo um pedao de DNA bacteriano, eles planejaram colocar um fragmento de DNA do sapo Xenopus laevis. Com esse objetivo, selecionaram um gene codificador de rRNA no DNA do sapo e o inseriram no plasmdeo pSC101. Introduzido o plasmdeo recombinante na bactria Escherichia coli, esta comeou a sintetizar rRNA de Xenopus (Figura 9.2). A extraordinria novidade do experimento est na transferncia de genes de uma espcie para outra bem distante na escala evolutiva; um fenmeno limitado na natureza a uma mesma espcie ou a espcies muito prximas.

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Figura 9.1: A experincia que deu origem engenharia gentica: cortar, colar, copiar.

Legenda T: tetraciclina, Ts: sensvel tetraciclina, Tr: resistente tetraciclina, K= kanamicina, K s: sensvel kanamicina, Kr: resistente kanamicina, pSC101: plasmdeo de Stanley Cohen n0 101; pSC102: plasmdeo de Stanley Cohen n0 102.

Figura 9.2: Sapobacter ou Bactosapo?


Com a entrada de um plasmdeo recombinante, com DNA de Xenopus, em uma bactria, esta passa a sintetizar algumas molculas caractersticas de Xenopus.

Fragments of amplified Xenopus laevis DNA, coding for 18S and 28S ribosomal RNA and generated by EcoRI restriction endonuclease, have been linked in vitro to the bacterial plasmid pSCl01; and the recombinant molecular species have been introduced into E. coli by transformation. These recombinant plasmids, containing both eukaryotic and prokaryotic DNA, replicate stably in E. coli. RNA isolated from E. coli minicells harboring the plasmids hybridizes to amplified X. laevis rDNA. Extrado de: Replication and Transcription of Eukaryotic DNA in Escherichia coli (MORROW J.F., COHEN S.N., CHANG A.C. Y., BOYER H.W., GOODMAN H.M.E R.B. HELLING. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71:5, 1974

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 9: A engenharia gentica

MITOS E REALIDADE
As infinitas possibilidades da tecnologia do DNA-recombinante despertaram alguns dos antigos mitos. Por desobedecer a Zeus, entregando o fogo ao homem, Prometeu sofreu o terrvel castigo de ser acorrentado a uma montanha e ter o fgado devorado por uma guia. Instrumento da vingana divina, Pandora abrira a caixa da qual saram todos os males da humanidade. A ambiguidade da nova biotecnologia, com os seus desafios e promessas, costuma ser representada nas duas faces de Janus, um rei com o dom de ver simultaneamente o passado e o presente. Em 1974, Paul Berg e mais nove pesquisadores publicaram uma carta nas revistas cientficas Science, Nature e Proceedings of the National Academy of Science, alertando os colegas sobre os possveis riscos da nova tecnologia e pedindo uma moratria sobre os experimentos com DNA, at serem estabelecidos os cuidados e salvaguardas necessrias. Considerando que o uso desta tecnologia apresenta vrios riscos possveis porque novos tipos de organismos, alguns deles potencialmente perigosos, podem ser introduzidos no ambiente, se no existirem os devidos controles, o National Institute of Health (NIH) formou o Recombinant DNA Advisory Committee (RAC). Em 1975, a conferncia de Asilomar (Monterrey, Califrnia), reunindo 139 pesquisadores de 17 pases, classificou os experimentos em funo do risco (baixo, mdio ou alto), pedindo a suspenso dos experimentos de alto risco enquanto no se determinassem quais as formas de conteno adequadas, tanto fsicas como biolgicas. Enfatizava-se tambm a necessidade de trabalhar com microrganismos enfraquecidos, incapazes de sobreviver fora do laboratrio. Em 1976, o RAC publicou um conjunto de normas de trabalho que, alm de revisadas periodicamente, devem ser seguidas por todos os pesquisadores e instituies que recebam dinheiro do NIH para pesquisas com DNA-recombinante. Com base nos trabalhos publicados em 1973, a Universidade de Stanford obteve uma patente que lhe rendeu U$S 300 milhes, divididos com a Universidade da Califrnia em San Francisco. A Universidade de Stanford licenciou o uso da tecnologia a mais de 400 empresas, entre as quais Amgen, Eli Lilly, Genentech, Johnson & Johnson e Schering Plough. Qual o invento patenteado? O processo ou ferramenta biotecnolgica que consiste em inserir um DNA exgeno em um plasmdeo bacteriano e este em uma bactria, que se transforma assim em uma fbrica capaz de reproduzir esse gene em quantidades ilimitadas. Nesta breve recapitulao do nascimento da Biotecnologia moderna, vale destacar a preocupao com a segurana, mostrada oportunamente pelos pesquisadores e as instituies cientficas envolvidas. No h na histria da cincia ou da tecnologia um episdio de responsabilidade coletiva comparvel ao da Conferncia de Asilomar. Paralelamente a sua explorao comercial, a engenharia gentica utilizada atualmente em centenas de laboratrios de universidades e institutos de pesquisa. E mais de trinta anos depois no h registro ou relato de nenhum acidente relacionado com essa tecnologia. Talvez valha a pena lembrar que Prometeu foi liberado depois de 30 anos, e que bem no fundo da caixa de Pandora estava a esperana.

AS BIBLIOTECAS DE GENES
O enorme tamanho de um genoma dificulta tanto o mapeamento como a localizao de um gene. Uma forma de facilitar a manipulao extrair o DNA de um organismo determinado, cort-lo com enzimas de restrio, inserir os fragmentos em plasmdeos e introduzir os plasmdeos recombinantes em bactrias. Cada bactria formar um clone e cada clone levar um fragmento do genoma do organismo estudado. O conjunto de clones representa o genoma inteiro de um organismo, constituindo uma biblioteca genmica (Figura 9.2). Boa parte do DNA lixo e no leva genes. Por isso, um procedimento alternativo a montagem de uma biblioteca gnica, incluindo exclusivamente os genes que se expressam, ou seja, os genes responsveis pela sntese de protenas. Separa-se o mRNA codificador, e, com a enzima transcriptase reversa, se constroem as molculas correspondentes de cDNA. Inserem-se estas em plasmdeos, e os plasmdeos em bactrias. Com este procedimento, obviamente, o nmero de clones na biblioteca ser menor (Figura 9.2).

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Figura 9.2: A construo de bibliotecas de genes.


A triagem dos clones pode ser feita reconhecendo a "etiqueta" representada por uma sequncia conhecida no DNA (STS, ou sequence tagged site; ESTs, ou expressed sequence tagged); no caso do gene se expressar, a triagem tambm pode ser feita com anticorpos especficos para a protena sintetizada.

De fato, o nmero de clones depende no s do nmero de genes como do tamanho do fragmento que o vetor pode carregar. Como os plasmdeos bacterianos e o bacterifago s transportam fragmentos pequenos de DNA de 10 kb a 20 kb, outros vetores genticos foram especialmente desenhados para carregar fragmentos maiores (cosmdeos, YACs ou yeast artificial cromossomes, BACs ou bacterial artificial chromossomes, transposons etc.). A construo de bibliotecas de genes representa o primeiro passo para o mapeamento de um genoma. Ao sequenciamento dos fragmentos segue a montagem da informao. Trata-se de uma etapa complexa em que se alinham as sequncias, se preenchem lacunas e se verificam os dados. O tratamento matemtico das informaes demanda algoritmos sofisticados e computadores poderosos. Uma vez organizada a sequncia, esta armazenada em bancos de dados. O usurio tem acesso atravs da Internet, mediante programas especializados que acumulam uma enorme quantidade de informaes.

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A CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE


Uma das primeiras protenas de origem recombinante foi a somatotropina ou hormnio de crescimento. Como a enzima de restrio eliminava do cDNA, alm da sequncia codificadora do peptdeo-guia, os nucleotdeos correspondentes aos primeiros aminocidos da molcula, estes tiveram que ser acrescentados quimicamente, em um processo extremamente engenhoso (Figura 9.3). A transferncia de um gene de uma espcie permite obter microrganismos que sintetizem alguma substncia diferente, geralmente visando o cultivo em grande escala. O gene de interesse costuma ser selecionado e estudado na bactria de laboratrio Escherichia coli e, posteriormente, transferido espcie na qual se pretende produzir a protena correspondente. Alm de Escherichia coli e de Saccharomyces cerevisiae, existem vrios outros microrganismos que so habitualmente utilizados como hospedeiros: Bacillus subtilis, Picchia pastoris, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa etc. Estes microrganismos so utilizados na produo de frmacos (insulina, hormnio de crescimento, vacinas) ou de enzimas (quimosina) e, tambm, na degradao de poluentes.

Figura 9.3: A produo de somatotropina por engenharia gentica.

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ENCONTRAR O GENE
De um modo geral, encontrar um gene equivale a procurar agulha em palheiro. O gene pode ser localizado por triagem dos clones de uma livraria gnica ou genmica (Figura 9.2). Se esta no existir, pode ser necessrio constru-la, em uma primeira rodada de clonagem, para encontrar o gene de interesse. A segunda dificuldade est na obteno de numerosas cpias desse gene. Uma soluo a multiplicao do clone correspondente e posterior isolamento do gene procurado. Outra a amplificao do gene mediante a PCR, sempre que se conheam as sequncias iniciais e finais ou, eventualmente, as sequncias adjacentes regio onde est inserido. Se a sequncia do gene for conhecida e relativamente curta, podem-se construir cadeias curtas de oligonucleotdeos e associ-las, formando um gene sinttico que ser amplificado por PCR. Existem numerosas estratgias, que dependem do caso e, tambm, das caractersticas e possibilidades do laboratrio (Figura 9.4). Seja qual for o caminho seguido, uma vez que as cpias do gene de interesse forem obtidas, estas tero que ser transferidas ao hospedeiro definitivo. Figura 9.4: Algumas estratgias possveis de clonagem.

INSERIR O GENE
Vetores de expresso gnica

A transferncia de um fragmento estranho de DNA se v facilitada pela utilizao de vetores. Um vetor uma molcula de DNA que se duplica de maneira autnoma dentro de uma clula, carregando vrios genes, entre os quais alguns marcadores que permitam reconhecer sua presena dentro da clula. no vetor que ser inserido o fragmento de DNA estranho, para multiplicao ou integrao no genoma. Alm dos plasmdeos (bacterianos e de leveduras) e os bacterifagos (, m13), tambm se utilizam como vetores os transposons, que so elementos genticos mveis capazes de pular de um lugar a outro do genoma, espalhando ou no cpias. Construdos em funo das necessidades, existem hoje vetores bacterianos, vetores de leveduras e vetores bifuncionais que podem ser utilizados tanto em bactrias como leveduras.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 9: A engenharia gentica

As primeiras experincias de Engenharia Gentica foram feitas na bactria Escherichia coli, um microrganismo muito conhecido e fcil de se cultivar no laboratrio. Porm, Escherichia coli no o organismo ideal para a expresso de genes eucariticos. Clulas procariticas e eucariticas diferem em relao ao processamento do mRNA e s modificaes das protenas depois da traduo. Por este motivo, quando se procura expressar genes de mamferos, Escherichia coli substituda por outras clulas eucariticas, como a levedura Saccharomyces cerevisiae, um fungo utilizado h sculos na produo de alimentos e bebidas. Para que um gene se expresse em uma clula hospedeira, necessrio que esta reconhea seus prprios sinais de expresso. Para poder sintetizar uma protena exgena, a clula dever ler a sequncia codificadora com seus prprios sinais de transcrio (promotor) e de traduo (stio de ligao com o ribossomo, trmino de leitura). O ideal construir um vetor que j contenha os genes marcadores para seleo ou reconhecimento, os stios de restrio, uma sequncia promotora e os sinais adequados de incio e fim da transcrio. Ao colocar a sequncia codificadora da protena, o vetor funciona como um cassete de expresso (Figura 9.5). Outros fatores adicionais intervm na construo de um vetor de expresso. Um promotor forte, por exemplo, permitir sintetizar uma quantidade grande de protena, o que ser interessante comercialmente se esta for uma enzima. Entretanto, se a protena em questo for uma toxina que possa afetar o hospedeiro, ser prefervel escolher um promotor fraco. Uma possibilidade interessante a utilizao de um promotor que responda a um fator externo controlvel (substrato, temperatura), de maneira tal que o gene possa ser ligado ou desligado no momento que se considere conveniente. Finalmente, tambm deve ser considerado o destino da protena dentro da clula; se esta for secretada haver que acoplar na construo gnica um gene de sinalizao, que a leve at a membrana celular. Transformao e transfeco Existem diversos mtodos para inserir o DNA recombinante dentro da clula. Facilita-se a entrada do DNA com algumas manipulaes, tais como a adio de CaCl 2 no meio e/ou a modificao da temperatura. A aplicao de foras eltricas tambm aumenta as chances do DNA penetrar na clula, ao abrir os poros da membrana (eletroporao). Os plasmdeos atravessam a membrana celular em um processo denominado transformao, que ocorre em determinadas condies fisiolgicas da clula hospedeira. Em se tratando de vetores virais, a infeco da clula promove a entrada do DNA exgeno dentro da clula. Fala-se neste caso de transfeco (transformao + infeco). Figura 9.5: A estrutura de um vetor de expresso.
Este deve incluir os elementos genticos da clula hospedeira para a transcrio e traduo.

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IDENTIFICAR OS MICRORGANISMOS RECOMBINANTES


A tecnologia do DNA-recombinante est baseada em fenmenos que ocorrem em frequncias muito baixas. A existncia de mtodos de seleo eficientes possibilita detectar e recuperar aquelas clulas que incorporaram um gene estranho. Associa-se o gene estranho a um marcador seletivo como, por exemplo, um gene de resistncia a algum antibitico. Em presena deste, s podero se multiplicar e formar clones ou colnias as clulas que incorporaram ambos os genes. Entretanto, o uso de genes de resistncia a antibiticos considerado polmico, porque existe uma possibilidade remota dos genes serem transferidos das bactrias transformadas para as bactrias do ambiente. Tambm podem ser utilizados como marcadores seletivos os genes que codificam a sntese de um aminocido. Neste caso, a seleo do microrganismo recombinante ocorre em um meio sem esse aminocido. Alm dos marcadores seletivos, os pesquisadores contam com outro tipo de marcadores que permite identificar as bactrias transformadas e, tambm, acompanhar a expresso de um gene no organismo modificado. Destacam-se entre estes marcadores, ou genes reprteres: GAL e GUS, respectivamente o gene da -galactosidase e o gene da glucuronidase que transformam o substrato correspondente em um composto colorido; GFP, um gene da medusa Aequorea Victoria, que sintetiza uma protena fluorescente, verde brilhante na luz ultravioleta; LUC, o gene da luciferase, uma enzima dos vaga-lumes, que emite luz em presena do substrato. Mtodos alternativos envolvem a identificao de uma protena com anticorpos marcados ou o reconhecimento de um gene por hibridizao com uma sonda marcada.

A CONSTRUO DE PLANTAS TRANSGNICAS


As plantas transgnicas se originam via cultura in vitro a partir de clulas vegetais modificadas geneticamente. Portadoras de um gene exgeno ou transgene, sua obteno visa o melhoramento das propriedades agronmicas e nutritivas dos vegetais e, tambm, sua utilizao para produzir substncias novas (biofbricas).

O TRANSGENE
Para garantir a transferncia de uma sequncia gnica determinada, deve-se construir em redor uma estrutura complexa que inclua tambm um gene marcador, um promotor e as sequncias de leitura adequadas (sequncia terminal). Denomina-se transgene o conjunto formado pela sequncia gnica e a estrutura que o acompanha. O promotor desencadeia a transcrio da sequncia codificadora de interesse. Um promotor constitutivo permitir a expresso gnica na maioria dos tecidos e ao longo da vida da planta. Tambm existem promotores que respondem a estmulos ambientais internos ou externos, como a luz. O gene marcador confere resistncia a substncias normalmente txicas para as clulas vegetais, tais como os antibiticos ou os herbicidas, de modo que em um meio seletivo s sobrevivam clulas que integraram o transgene.

A TRANSFERNCIA DOS GENES A CLULAS VEGETAIS


Agrobacterium tumefaciens uma bactria do solo, que leva um plasmdeo denominado Ti (do ingls, Tumour induced plasmid). Quando infectadas com a bactria portadora desse plasmdeo, as plantas dicotiledneas desenvolvem galhas, isto , tumores caractersticos (crown gall).

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 9: A engenharia gentica

A eliminao de alguns genes na regio T do plasmdeo Ti conserva sua capacidade de insero no cromossomo da clula hospedeira, eliminando a propriedade de induzir tumores. Esta caracterstica transforma o plasmdeo em um vetor adequado para a transferncia de genes de outras espcies s clulas vegetais. Basta colocar o transgene na regio T do plasmdeo previamente desarmado para se obter um plasmdeo recombinante que poder ser transferido novamente a Agrobacterium ou a clulas hospedeiras, onde o transgene ir se inserir em algum lugar do genoma (Figura 9.6). As plantas monocotiledneas (arroz, milho, trigo) no so infetadas por Agrobacterium, sendo necessrio recorrer a mtodos fsicos para a transferncia de genes. Recorre-se eletroporao, assim como ao tratamento com uma substncia que desestabilize a membrana plasmtica (polietilenglicol ou PEG). Um mtodo que se encontra hoje amplamente difundido a biolstica. Com um revlver especial (gene gun) dispara-se microprojteis de ouro ou tungstnio, recobertos de DNA, em direo s clulas. O dispositivo possibilita a entrada do DNA exgeno no ncleo, nas mitocndrias ou nos cloroplastos. De um modo geral, a transformao se realiza em protoplastos, clulas em que a parede celular foi eliminada com enzimas. Figura 9.7: A construo de uma planta transgnica.
O plasmdeo Ti "desarmado" portando um gene exgeno transferido a clulas de discos foliares. Formam-se calos que podero regenerar a planta inteira.

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O PROBLEMA DOS MARCADORES SELETIVOS


O uso de marcadores de resistncia a antibiticos na construo de plantas desperta vrios questionamentos, apesar de se tratar de antibiticos sem uso clnico e que j se encontram nas bactrias do intestino. Estes marcadores podem ser substitudos, mas como sua utilidade se limita ao processo de transformao, o melhor seria elimin-los uma vez cumprida sua funo. J foram desenvolvidas vrias tcnicas genticas de remoo dos marcadores, esperando-se que nos prximos anos sua retirada se transforme em uma prtica corriqueira de laboratrio.

DO LABORATRIO AO CAMPO
No laboratrio, transfere-se a construo gentica s clulas receptoras por algum dos mtodos possveis (geralmente eletroporao, biolstica ou uso de vetores, como o plasmdeo Ti de Agrobacterium tumefaciens); a seguir se selecionam e recuperam as clulas transformadas e, mediante as tcnicas de cultura in vitro, se regeneram as plantas correspondentes (Figura 9.8). Note-se que este trabalho costuma ser realizado em plantas cujo gentipo favorece a transformao e a regenerao da planta transformada, mas que geralmente resultam pouco vantajosas do ponto de vista agronmico. Figura 9.8: As etapas da construo de uma planta transgnica.

Transfomao por engenharia gentica

Regenerao mediante tcnicas de cultura de tecidos

Caracterizao molecular e bioqumica

Avaliao do valor agronmico

Melhoramento mediante cruzamentos com linhagens de elite

Obteno de uma variedade transformada geneticamente

Experimentos e testes de campo, em pequena e grande escala

Autorizao da legislao local

Liberao do cultivo para sua explorao comercial

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A presena do transgene, assim como o nmero de cpias e o lugar em que estas se integraram no genoma, conferida mediante tcnicas bioqumicas e/ou marcadores moleculares (polimorfismos na molcula de DNA, repetio de sequncias), porque so aspectos que podem influir na expresso gnica. Considera-se alcanado o xito quando o transgene se expressa no lugar correspondente e com um adequado nvel de atividade, restando por verificar a estabilidade da expresso gnica e o seu valor agronmico. Acabada a etapa de laboratrio, iniciam-se os testes controlados em casa de vegetao, para selecionar as plantas-me com as quais se originar vrias geraes de retrocruzamentos seletivos com alguma das linhagens elite. Os testes visam a obteno de uma linhagem transgnica de alto rendimento, adaptada a um contexto especfico, isto , um cultivar com uma produtividade potencial parecida da linhagem elite que expresse o trao codificado pelo novo transgene. Conceitualmente, estes testes so semelhantes aos efetuados no processo de melhoramento tradicional; no entanto, a utilizao de marcadores moleculares e de tcnicas de cultura in vitro permite caracterizar a prognie bem mais rapidamente. S ento d-se incio liberao planejada no meio ambiente, que envolve o cultivo de plantas em experimentos protegidos e testes de campo em diferente escala, at que o novo hbrido transgnico esteja pronto para o seu cultivo comercial. A liberao do cultivo depender da autorizao da legislao local, geralmente bastante restrita a esse respeito.

CLULAS E ANIMAIS TRANSGNICOS


A TRANSFERNCIA GNICA A CLULAS ANIMAIS
Um dos objetivos da engenharia gentica a produo de protenas recombinantes em culturas celulares. Em relao aos microrganismos, a grande vantagem das clulas animais possuir os sistemas de transcrio e de processamento das protenas indispensveis para a expresso dos genes de organismos superiores. Observe-se que em relao s clulas animais a palavra transformao designa a converso de uma clula normal em maligna, sendo substituda por transfeco. O transporte de DNA exgeno dentro da clula assegurado por mtodos fsicos (eletroporao, microinjeo, ingesto de micropartculas, fuso de lipossomos com a membrana plasmtica) e por vetores (vrus, plasmdeos e transposons). A transfeco mediante vetores virais dos quais se eliminaram as sequncias patognicas, interessa ao laboratorista porque os vrus animais infectam tecidos especficos e se integram no genoma da clula hospedeira de maneira estvel. Em mamferos, os vrus utilizados mais frequentemente como vetores so o SV40, a vacina, os retrovrus e os adenovrus. Clulas de inseto tambm podem ser manipuladas geneticamente com vetores como os elementos P de transposio de Drosophila, ou como o baculovrus, uma vez eliminado o gene que permite sua proliferao na natureza. Assim como visto anteriormente em relao aos microrganismos e s plantas, a sequncia codificadora colocada em uma construo gnica bem definida que inclui um gene marcador para selecionar as clulas que receberam o transgene. Utilizam-se como marcadores genes de resistncia a antibiticos, genes para caractersticas metablicas (Tk ou timidina quinase) etc. Para integrar a construo gnica no lugar desejado, se colocam nas extremidades sequncias de DNA homlogas s extremidades do segmento que se quer substituir. Como distinguir a integrao no lugar desejado (recombinao homloga) da integrao ocorrida em qualquer outro lugar (recombinao no homloga)? Acrescentando na construo gnica, um pouco mais longe das sequncias homlogas, um gene de seleo negativa. Se a clula o integrar em qualquer outro lugar do genoma, ela se tornar sensvel a um segundo antibitico. Inversamente, se a clula for resistente a este antibitico, tendo recebido o marcador colocado dentro da construo gnica, isto significa que houve integrao no lugar desejado.

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OS ANIMAIS TRANSGNICOS
O supermouse A maior parte dos animais transgnicos existentes foram obtidos por microinjeo de DNA, uma tcnica com alto nmero de fracassos. A automatizao torna hoje o procedimento bem mais eficiente. Contudo, ainda apresenta alguns inconvenientes. A insero de um nmero varivel de cpias em qualquer stio do DNA da clula receptora pode interromper ou alterar a expresso de outros genes, um fenmeno que s ser evidenciado na prxima gerao. Os primeiros experimentos de construo de um animal transgnico datam do incio da dcada de 1980. Para construir o supermouse, um camundongo com um gene de hormnio de crescimento de rato, preparou-se um vetor, com o gene de rato codificador do hormnio de crescimento, e um promotor de camundongo, respondendo presena de cdmio no ambiente. A seguir, com uma agulha microscpica, injetou-se o vetor em um dos proncleos de um vulo fecundado. Implantou-se o zigoto em uma fmea receptora, induzindo-se mais tarde na ninhada a sntese do hormnio de crescimento. Alguns camundongos, que incorporaram o transgene, alcanaram mais tarde o tamanho de um rato (Figura 9.8).

Figura 9.8: A construo de animais transgnicos por microinjeo.


Aps a transfeco, se implantam os ovos em fmeas receptivas (pseudogrvidas). Aqueles que incorporaram o transgene originaro, neste caso, animais de tamanho maior (supermouse).

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 9: A engenharia gentica

Os animais como modelos para a experimentao A transfeco de clulas cultivadas in vitro permite que sejam verificados o stio de integrao do transgene e o nmero de cpias inseridas. Uma aplicao interessante desta tecnologia na pesquisa clnica a construo de modelos animais para o estudo de doenas humanas. Aps a transfeco de clulas-tronco embrionrias com um gene desativado, realiza-se sua transferncia a blastcitos, que, reimplantados, originaro animais quimricos, isto animais com clulas de dois tipos: umas em que o gene est ativado e outras em que no est ativado porque incorporaram o transgene. Dos cruzamentos entre quimeras com clulas germinais portadoras do gene desativado nascero animais homozigticos com duas cpias do gene inativo (Figura 9.9). Esta estratgia utilizada no s para construir modelos animais com um gene inativo (knock out), como para colocar um gene ativo (knock in). Desse modo se obtiveram camundongos transgnicos para genes determinantes de algumas doenas humanas, tais como cncer de mama (BRCA 1), doena de Huntington, anemia falciforme etc. Estes animais so de grande utilidade para as pesquisas farmacolgicas.

Figura 9.9: Construo de um animal transgnico por transfeco de clulas-tronco embrionrias.


Mediante a implantao do blastcito com clulas modificadas em uma fmea aguti, so obtidos animais quimricos, com clulas que levam o carter para pelagem marrom e clulas com o carter para pelagem preta. Do cruzamento entre quimeras, nascem alguns animais com pelagem preta, tendo incorporado o DNA exgeno no genoma.

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Os animais como biofbricas A ovelha Dolly nasceu em 1996, depois de numerosas tentativas de transferir o ncleo de uma clula mamria a um ovcito anucleado (Figura 9.10). Adorada pela mdia, o clone Dolly teve que ser sacrificada em 2003 com um tumor no pulmo, artrite e sinais de envelhecimento precoce. Poucos meses depois do nascimento de Dolly, o mesmo grupo do Instituto Roslin e de PPL Therapeutics anunciou o nascimento de Polly, uma ovelha transgnica para o gene codificador do fator IX, uma protena que falta nos hemoflicos. O fato de ter-se utilizado para gerar Dolly uma clula diferenciada mantida em cultivo teve uma importncia enorme. As clulas em cultura podem ser transfectadas e os seus ncleos transferidos para a obteno de animais transgnicos, como Polly. Mesmo sendo difcil de obter, um animal transgnico pode ser bem mais interessante do ponto de vista econmico que o cultivo de clulas em biorreatores, um processo complexo e de alto custo. Na construo de animais transgnicos para a produo em grande escala de uma protena recombinante, escolhe-se habitualmente um promotor que se expresse na glndula mamria, de modo que o produto gnico aparea no leite do animal. Cabras transgnicas produtoras de fator ativador de plasminognio (tPA), vacas produtoras de lactoferrina, somatostatina ou insulina j so uma realidade. Chama-se Atryn o primeiro anticoagulante, liberado comercialmente em 2009, produzido a partir do leite de uma cabra transgnica pela empresa GTC Biotherapeutics. Figura 9.10: Dolly, um clone obtido por transferncia nuclear.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 9: A engenharia gentica

O TAMBO FARMACUTICO ARGENTINO


Algumas protenas teraputicas (somatotropina, insulina) so obtidas atualmente mediante o cultivo de clulas animais ou de bactrias e leveduras recombinantes; no entanto, provvel que em um futuro prximo estes agentes biolgicos sejam substitudos por mamferos transgnicos. A modificao das tcnicas de produo interessa indstria farmacutica porque elimina as dificuldades inerentes conduo dos bioprocessos e purificao dos produtos. Apesar do elevado valor da inverso inicial, bastam poucos animais para se extrair uma quantidade grande de protena recombinante, com o qual seria possvel baratear o seu preo. J existem cabras produtoras do fator ativador de plasminognio (tPA) e vacas produtoras de lactoferrina, j prximos de ser comercializados. Biosidus, uma empresa argentina do Grupo de Empresas Farmacuticas Sidus, iniciou as experincias de clonagem de bovinos em 1997. Como as dificuldades tcnicas so numerosas, muitas tentativas tiveram que ser feitas at alcanar o xito. Este chegou em 2002, com o nascimento de Pampa, uma vaca da raa Jersey que o primeiro clone bovino da Amrica Latina. Uma vez dominada a tecnologia, o passo seguinte era conseguir um animal que secretasse o hormnio de crescimento humano (somatotropina) no leite. Com esse objetivo, se elaborou uma construo gnica que inclua o gene codificador da somatotropina e um promotor para sua expresso no leite. Esta construo foi inserida em fibroblastos fetais. Da fuso destes fibroblastos com ovcitos anucleados resultaram embries que se implantaram em vacas portadoras. Em 2002, nascia Pampa Mansa, uma vaca clonada e transgnica que um ano mais tarde comeou a produzir leite com somatotropina. Estima-se que bastariam trs animais semelhantes para abastecer o mercado latino-americano. A partir de fibroblastos da orelha de Pampa Mansa obteve-se uma dinastia de vacas, clones de um clone. Em 2004, com o nascimento de Pampero, um touro transgnico resultante do cruzamento entre Pampa Mansa e um animal reprodutor, a multiplicao dos animais passou a ser independente da clonagem. O tambo farmacutico est completo. Em 2005, a empresa Biosidus obteve das autoridades a autorizao para liberar um nmero limitado de animais no meio ambiente agropecurio, em condies estritamente controladas. O prximo passo ser a aprovao do produto para o uso farmacutico. O projeto colocou a Argentina entre os pases que dominam esta tecnologia, juntamente com Estados Unidos, Alemanha, Frana, Japo, Reino Unido e Austrlia. Alm da participao pioneira de Biosidus, o tambo farmacutico demandou um investimento de US$ 7.000.000, a participao de uma equipe multidisciplinar de 40 pesquisadores e a assessoria do CONICET (Consejo de Investigaciones Cientficas y Tcnicas da Argentina). Biosidus contempla a ampliao do rebanho para outras protenas teraputicas (Dinastia Patagnia produtora de pr-insulina humana, Dinastia Portenha, produtora de hormnio de crescimento bovino).

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BIBLIOGRAFIA
CAPTULO 1
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BIOTECNOLOGIA / Bibliografa (Captulos 1 a 9)

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Autora: Maria Antonia Malajovich

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O Instituto de Tecnologia ORT um Colgio de Cincia e Tecnologia com cursos de Ensino Fundamental II (do 6 ao 9 ano) e de Ensino Mdio Tcnico (em trs anos) com especializao em Biotecnologia, Comunicao Social, Eletrnica e Informtica.

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