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Primers..
Serve como um ponto de
partida para a replicação de
DNA. A DNA polimerase não
é capaz de iniciar a síntese
de uma nova cadeia de DNA
a partir de zero, podendo
apenas adicionar a uma
cadeia de nucleotídeos
existentes.
Primers determinam o sucesso de uma PCR!
Specificity?
Proper
annealing to
the template?
Comprimento do Primer
• Comprimento ideal:
18-24 bp para PCR comum
30-35 bp para PCR multiplex
Tamanho do amplicon
Homologia Cruzada
• Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA genômico
ou consiste de fragmentos de genes mistos.
• Os iniciadores contendo a sequência altamente repetitiva são
propensos a gerar produtos de amplificação não específicos,
quando a amplificação de DNA genômico.
Para evitar amplificação não específica..
Além da temperatura e comprimento ideal dos primers:
Grampos
• Formados por interações intra-moleculares
no mesmo primer
Auto-dímero (homodímero)
• Formado por interações inter-moleculares
entre dois iniciadores iguais
Cross-dímero (heterodímero)
• Formado por interações inter-moleculares
entre os primers sense e antisense
Softwares..
Primer3 (gratuito)
Primer BLAST (NCBI) – importante principalmente para fazer scan genômico
e avaliar possíveis anelamentos inespespecíficos