UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ - UEM

CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

Amanda Gabriela Cunha Dos Santos

RA: 117596

Marcadores moleculares e obtenção de organismos geneticamente

modificados

UMUARAMA
2023
1. Introdução
A obtenção de organismos geneticamente modificados (OGMs) é uma prática que
tem se tornado cada vez mais relevante nas últimas décadas. Segundo o art. 3º, inciso
V, da Lei Federal brasileira nº 11.105, de 24 de março de 2005, um OGM é definido
como um organismo cujo material genético (DNA/RNA) foi modificado por qualquer
técnica de engenharia genética. No entanto, é importante destacar que, de acordo com
Chaves (2006), essas técnicas de alterações no genoma envolvem a manipulação direta
da molécula de DNA, permitindo a clivagem, a separação de fragmentos, a
amplificação e o sequenciamento de DNA, a hibridação de ácidos nucléicos, o
isolamento de genes e a clonagem molecular.
A biotecnologia, que engloba as técnicas de engenharia genética, é a aplicação de
informações e metodologia científica para a solução de problemas biológicos em
diversas áreas, incluindo agricultura, pecuária e medicina. Embora muitos associam a
biotecnologia principalmente às ferramentas da engenharia genética desenvolvidas a
partir da década de 1970, a verdade é que a biologia, a tecnologia e as modificações
genéticas direcionadas por humanos já fazem parte da agricultura desde o início da
domesticação de plantas, há cerca de 10 mil anos. A biotecnologia se destaca pela sua
precisão na seleção de genes responsáveis por características específicas e sua
transferência para outros organismos. Isso contrasta com o método convencional, que
combina todas as características de ambos os pais, muitas vezes transferindo
características indesejadas. Além disso, a biotecnologia permite a transferência de
características específicas entre diferentes espécies, o que não é possível através do
melhoramento convencional, devido à incompatibilidade sexual interespecífica.
A utilização de marcadores moleculares, como destacado por Guimarães & Moreira
(1999), tem sido fundamental nesse processo. Esses marcadores permitem rastrear e
identificar genes de interesse, tornando possível a manipulação genética de maneira
mais precisa. A biotecnologia moderna tem demonstrado sua relevância na produção de
alimentos, medicamentos e outros produtos, como insulina humana obtida a partir de
bactérias recombinantes.
Entretanto, o uso de OGMs tem gerado controvérsias, com preocupações sobre a
produção de proteínas alergênicas, compostos tóxicos, redução da qualidade nutricional
e diminuição da biodiversidade, como observado por Moreira (1998). Portanto, a
pesquisa sobre OGMs e sua aplicação na alimentação é de extrema importância,
buscando entender os benefícios, riscos e impactos dessa tecnologia.
O objetivo do presente trabalho é proporcionar uma visão geral dos OGMs. A
pesquisa visa aprofundar o entendimento sobre os OGMs, seus benefícios e desafios, e
contribuir para uma discussão informada sobre seu uso na sociedade atual,
considerando aspectos científicos, éticos e socioeconômicos. Além disso, pretende-se
destacar a importância dos marcadores moleculares na obtenção de OGMs,
demonstrando como essas ferramentas desempenham um papel crucial na engenharia
genética e na garantia da segurança alimentar.
2. Desenvolvimento

Obtenção de organismos geneticamente modificados.

A biotecnologia teve origem nos processos fermentativos, que datam desde antes da
era Cristã, formando uma parte intrínseca da história da humanidade. Em 1860, Louis
Pasteur introduziu a técnica de pasteurização, contribuindo para o entendimento da
função dos microorganismos e lançando as bases da microbiologia. Adicionalmente,
Pasteur demonstrou que diferentes tipos de fermentação eram conduzidos por
microrganismos específicos, capazes de sobreviver e se reproduzir na ausência de
oxigênio. Por volta de 1865, Mendel, após experimentos com ervilhas, estabeleceu a
existência de fatores hereditários responsáveis pela transmissão de características.
Curiosamente, as duas grandes guerras impulsionaram a produção em larga escala de
produtos derivados de processos fermentativos. A partir de aproximadamente 1922, os
produtores americanos pioneiramente adotaram o milho híbrido, resultando em um
aumento de mais de 800% na produção de milho nos Estados Unidos entre 1930 e
1985. Na década de 1950, a biotecnologia de fato emergiu com a descoberta da síntese
química do DNA e o desenvolvimento de técnicas de manipulação genética, como o
DNA recombinante, fusão celular e hibridoma. Em 1953, James Watson e Francis
Crick publicaram na revista Nature a notável estrutura em dupla hélice do DNA,
revolucionando a genética e pavimentando o caminho para técnicas avançadas de
manipulação genética. Em 1983, a insulina recombinante foi aprovada para uso médico
e comercialização. No mesmo ano, a técnica de amplificação de DNA in vitro (PCR)
foi desenvolvida, permitindo a produção de inúmeras cópias de genes e tornando-se
uma ferramenta vital para pesquisas em biotecnologia (CHAVES, 2006). Em 1994, o
primeiro alimento geneticamente modificado, o tomate de amadurecimento retardado
(Flavr SavrTM), foi introduzido na cadeia alimentar dos Estados Unidos. No ano
seguinte, os Estados Unidos permitiram a importação e o cultivo de soja transgênica,
seguidos pela Argentina. Na década de 1990, o Brasil promulgou a Lei Brasileira de
Biossegurança (Lei 8.974, de 5 de janeiro de 1995) e estabeleceu a Comissão Técnica
Nacional de Biossegurança (CTNBio) como o órgão regulador de produtos
transgênicos. Outro marco notável na biotecnologia foi o nascimento de duas ovelhas
com genes humanos, produzindo leite com uma proteína anticoagulante usada para
tratar hemofílicos. Em 1998, a União Europeia aprovou regras de rotulagem para
alimentos geneticamente modificados, e em 1999, o Protocolo de Cartagena, o primeiro
acordo internacional sobre o transporte de organismos geneticamente modificados
(OGMs), entrou em vigor. No mesmo ano, a Associação Nacional de Biossegurança
(ANBio) foi fundada, e em 2005, o Brasil aprovou uma nova Lei Brasileira de
Biossegurança (Lei 11.105, de 24 de março de 2005) para fortalecer as atividades de
biossegurança no país (Xavier et al., 2005). Pesquisadores americanos expandiram as
técnicas de manipulação genética incorporando a transferência nuclear, permitindo a
criação de animais transgênicos em laboratório, envolvendo genes da mesma espécie ou
de espécies diferentes. Atualmente, a biotecnologia permite a excisão de regiões de
DNA específicas, a determinação da sequência de nucleotídeos de segmentos, a
amplificação do DNA para produzir cópias em abundância, o isolamento de genes, a
modificação por engenharia genética e a reintrodução em células e organismos, além de
compreender os mecanismos de regulação e expressão genética (CHAVES, 2006).
O termo "organismo geneticamente modificado" (OGM) refere-se a qualquer
organismo cujo material genético (DNA/RNA) tenha sido deliberadamente alterado por
meio de técnicas de biotecnologia com o propósito de favorecer características
desejadas. O primeiro OGM transgênico criado foi a bactéria Escherichia coli, na
década de 80, quando genes humanos foram adicionados para produzir insulina.
Portanto, um organismo geneticamente modificado (OGM) pode ser um transgênico,
mas não é necessariamente assim. Um organismo é considerado um transgênico
somente quando genes de outra espécie são inseridos deliberadamente em seu material
genético (BECHANE, 2012).
Os termos transgênicos ou organismos geneticamente modificados (OGMs) são
usados para descrever plantas, animais ou microrganismos que foram geneticamente
alterados para expressar características desejadas provenientes de outros organismos.
Isso significa que a barreira tradicional entre espécies e até mesmo reinos foi
ultrapassada, abrindo diversas possibilidades para o aprimoramento genético
(VERCESIL; RAVAGNANI; DI CIERO, 2009; CORONA, 2007). Os avanços na
ciência nos últimos anos resultaram na descoberta de novas tecnologias, um marco
crucial para o progresso da humanidade. Na indústria agroindustrial, os OGMs
representam um avanço significativo na melhoria e aumento da produtividade. A
criação de plantas geneticamente modificadas é, de fato, um avanço científico que
promete benefícios significativos para os centros de biotecnologia e para os
agricultores. Essas plantas, desenvolvidas por meio da tecnologia do DNA
recombinante, adquirem características que seriam difíceis de alcançar por meio de
métodos convencionais de melhoramento genético. Os OGMs, sejam plantas ou outros
organismos, têm seu material genético modificado com a introdução de genes de
diferentes espécies, vegetais, animais ou microrganismos, conferindo-lhes novas
características para aprimorar a produção de alimentos, medicamentos e produtos
industriais (RIBEIRO; MARIN, 2012).
O crescimento da engenharia genética e a introdução de alimentos "geneticamente
modificados" ou "transgênicos" no mercado mundial têm gerado debates acalorados.
Por um lado, a indústria da biotecnologia deposita grande confiança na segurança e
importância da engenharia genética para o desenvolvimento econômico. Por outro lado,
existe um ceticismo difundido na sociedade, em parte devido à falta de informações
claras. As preocupações sobre os OGMs estão relacionadas à falta de experiência com
esses organismos e ao potencial de efeitos adversos resultantes da inserção de genes em
seus genomas, levando a regulamentações rigorosas de biossegurança. Embora a
capacidade de fazer alterações genéticas tenha aumentado a confiança de que mudanças
não intencionais no genoma não ocorrerão, não é possível prever todos os aspectos
ecológicos importantes do fenótipo resultante (BOCCIA, 2015; ANEZ, 2006).
Na avaliação dos riscos associados às novas técnicas de produção de alimentos, é
crucial considerar como essas abordagens se distinguem dos métodos tradicionais
empregados na agricultura. Quando se utilizam métodos convencionais de
melhoramento genético para aprimorar características de uma planta, pode ocorrer um
aumento nos níveis de toxinas naturais como resultado do cruzamento. Isso pode exigir
vários anos de cruzamentos adicionais para eliminar a característica indesejada e, ao
mesmo tempo, preservar os benefícios do híbrido. De maneira semelhante, os riscos
estão associados ao uso extensivo de produtos químicos na agricultura atual, que
permitem às culturas resistir a insetos, doenças e condições climáticas adversas. Com o
uso da biotecnologia, foram desenvolvidas variedades, muitas delas mais produtivas do
que as variedades tradicionais e com menor necessidade de agrotóxicos (XAVIER et
al., 2008).
Os OGMs estão sendo cada vez mais utilizados em sistemas de pesquisa industrial
para a produção de medicamentos, combustíveis e produtos químicos de alto valor. O
isolamento genético e a biotecnologia desempenham um papel fundamental na
segurança biológica, garantindo organismos geneticamente modificados seguros e
auxiliando no desenvolvimento da biorremediação e probióticos (ROVNER et al.,
2014). As características mais comuns presentes em culturas geneticamente
modificadas incluem a tolerância a herbicidas e a resistência a insetos, que são
prevalentes em todo o mundo. Características de valor agregado, como teores de
micronutrientes diferentes, amadurecimento mais rápido, maior valor nutricional e
maiores níveis de antioxidantes, também têm recebido atenção significativa
recentemente (GERDES et al., 2014; SIMÓ et al., 2014; RIBEIRO; MARIN, 2012).
Em 1994, como mencionado anteriormente, foi lançado no mercado o primeiro
alimento geneticamente modificado, o tomate Flavr SavrTM, notável por seu
amadurecimento retardado, o que resultava em uma maior durabilidade sem
comprometer sua suculência e textura. No caso do Flavr Savr TM, os cientistas
identificaram uma enzima, a poligalacturonase (PG), que influenciava a textura e o
processo de amadurecimento do tomate. Isolando o gene responsável por essa enzima e
incorporando-o ao genoma, o tomate conseguiu manter suas características
organolépticas por um período mais longo em comparação aos tomates convencionais.
Essa técnica viabilizou o desenvolvimento de tomates com melhor sabor, que podiam
ser transportados a grandes distâncias sem comprometer sua qualidade. Em 1995, a
Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos aprovou o cultivo e a
comercialização da soja resistente ao herbicida glifosato (Roundup Ready®). Antes
dessa aprovação, foram realizados vários anos de testes em alimentos e medicamentos
nos EUA antes que o Departamento de Agricultura do país permitisse o plantio e a
venda. Devido ao amplo uso de produtos derivados de soja em alimentos, é estimado
que a maioria dos consumidores nos EUA esteja consumindo produtos obtidos por
meio de engenharia genética.
Atualmente, uma variedade considerável de alimentos de origem vegetal é
geneticamente modificada, incluindo canola, manga, pimentão, algodão, batata,
abóbora, arroz, trigo e outros. O arroz, um alimento básico em muitas culturas, sofria de
deficiência de vitamina A, o que podia resultar em problemas de visão. Como solução,
o arroz dourado foi geneticamente modificado para conter quantidades adequadas de
beta-caroteno, um precursor da vitamina A. Isso transformou o arroz dourado em uma
fonte de suplementação de vitamina A para crianças com desnutrição. Além do arroz,
outras linhagens de arroz estão sendo desenvolvidas com o objetivo de fornecer
maiores quantidades de beta-caroteno e ferro para enfrentar a anemia. A biotecnologia
também resultou no desenvolvimento de batatas com menor capacidade de absorver
óleo, amendoins não alergênicos, bananas contendo vacinas contra doenças como a
Hepatite B, culturas oleaginosas com óleos mais saudáveis, soja com elevados níveis de
lisina e ácido oléico, tomates capazes de crescer em solos com alto teor de salinidade, e
para a produção de antibióticos, entre outros.
De acordo com um relatório de 2007 do International Service for Acquisition of
AgriBiotech Applications, a área global plantada com plantas geneticamente
modificadas em 2007 atingiu 114,3 milhões de hectares, representando um aumento de
12% em relação ao ano anterior. Entre 1996 e 2007, mais de dois terços de um bilhão
de hectares foram cultivados com plantas transgênicas, com um crescimento
impressionante de sessenta e sete vezes nesse período. Em 2007, os Estados Unidos
lideraram a lista global, com 57,7 milhões de hectares (50% da área total de lavouras
geneticamente modificadas), impulsionados em parte pelo crescimento do mercado de
etanol, com um aumento significativo de 40% na área plantada com milho GM (James,
2007).
A biotecnologia também oferece alternativas aos ingredientes convencionais na
alimentação, como o milho e a soja resistentes a insetos (milho Bt e soja Bt) e
tolerantes a herbicidas (Roundup Ready®). Isso resultou no desenvolvimento de
culturas mais resistentes a insetos e doenças, reduzindo a necessidade de pesticidas e
herbicidas, o que por sua vez diminuiu custos e impactos ambientais, além de melhorar
a qualidade dos produtos. Segundo James (2007), a cultura transgênica mais cultivada
em 2007 foi a soja, ocupando 57% da área total de plantações transgênicas, seguida
pelo milho, algodão e canola. A tolerância a herbicidas foi a característica
predominante, ocupando 63% da área global de cultivos GM, enquanto cultivos com
múltiplos genes estavam se tornando mais comuns do que os resistentes a insetos. No
entanto, o consumo de ingredientes geneticamente modificados ainda é motivo de
debate quanto aos riscos para a saúde humana e animal. Isso levou a extensas pesquisas
comparando a qualidade nutricional de variedades geneticamente modificadas com as
variedades convencionais. Além disso, pesquisas avaliaram o desempenho,
características da carne, saúde dos animais que consumiam alimentos geneticamente
modificados, em comparação com aqueles que consumiam ingredientes tradicionais.
Diversos estudos demonstraram que não havia diferenças significativas no valor
nutricional dos alimentos geneticamente modificados em comparação com as
variedades comuns, corroborando com mais de cem estudos realizados até o momento
(Flachowsky et al., 2007).
Na avaliação dos riscos relacionados às novas técnicas de produção de alimentos, é
fundamental considerar como essas abordagens se distinguem dos métodos tradicionais
empregados na agricultura. Quando os métodos convencionais de melhoramento são
utilizados para aprimorar características de plantas, como, por exemplo, aumentar a
resistência a pragas, é possível que ocorra um aumento nos níveis de toxinas naturais
como resultado do cruzamento. Isso, por sua vez, pode exigir anos de cruzamentos
adicionais para eliminar essa característica indesejada e, ao mesmo tempo, preservar os
benefícios do híbrido. De maneira semelhante, os riscos estão associados ao uso
extensivo de produtos químicos na agricultura atual, permitindo que as plantas resistem
a insetos, doenças e condições climáticas adversas. Graças à aplicação da
biotecnologia, foram desenvolvidas novas variedades, muitas das quais demonstraram
ser mais produtivas do que as variedades tradicionais. Riscos naturais inerentes à
produção de alimentos, como infecções, doenças, pragas, condições climáticas
extremas, podem causar prejuízos significativos. No entanto, o uso de plantas
geneticamente modificadas têm o potencial de reduzir substancialmente esses riscos,
bem como outros fatores que impactam negativamente a produção agrícola. Os fito
melhoristas conseguiram incorporar proteção contra insetos específicos, como a lagarta
do milho, o besouro e a lagarta da batata, e o gorgulho do algodão, em variedades
geneticamente modificadas, como o milho Bt, batata Bt e algodão Bt. Essas plantas
expressam um gene que codifica uma proteína inseticida semelhante à produzida
naturalmente por certas subespécies da bactéria Bacillus thuringiensis, que é
comumente encontrada no solo. Isso permitiu aos agricultores reduzir a dependência de
produtos químicos nas lavouras. Da mesma forma, foram desenvolvidas plantas de soja
e milho resistentes a herbicidas, como o glifosato, o que permitiu a aplicação de
herbicidas nas culturas para controlar plantas daninhas sem prejudicar a safra principal
(Vantreese, 2001).
Sementes produzidas por meio da engenharia genética contribuem para a obtenção
de colheitas mais uniformes. Além disso, o cultivo de variedades resistentes a doenças
reduz a necessidade de herbicidas e inseticidas, resultando em maior produtividade,
menor custo de produção e menor impacto ambiental. Além disso, a adoção de novas
tecnologias permite o desenvolvimento de plantas mais resistentes à seca e com maior
capacidade de absorver nutrientes do solo. Esses avanços são particularmente
importantes para países em desenvolvimento que enfrentam desafios como longos
períodos de seca, erosão, solos inférteis, infestações de pragas e outros problemas.
Os debates sobre o uso de organismos geneticamente modificados começaram assim
que os cientistas aprenderam a manipular os genes de seres vivos no início dos anos 80.
Desde então, a oposição aos alimentos geneticamente modificados tem sido
especialmente forte na Europa e no Japão. As principais preocupações em relação ao
consumo de alimentos transgênicos têm origem nas questões que surgiram no final do
século passado, principalmente relacionadas à doença da "vaca louca" (Encefalopatia
Espongiforme Bovina - BSE) e à contaminação da cadeia alimentar por dioxina. No
entanto, é importante destacar que, em nenhum desses casos, os problemas estavam
relacionados a organismos geneticamente modificados. De acordo com Moreira (1998),
as principais preocupações em relação aos alimentos geneticamente modificados
incluem o temor de efeitos inesperados causados pela transferência de material
genético, a produção de proteínas alergênicas, a geração de substâncias tóxicas e a
redução da qualidade nutricional dos alimentos. No entanto, diversos estudos realizados
com animais de produção que receberam dietas contendo alimentos geneticamente
modificados, como milho Bt, milho tolerante ao glufosinato (milho PAT), beterraba
PAT, soja Roundup Ready®, batata Bt e batata Roundup Ready®, não encontraram
diferenças nos valores nutricionais nem a presença de fragmentos de DNA
recombinante em órgãos e tecidos dos animais alimentados com essas dietas em
comparação com dietas contendo alimentos isogênicos (Flachowsky et al., 2007).
Além disso, preocupações infundadas sobre a resistência humana a antibióticos
decorrente do consumo prolongado de alimentos transgênicos, bem como a perda de
biodiversidade devido à disseminação de "super plantas" que resistem aos métodos
tradicionais.

Marcadores Moleculares
O planejamento de um programa de melhoramento genético envolve dois aspectos
fundamentais: a seleção dos genitores e a compreensão dos mecanismos de herança dos
caracteres a serem selecionados (BARBOSA NETO, 1995). No processo de escolha
dos genitores, o conhecimento da variabilidade genética disponível desempenha um
papel decisivo. A estreita relação genética entre as variedades cultivadas de trigo
(Triticum aestivum) (MARTIN et al., 1995; BARBOSA NETO, 1995), aveia (Avena
sativa) (O'DONOUGHUE et al., 1994) e cevada (Hordeum vulgare) (MELCHINGER
et al., 1994), juntamente com os desafios de realizar um grande número de cruzamentos
em espécies autógamas, enfatiza a importância de cruzar genótipos que exibam ampla
variabilidade genética. A categorização dos genitores em grupos heteróticos e a
realização de cruzamentos entre tipos geneticamente distintos podem contribuir para
aumentar a variabilidade genética nas populações segregantes (MESSMER et al.,
1993). Enquanto a seleção de genitores influencia o potencial máximo de progresso
genético em plantas autógamas, o segundo aspecto, relacionado aos mecanismos de
herança, é crucial para atingir esse potencial máximo. Caracteres de herança qualitativa,
que são menos afetados pelo ambiente, são mais fáceis de serem selecionados. Por
outro lado, a expressão de caracteres quantitativos é fortemente influenciada pelo
ambiente, tornando a identificação de indivíduos geneticamente superiores mais
desafiadora. Rendimento e qualidade dos grãos, resistência ao acamamento e
arquitetura da planta no trigo e na aveia são exemplos clássicos de caracteres
quantitativos.
Os marcadores genéticos representam caracteres com mecanismos de herança
simples que podem ser usados para avaliar diferenças genéticas entre dois ou mais
indivíduos. Esses marcadores podem ser divididos em dois grupos principais:
marcadores morfológicos e marcadores moleculares.

Marcadores morfológicos
A identificação de genótipos têm historicamente recorrido aos marcadores
morfológicos, remontando aos tempos de Mendel. Para várias culturas, incluindo o
milho (Zea mays L.) (COE & NEUFFER, 1993) e o trigo (Triticum aestivum L.)
(HART et al., 1993), foram desenvolvidos mapas de ligação genética usando essa
tecnologia. No entanto, a utilização de marcadores morfológicos no melhoramento de
plantas é acompanhada por várias limitações (PATERSON et al., 1991b). A influência
substancial dos genes associados aos marcadores morfológicos pode prejudicar a
análise genética de muitos caracteres de importância agronômica, devido a efeitos de
interações gênicas, como a epistasia. Além disso, o ambiente pode alterar a expressão
dos marcadores morfológicos, gerando complicações na análise. Vários estudos
empregaram marcadores morfológicos para caracterizar agrupamentos de variedades
em diferentes espécies (SORRELLS et al., 1993). Esses estudos pressupõem que
semelhanças morfológicas refletem semelhanças genéticas. No entanto, os marcadores
morfológicos têm sido menos utilizados na elaboração de mapas genéticos para
caracteres agronômicos devido às limitações previamente mencionadas.

Marcadores moleculares
A tecnologia de marcadores moleculares possibilita a análise genética eficiente de
um grande número de genótipos, usando procedimentos relativamente simples e
rápidos. Essas técnicas têm o potencial de impulsionar avanços significativos na
seleção de genitores, tanto em termos de capacidade específica quanto de combinação
geral, para a formação de populações superiores. Da mesma forma, essa tecnologia
pode ser valiosa na identificação de marcadores associados a genes de importância
agronômica. Como resultado, os programas de melhoramento genético podem realizar a
seleção de genitores com maior precisão e objetividade, resultando na formação de
populações segregantes com uma alta proporção de genótipos superiores. Apesar dos
custos envolvidos e do conhecimento técnico requerido, é provável que essa tecnologia
seja cada vez mais adotada por diversos programas de melhoramento, devido à alta
conservação das constituições genéticas entre diferentes populações dentro da mesma
espécie e entre espécies relacionadas evolutivamente. Os marcadores moleculares
podem ser classificados em dois tipos principais: aqueles baseados em enzimas (como
isoenzimas e aloenzimas) e aqueles baseados em ácidos nucleicos (marcadores de
DNA) (PATERSON et al., 1991).

Marcadores moleculares enzimáticos

A capacidade de separar proteínas com base no ponto isoelétrico e no peso
molecular pode ser valiosa na caracterização de proteínas de sementes e na distinção
entre diferentes indivíduos. Vários pesquisadores têm empregado enzimas para avaliar
a variabilidade genética em diferentes variedades de diversas espécies. Por exemplo,
HENN et al. (1992) utilizaram seis isoenzimas para analisar dezessete cultivares de
tomate, constatando que, mesmo em enzimas com baixo grau de polimorfismo, o
método era eficaz para distinguir as cultivares de tomate. SMITH & SMITH (1988)
afirmaram que marcadores moleculares baseados em enzimas permitiam uma distinção
significativa entre variedades de milho; no entanto, ressaltaram a importância de usar
um maior número de marcadores para uma amostragem abrangente do genoma. Em
cereais de inverno, marcadores enzimáticos têm sido empregados na análise de relações
filogenéticas entre espécies próximas, sobretudo em trigo e aveia (JAASKA, 1980; DE
LA HOZ & FOMINAYA, 1989). No entanto, BEER et al. (1993) indicaram que esses
marcadores eram ineficazes para estimar a distância genética entre linhagens de Avena
sterilis L. De forma semelhante, NODARI (1993) apontou que o número limitado de
sistemas enzimáticos apresentava restrições, dependendo dos objetivos da pesquisa ou
da atividade em questão.

RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) representaram o primeiro
marcador de DNA utilizado na construção de mapas genéticos na espécie humana
(Botstein et al., 1980). Rapidamente, os RFLPs se tornaram uma ferramenta
amplamente empregada em várias áreas da genética vegetal. A técnica dos RFLPs
baseia-se na digestão do DNA genômico com enzimas de restrição. Os fragmentos de
DNA resultantes são separados em gel de agarose e posteriormente transferidos para
membranas de nylon ou nitrocelulose, onde são hibridizados com sondas de DNA que
são complementares a sequências genômicas específicas. Essas sondas podem ser
marcadas com nucleotídeos radioativos ou quimioluminescentes. Após cada
hibridização, as membranas contendo os fragmentos de DNA fixados são expostas a um
filme de raios X e submetidas ao processo de revelação. O polimorfismo é detectado
quando ocorre a perda ou a adição de sítios de restrição, que são sequências de quatro a
seis nucleotídeos reconhecidas pelas enzimas de restrição usadas na digestão do DNA.
Além disso, inserções, deleções ou outros rearranjos entre dois desses sítios também
podem alterar o tamanho dos fragmentos e são identificados pela presença de uma
região homóloga à sonda de DNA. Esses fragmentos se tornam polimórficos quando
exibem qualquer um dos rearranjos genéticos mencionados, sendo, assim, usados para
caracterizar indivíduos com diversidade genética. Os marcadores RFLPs são herdados
de maneira codominante, o que permite identificar genótipos homozigotos e
heterozigotos. Essa característica é uma das vantagens dos RFLPs, uma vez que
possibilita uma análise detalhada da ação dos genes e da interação entre alelos em
estudos de mapeamento de características quantitativas (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Além disso, outra vantagem significativa dos RFLPs é que eles representam loci
únicos em cada genoma, permitindo a utilização de sondas de DNA heterólogas para
realizar mapeamento comparativo entre espécies relacionadas. No entanto, uma grande
limitação dessa técnica é a necessidade de construir bibliotecas genômicas para obter
sondas. Em parte, essa limitação é superada em muitas culturas de interesse econômico,
que têm acesso a um grande número de sondas de DNA disponíveis gratuitamente em
instituições públicas internacionais. Além disso, as sondas heterólogas podem ser
usadas para mapear regiões de interesse entre espécies ou gêneros relacionados. Uma
desvantagem importante é a complexidade técnica da técnica RFLP, que requer
laboratórios bem equipados e mão-de-obra especializada.

RAPD
A introdução da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (Mullis &
Faloona, 1987) e seus subsequentes aprimoramentos, incluindo a utilização de uma
enzima DNA polimerase termoestável e termocicladores programáveis de alta
capacidade, revolucionou a síntese in vitro de DNA. A técnica de PCR envolve a
síntese enzimática in vitro de um segmento de DNA, delimitado por um par de primers
contendo sequências específicas de nucleotídeos em fita simples. Os primers são
sequências curtas de DNA que emparelham com o DNA molde e servem como
iniciadores para a síntese in vitro de uma nova fita de DNA. O processo ocorre em
ciclos alternados de temperatura, com cada ciclo do PCR compreendendo três etapas.
Na primeira etapa, a fita dupla de DNA é desnaturada; em seguida, os primers se ligam
às sequências complementares específicas que cercam o local-alvo, permitindo a síntese
da nova fita de DNA a partir das extremidades 3'-OH livres dos primers, mediada pela
enzima DNA polimerase. Como os ciclos são repetidos várias vezes, a amplificação do
DNA-alvo ocorre em progressão geométrica, com a exigência de quantidades mínimas
de DNA molde. A facilidade, rapidez e sensibilidade dessa técnica deram origem a uma
nova geração de marcadores moleculares baseados em PCR. O primeiro deles foi o
DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD) (Williams et al., 1990) ou Reação em
Cadeia da Polimerase com Primers Arbitrários (AP-PCR) (Welsh & McClelland,
1990). O RAPD é uma variante da técnica de PCR que utiliza um único primer de dez
nucleotídeos com sequência arbitrária. Para que um fragmento de DNA seja
amplificado, duas regiões complementares ao primer devem estar presentes, separadas
por até 2.000 pares de bases e em orientações opostas. Isso permite a amplificação de
fragmentos de DNA distribuídos aleatoriamente no genoma, sem a necessidade de
conhecimento prévio da sequência de DNA.
A detecção dos produtos da amplificação é realizada em gel de agarose tratado com
brometo de etídio e visualizado sob luz ultravioleta. O polimorfismo no RAPD ocorre
devido a mutações pontuais, deleções no local de pareamento do primer ou inserções
entre os locais de pareamento, que afetam a amplificação. O RAPD é uma técnica de
execução simples e de baixo custo, aplicável a uma ampla variedade de organismos. No
entanto, enfrenta desafios relacionados à reprodutibilidade dos padrões de amplificação
e à baixa quantidade de informações genéticas por loco, uma vez que os marcadores são
dominantes. Esses marcadores permitem a detecção de apenas um alelo por loco, o que
significa que a presença de uma banda no gel identifica indivíduos homozigotos
dominantes (AA) e heterozigotos (Aa), mas não permite a distinção entre eles. O
homozigoto recessivo (aa) é identificado pela ausência da banda.
Os avanços no processo de sequenciamento de DNA e os projetos de
sequenciamento de genomas eucarióticos têm levado a um grande acúmulo de
informações sobre sequências de DNA. Isso permitiu a conversão de marcadores
RAPD, RFLP e informações de sequências gênicas em primers específicos para
análises genéticas detalhadas por meio da técnica de PCR. Sondas genômicas de RFLP,
originalmente usadas no mapeamento do genoma humano, foram as primeiras a serem
sequenciadas e amplificadas com primers específicos, sendo chamadas de Tags de
Sequência (STS) (Olson et al., 1989). Quando as sondas usadas para sequenciamento
são obtidas de bibliotecas de DNA, são denominadas Tags de Sequência Expressa
(EST). Os fragmentos de DNA resultantes da amplificação específica das sondas de
RFLP podem ser clivados com enzimas de restrição, gerando um tipo de marcador
molecular conhecido como Sequências Amplificadas Polimórficas Clivadas (CAPS)
(Konieczny & Ausubel, 1993 e Jarvis et al., 1994). Esses marcadores mantêm as
vantagens práticas do PCR, preservando a natureza co-dominante e alélica do RFLP.
Marcadores RAPD também podem ser sequenciados e convertidos em primers
específicos para amplificação por PCR, sendo denominados Regiões Amplificadas
Caracterizadas por Sequência (SCAR) (Paran & Michelmore, 1993), oferecendo uma
maior especificidade de amplificação, embora mantenham a sua natureza dominante.

Microssatélites ou SSR
Os genomas de organismos eucarióticos contêm diversas classes de sequências
repetidas, sendo uma delas os microssatélites (Litt & Luty, 1989) ou Repetições de
Sequências Simples (SSR). Esses microssatélites consistem em repetições curtas de um
a quatro nucleotídeos, com sequências flanqueadoras conservadas dentro de uma
espécie. Isso possibilita a seleção de primers de PCR para amplificar os SSRs. O
polimorfismo no tamanho dos fragmentos resultantes ocorre devido às variações no
número de repetições das sequências simples. Os marcadores de microssatélites
rapidamente ganharam destaque na genética humana para a construção de mapas de
ligação e a identificação de indivíduos. Em plantas, os microssatélites são amplamente
distribuídos aleatoriamente ao longo do genoma e são frequentes, tornando-os valiosos
na construção de mapas genéticos. Uma das principais vantagens dos microssatélites é
que eles são co-dominantes e multialélicos, oferecendo uma rica fonte de informação
genética por loco. Rongwen et al. (1995) caracterizaram 96 genótipos de soja com sete
primers de microssatélites e encontraram de 11 a 26 alelos por loco.
Em comparação, marcadores RFLP, conforme relatado por Keim et al. (1989, 1992),
utilizaram inicialmente 17 sondas de RFLP para caracterizar 58 genótipos de soja e,
posteriormente, 132 sondas de RFLP para caracterizar 38 genótipos. No primeiro
experimento, apenas duas sondas e, no segundo, apenas três, apresentaram mais de dois
alelos. A co-dominância dos marcadores microssatélites, quando associada a locos de
interesse, permite a obtenção de informações sobre o tipo de interação gênica entre
diferentes locos. Além disso, os marcadores SSR são altamente reprodutíveis e estáveis
dentro de uma espécie, o que facilita sua utilização em diferentes grupos de pesquisa
para seleção assistida e integração de mapas genéticos.
A técnica de microssatélites é de fácil execução e pode ser amplamente
automatizada, pois se baseia na PCR. No entanto, a detecção do polimorfismo requer
géis de alta resolução devido às pequenas diferenças de tamanho entre os segmentos
amplificados em termos de pares de bases. A principal limitação do método está na
obtenção dos primers específicos para flanquear regiões altamente repetitivas ou
microssatélites. Essa etapa envolve a construção de bibliotecas genômicas enriquecidas
com os microssatélites de interesse, métodos eficientes para o rastreamento das
bibliotecas e sequenciamento em larga escala de DNA, exigindo laboratórios com
infraestrutura especializada. No entanto, essa limitação tem sido superada rapidamente,
com um grande número de primers SSR disponíveis no mercado para diversas espécies
de importância econômica. Isso torna a técnica de microssatélites compatível com o
RAPD ou PCR convencional, com a necessidade de apenas algumas cubas adicionais
para eletroforese em géis de acrilamida. Além disso, como apenas um loco é
amplificado em cada indivíduo, é possível utilizar primers multiplex no mapeamento
genético, tornando a técnica ainda mais acessível em termos de custo. Essa estratégia
envolve o uso de dois ou mais pares de primers na mesma reação de PCR, desde que
esses primers não tenham homologia cruzada e amplificam alelos de tamanhos
diferentes.

AFLP
O Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP) é uma categoria
relativamente recente de marcadores que combina a especificidade dos locais de
restrição do RFLP com a praticidade da amplificação do PCR, tornando-se uma
ferramenta poderosa na caracterização de genomas e no mapeamento genético (Vos et
al., 1995). Essa técnica é fundamentada na digestão simultânea do DNA genômico com
duas enzimas de restrição, com o EcoRI e MseI sendo as mais comuns. Adaptadores
específicos com terminais que complementam as extremidades coesas dos locais de
restrição são anexados aos fragmentos de DNA digeridos. São utilizados dois
adaptadores específicos, um para cada local de restrição. Os fragmentos digeridos com
os adaptadores são então submetidos a uma reação de PCR com primers pré-seletivos,
cuja sequência complementa a dos adaptadores, acrescida de um nucleotídeo arbitrário
em sua extremidade 3'. A amplificação pré-seletiva tem como finalidade aumentar a
proporção dos fragmentos de interesse que contêm os locais de restrição do EcoRI e
MseI, bem como realizar uma seleção preliminar desses fragmentos. Posteriormente, os
fragmentos pré-amplificados passam por reações de amplificação seletiva, utilizando
primers com a mesma sequência dos primers pré-seletivos, acrescida de dois
nucleotídeos arbitrários em sua extremidade 3'. A detecção dos fragmentos
polimórficos ocorre em um gel de sequenciamento, com o uso de um dos primers
seletivos marcado com radioatividade ou fluorescência.
O AFLP oferece a vantagem de uma detecção substancial de variabilidade genética,
explorando tanto polimorfismos de restrição quanto de amplificação. Isso permite
resolver numerosos fragmentos polimórficos em um único gel de sequenciamento.
Devido ao uso de primers relativamente longos, com cerca de 20 pares de bases, a
especificidade das reações é consideravelmente aumentada em comparação com o
RAPO. Portanto, o AFLP combina a capacidade de explorar regiões genômicas
arbitrárias sem a necessidade de conhecer previamente as sequências de DNA, com a
alta especificidade da técnica de PCR. No entanto, o AFLP possui uma limitação
semelhante ao RAPO em termos de baixo conteúdo de informação genética por locus,
uma vez que esses marcadores são predominantemente dominantes. Como o AFLP
envolve várias etapas, incluindo a digestão do DNA com enzimas de restrição, é uma
técnica trabalhosa que requer DNA genômico de alta qualidade e um maior número de
reagentes, tornando-a relativamente dispendiosa. Além disso, a resolução dos
polimorfismos deve ser realizada em géis de sequenciamento, utilizando marcação por
radioatividade ou fluorescência, o que não está ao alcance de todos os laboratórios
devido à complexidade dessas metodologias.

Aplicações dos marcadores moleculares no melhoramento genético

Diversos tipos de marcadores moleculares estão disponíveis, oferecendo uma ampla
capacidade de amostragem do genoma. Esses marcadores têm um imenso potencial
para avaliar a diversidade genética em várias aplicações, incluindo filogenia, evolução,
melhoramento genético e a manutenção de bancos de germoplasma. Através dos
marcadores, os genótipos são avaliados, e as bandas compartilhadas por todos os
indivíduos são interpretadas como semelhanças genéticas, enquanto as bandas não
compartilhadas indicam diferenças genéticas. Os resultados são codificados para gerar
uma matriz de similaridade (ou dissimilaridade), que pode ser interpretada graficamente
por meio de análise de agrupamento ou análise multivariada.
A escolha dos genitores e o planejamento dos cruzamentos são etapas cruciais para o
sucesso de um programa de melhoramento (Borém, 1997). Essas etapas podem ser
facilitadas com o auxílio de marcadores moleculares, que fornecem aos melhoristas
informações genéticas adicionais e detalhadas sobre os genótipos, aumentando a
probabilidade de obter cultivares superiores. Em espécies perenes, como frutíferas e
árvores florestais, a identificação e seleção de genitores superiores são particularmente
críticas devido ao longo tempo necessário para desenvolver uma cultivar melhorada.
Estudos de diversidade genética realizados com 38 cultivares de soja no Brasil,
utilizando marcadores RAPD, mostraram uma correlação estreita com informações
genealógicas. Essas informações foram altamente úteis na seleção de genitores para o
Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja na Universidade Federal de Viçosa
(UFV) (Abdelnoor et al., 1995). Da mesma forma, a análise da diversidade genética
entre genitores de feijoeiro, utilizando marcadores RAPD e proteínas de reserva,
agrupou as cultivares com base em sua origem evolutiva, permitindo uma
caracterização mais detalhada dos genótipos dentro de cada grupo (Vasconcelos et al.,
1996). Em programas de retrocruzamento, a seleção de genitores doadores de genes de
interesse que sejam geneticamente mais semelhantes aos genitores recorrentes pode
acelerar a recuperação do genoma destes. Portanto, o estudo da diversidade genética
auxiliado por marcadores moleculares pode orientar os cruzamentos, favorecendo a
obtenção de cultivares superiores.
O estudo da diversidade genética dentro dos bancos de germoplasma é fundamental
para otimizar a manutenção e o manejo das coleções básicas, além de facilitar o acesso
dos melhoristas a essas coleções. No caso das linhagens de milho em grupos
heteróticos, a medição da distância genética usando RFLP tem sido valiosa na
classificação dessas linhagens, bem como na alocação de novas linhagens de origem
desconhecida nos diferentes grupos (Dudley et al., 1992 e Livini et al., 1992). O
monitoramento de cruzamentos em pomares de sementes de espécies florestais tem
assegurado uma combinação genética favorável entre os indivíduos selecionados
(Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Fingerprinting e proteção de cultivares

A caracterização de variedades, linhagens ou híbridos usando marcadores de DNA é
de extrema relevância para proteger os direitos de propriedade intelectual dos
melhoristas, sendo amplamente utilizada como evidência legal em processos jurídicos
nos países com leis de proteção de cultivares vigentes. Com a promulgação da Lei de
Proteção de Cultivares no Brasil, Lei n° 9.456, de 25 de abril de 1997 (Brasil, 1997), o
Serviço Nacional de Proteção de Cultivares (SNPC), vinculado ao Ministério da
Agricultura, tornou-se responsável pelo registro e proteção de novas variedades. Para
obter proteção, uma variedade deve demonstrar sua distinção de qualquer outra da
mesma espécie. Atualmente, a proteção de cultivares é baseada em descritores
morfológicos, como cor de flor, pubescência, padrão de crescimento, formato da folha,
ciclo, resistência a doenças, entre outros.
Em espécies com uma base genética limitada, como a soja, na qual as variedades são
obtidas através da hibridação de um grupo de parentais geneticamente semelhantes, as
novas variedades frequentemente se assemelham muito e podem ser indistinguíveis
com base nessas características. Além disso, à medida que mais variedades são
protegidas no banco de dados do SNPC, torna-se cada vez mais desafiador diferenciar
novas variedades das já existentes. Portanto, um sistema baseado em marcadores de
DNA que possa identificar uma combinação única de marcadores, criando uma
"impressão digital" (fingerprint) para cada variedade, torna-se essencial para facilitar a
proteção de novas variedades e garantir os direitos de propriedade intelectual dos
melhoristas. A utilização de marcadores multialélicos altamente conservados, como os
SSRs, permite a obtenção de um padrão único para cada variedade. Por exemplo,
Rongwen et al. (1995), usando sete marcadores de microssatélites, conseguiu distinguir
95 dos 96 genótipos de soja. Os dois genótipos que tinham alelos idênticos nos sete loci
eram intimamente relacionados, com uma similaridade de 93,4% com base na
genealogia. Russell et al. (1997), ao estudar 11 loci de SSR em 24 genótipos de cevada,
identificaram três combinações de quatro SSRs que distinguiam todos os genótipos
avaliados. Eles conseguiram até mesmo diferenciar duas linhagens irmãs que tinham
uma distância genética nula com base na genealogia.
Os marcadores moleculares, ao discernir a contribuição genética de cada genitor em
sua descendência, podem ser usados para monitorar a pureza genética de sementes
híbridas ou linhagens, determinar a taxa de polinização cruzada em espécies autógamas
e avaliar o tipo de fecundação predominante em espécies menos estudadas. A eficácia
dos métodos de fingerprinting molecular na discriminação de variedades depende do
número de marcadores empregados e da frequência de cada locus dentro da espécie,
sendo necessária uma avaliação prévia da variabilidade genética dos loci para cada
espécie em questão (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Análise de pureza genética de sementes

Assim como os marcadores de DNA são valiosos na identificação de cultivares, eles
desempenham um papel fundamental na determinação da pureza genética de sementes,
especialmente para fins de certificação e fiscalização de sementes. Normalmente, as
misturas varietais são identificadas com base em características visuais das sementes,
plântulas e, em alguns casos, com a ajuda da eletroforese de proteínas da semente. No
caso da soja, a análise de pureza genética de sementes frequentemente se baseia na cor
do hilo, a coloração do hipocótilo e a reação à peroxidase. No entanto, essas
características fornecem informações limitadas, pois a cor do hipocótilo e a reação à
peroxidase geralmente resultam em apenas dois resultados possíveis, classificando as
variedades em quatro grupos distintos. A cor do hilo, embora tenha mais variações
possíveis, também apresenta desafios, uma vez que algumas variedades podem mostrar
tonalidades diferentes devido a condições ambientais específicas, o que pode dificultar
a distinção entre variedades de cores semelhantes. Por exemplo, variedades com hilo
preto imperfeito podem ser confundidas com aquelas que têm hilo preto ou mesmo hilo
marrom. O laboratório de Genética Molecular de Plantas do Instituto de Biotecnologia
Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO BIOMOL) da UFV realiza análises de pureza
genética em sementes de soja com base no DNA, a pedido da Delegacia Regional do
Ministério da Agricultura e do Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA). Sementes
consideradas atípicas devido à cor do hilo diferente do padrão estabelecido para a
variedade são submetidas a análises de DNA, utilizando marcadores SSR, juntamente
com sementes da variedade à qual as sementes atípicas pertencem. Os resultados
demonstraram que a diferença na cor do hilo nem sempre indica mistura varietal. Em
alguns casos, sementes de hilo preto imperfeito encontradas em lotes de sementes de
hilo marrom são geneticamente idênticas às sementes do lote. O uso de marcadores de
DNA se revela uma ferramenta altamente eficaz na análise de pureza genética de
sementes, especialmente quando as características visuais levantam dúvidas. Até o
momento, essa análise tem dependido da exploração abrangente da variabilidade
genômica, utilizando primers distribuídos pelo mapa genético da cultura. Além das
sementes atípicas, várias sementes do lote em análise são testadas para determinar a
variabilidade intra-varietal, e sementes de outras variedades são usadas como controles,
especialmente quando as sementes atípicas e as do lote são idênticas. No entanto, essa
estratégia, que envolve vários controles e amostragens no lote de sementes, aumenta o
tempo e os custos das análises. Portanto, surge a necessidade de realizar uma
caracterização molecular das variedades de diversas culturas economicamente
importantes por meio de marcadores de DNA. Isso aceleraria o processo e reduziria os
custos das análises de pureza genética de sementes, além de ser uma ferramenta valiosa
nos processos de proteção de cultivares. Dessa forma, a análise de sementes atípicas
pode ser realizada simplesmente com primers que caracterizam a variedade, e os alelos
obtidos podem ser comparados aos característicos da variedade. Além disso, ao utilizar
DNA extraído da própria semente (McDonald et al., 1994), os resultados podem ser
obtidos em um período ainda mais curto, tornando-o compatível com os procedimentos
de certificação de sementes.

Melhoramento genético auxiliado por marcadores moleculares

 Atualmente, a aplicação de marcadores moleculares em programas de introdução de
genes por meio de retrocruzamento é um exemplo concreto de melhoramento genético
assistido por marcadores. Germoplasmas não adaptados são incorporados em
programas de melhoramento com o objetivo de introduzir características de herança
simples, como resistência a doenças. A utilização de marcadores moleculares
associados a genes de interesse desempenha um papel crucial na seleção de genótipos
resistentes, especialmente quando o programa de melhoramento visa incorporar dois ou
mais genes de resistência, quando o fenótipo é complexo ou quando o processo de
avaliação envolve a destruição da planta, como é o caso da nematoide do cisto da soja.
Além de rastrear a presença do gene de interesse, a genotipagem molecular permite a
seleção de genótipos mais semelhantes ao genótipo recorrente e com melhor conversão
na região próxima ao gene inserido. Isso reduz significativamente o número de ciclos
de retrocruzamento necessários para recuperar o genótipo recorrente, acelerando o
desenvolvimento de variedades melhoradas (Openshaw et al., 1994).
A maioria desses trabalhos tem sido focada na associação de marcadores
moleculares a características de herança simples, uma vez que as variações fenotípicas
são facilmente mensuráveis e analisáveis. Linhagens isogênicas, que são geneticamente
semelhantes, exceto na região genômica onde um gene de interesse foi introduzido, são
criadas por meio de repetidos ciclos de retrocruzamentos. Essas linhagens, que diferem
apenas na região de interesse, têm sido usadas com sucesso para identificar marcadores
associados a genes de resistência em várias espécies de importância econômica, como o
vírus TMV em tomate (Young et al., 1988), Pseudomonas em tomate (Martin et al.,
1991) e Phytophthora megasperma na soja (Diers et al., 1992).
Outra abordagem que revolucionou a identificação de regiões genômicas ligadas a
características de herança simples é a técnica de Bulks Segregantes (BSA), proposta por
Michelmore et al. (1991). Essa metodologia envolve a criação de dois grupos de DNA
contrastantes para uma característica fenotípica entre os indivíduos de uma população
segregante. Cada grupo contém uma mistura de DNAs de indivíduos com fenótipo
semelhante para a característica de interesse. Assim, todos os indivíduos em um grupo
compartilham uma mesma região genômica que contém o gene de interesse, enquanto
segregam para as outras regiões. Portanto, um marcador que co-segrega com os grupos
têm uma alta probabilidade de estar ligado à característica em questão, sem a
necessidade de genotipar um grande número de indivíduos ou construir um mapa
genético completo. Vários exemplos de sucesso dessa técnica incluem a identificação
de marcadores RAPD e RFLP associados a genes de resistência ao míldio em alface
(Michelmore et al., 1991, Paran et al., 1991, e Paran & Michelmore, 1993). Além disso,
Alzate-Marin (1996) identificou marcadores RAPD ligados em fase de acoplamento e
de repulsão a genes de resistência ao Colletotrichum lindemuthianum, o agente causal
da antracnose do feijoeiro. De forma semelhante, um marcador RAPD co-dominante foi
identificado em relação ao gene que confere resistência ao cancro da haste da soja
(Carvalho, 1995). Regiões genômicas que controlam outras características importantes,
como o amadurecimento do fruto e a abscisão do pedúnculo em tomate, também foram
detectadas usando essa estratégia (Giovannoni et al., 1991). A abordagem de BSA
também pode ser aplicada na identificação de loci de caracteres quantitativos,
chamados de QTLs (Quantitative Trait Loci), que têm um grande efeito sobre a
característica de interesse. Utilizando essa estratégia, Schuster (1999) identificou seis
marcadores moleculares (quatro RAPD e dois SSR) associados à resistência da soja ao
nematoide de cisto da soja (NCS). Esses marcadores moleculares constituíram um
grupo de ligação contendo um QTL responsável por 56% da resistência à raça 9 e 39%
da resistência à raça 14 do NCS. Cervigni (1999) identificou dois marcadores SSR
flanqueando um QTL que explicava 30% da resistência da soja à raça 3 do NCS.
Marcadores associados a genes de interesse fornecem um ponto de partida para a
clonagem desses genes com base em mapas genéticos.

Mapeamento de caracteres complexos

A maioria dos caracteres de importância econômica é regida por um controle
genético complexo, envolvendo a ação de vários genes, o que torna desafiadora sua
manipulação e compreensão. As regiões genômicas que contêm loci gênicos associados
a esses caracteres complexos são denominadas QTLs (Quantitative Trait Loci). A
análise de marcadores moleculares, por meio de metodologias estatísticas
implementadas em programas de mapeamento de QTLs, têm possibilitado a
desmontagem desses caracteres complexos em fatores mendelianos mais simples. O
mapeamento de QTLs permite a estimativa do número e da localização dos genes que
influenciam a variação fenotípica de um traço, a magnitude de seus efeitos e suas
interações com outros QTLs. A capacidade de detectar QTLs por meio de marcadores
moleculares depende da magnitude do efeito do QTL, do tamanho da população
estudada e do nível de saturação do mapa genético. O mapeamento de QTLs baseia-se
em testes de associação entre marcadores moleculares e os dados fenotípicos, usando
várias metodologias estatísticas. Os procedimentos mais simples para identificar essas
associações são os modelos de regressão linear e análise de variância, que avaliam a
distribuição dos valores fenotípicos para cada marcador de forma independente.
Embora essa metodologia seja simples e flexível, ela não permite identificar a posição
exata do QTL nem estimar a magnitude de seu efeito. Uma alternativa para aumentar o
poder de detecção e a precisão das associações, bem como para estimar a posição e o
efeito dos QTLs, é o mapeamento por intervalo, conforme proposto por Lander &
Botstein (1989). Essa metodologia utiliza o método da máxima verossimilhança para
estimar a posição mais provável e a magnitude do QTL em intervalos entre dois
marcadores adjacentes no mapa genético. Embora ofereça estimativas mais precisas, o
mapeamento por intervalo é mais complexo e requer a construção de mapas genéticos e
o uso de programas computacionais específicos para análise.
Recentemente, novos modelos foram propostos para aprimorar a resolução do
mapeamento de QTLs, incluindo o mapeamento por intervalo composto, múltiplos
QTLs e mapeamento por intervalos múltiplos. Um desafio nas análises de QTLs é o
grande número de testes realizados, o que dificulta o estabelecimento de níveis de
significância estatística. Para aprimorar a confiabilidade dos resultados, foram
desenvolvidos testes de permutação não paramétricos, que se baseiam na reamostragem
dos dados originais. Esses testes de permutação são robustos na determinação dos
níveis de significância para as associações entre QTLs e marcadores, uma vez que se
adaptam a cada experimento, independentemente da distribuição dos dados.
3. Conclusão
Com este trabalho, não se espera esgotar o assunto relacionado aos organismos
geneticamente modificados (OGMs). Existem diversas questões a serem respondidas,
especialmente no que se refere aos efeitos em longo prazo resultantes do consumo de
OGMs. Também existem dúvidas relacionadas aos efeitos dos OGMs sobre a
biodiversidade e a possibilidade de contaminação das variedades nativas pelas
geneticamente modificadas no meio ambiente, através da polinização. Assim, inúmeros
estudos encontram-se em andamento nas mais diversas áreas, tais como na área médica,
animal e vegetal, visando conhecer os efeitos, bem como responder aos
questionamentos relacionados a OGMs. A utilização de marcadores moleculares com
base em DNA proporcionou uma evolução muito grande na genética e no
melhoramento de plantas nos últimos anos.
É importante esclarecer que a utilização de um tipo de marcador deve ser norteada
pelos objetivos a serem alcançados, pela complexidade, diversidade genética da cultura
e pela estratégia de melhoramento. Assim, não existe uma técnica perfeita, e cada
situação deve ser avaliada, para que a escolha dos tipos de marcadores adaptem-se a
cada uma delas. As possibilidades de aplicações dos marcadores moleculares são
inúmeras, desde a mais simples como estudos da diversidade genética de espécies até
trabalhos mais complexos de clonagem de genes com base em mapas de ligação. O
grande desafio é tornar essas técnicas mais eficientes, automatizando etapas com a
possibilidade de analisar um maior número de dados com rapidez e redução de custos.
A combinação dos métodos de melhoramento, das metodologias estatísticas e das
tecnologias moleculares traz novas perspectivas para o conhecimento genético e para a
aceleração dos programas de melhoramento, bem como aplicações práticas nos
processos de proteção de cultivares e de análises de pureza genética de sementes, entre
outras.
4. Referências

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