Marcadores Moleculares

Profª Dra. Letícia da Conceição Braga

 Definição

Polimorfismos genéticos: Variações nas sequências de DNA que

ocorrem na população geral de forma estável, sendo encontradas
com frequência de 1% ou superior.

Marcadores genéticos moleculares

 Polimorfismo de DNA
◦ Mutações pontuais: substituição ou inserção/deleção
◦ macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções
Mutações pontuais
Substituições de nucleotídeos

A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGATCAGCAT

A’. ATCTCGTGATTATAGTCGTA
TAGAGCACTAATATCAGCAT

Pequenas deleções e/ou inserções - InDels

B. ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT

B’. ATCTCGT---GTCGTA
TAGAGCA---CAGCAT
 SNP

Sequenciamento

(I) Microssatélites
(II) Minissatélites

PCR
Southern blot

RAPD
AFLP
RFLP

PCR
Classificação dos marcadores moleculares

 Marcadores aleatórios (RDM- Randon DNA markers): são

gerados aleatoriamente, de sítios polimórficos do genoma.

 Marcadores gene-alvo ( GTM- gene targeted marker):são

derivados de polimorfismos dentro de genes.

 Marcadores funcionais (FM- Functional markers): são

derivados de sítios polimórficos dentro de genes envolvidos
em determinada variação fenotípica .
 Tipos de marcadores moleculares
Imunoensaios
 Isoenzimas Citometria de fluxo
eletroforese uni ou bidirecional
espectrometria de massa
Northern Blotting
 RNA RT-PCR
Microarray
PCR em Tempo Real
Southern blotting

RFLP
 DNA PCR
Sequenciamento
CGH
Marcadores Moleculares detectáveis por
Hibridização
Sequência de DNA
ATGCTCGACGTTCGACTTAGC
CTGCAAGCT

Sequência da Sonda
Marcadores Moleculares detectáveis por
amplificação
Isoenzimas
 Grupo de múltiplas formas moleculares de uma
proteína, resultante de variações alélicas em sequências
codificantes.

 Rápido
 Simples
 Baixocusto
 Marcadores codominates

 Baixo nº de polimorfismos
 Influência ambiental
Marcadores Genéticos Moleculares
 RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)
 RAPD (Random amplification of polymorphic DNA)
 VNTR (Variable number tandem repeat)
 SSR (Simple sequence repeats or Microsatellite
polymorphism)
 STR (Short tandem repeat)
 SNP (Single nucleotide polymorphism)
 Restriction Fragment Length Polymorphism
- RFLP
 Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição
 RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de
restrição de DNA específicos
 Polimorfismo deriva de mutação pontual: substituição,
inserção, deleção
 Utiliza-se DNA celular total
 São marcadores codominantes
 Apresentam alta reprodutibilidade
RFLP
 Marcador RFLP

Extração de DNA genômico

Quantificação de DNA
Tratamento do DNA com uma
enzima de restrição
apropriada PCR usando primers específicos
Eletroforese em gel de para o alvo
agarose Tratamento do DNA com uma
enzima de restrição
apropriada

Eletroforese em gel de
Hibridização com sonda agarose
marcada
Revelação com sonda
marcada
 RAPD- Fragmentos de DNA amplificados
ao acaso
 Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo
genoma.
 Utiliza “primers” curtos (8-12 nucleotídeos) e de sequencias
arbitrárias, com sequencias alvo desconhecida.
 Baseia-se na amplificação de DNA utilizando um único
“primer”.
 Detecta polimorfismo em apenas um par de bases.
 Não Permite distinguir heterozigotos.

 Baixa reprodutibilidade.
 RAPD (Amplificação Randômica de DNA
polimórfico)

Extração de DNA genômico

Quantificação de DNA

PCR usando primers randômicos

Eletroforese em gel de
agarose
RAPD

AA Aa aa
AA

Aa

aa
 PCR com primers arbitrários:
acúmulo de siglas!
 RAPD
◦ Random Amplified Polymorphic DNA
 DAF
◦ DNA Amplification Fingerprinting
 AP-PCR
◦ Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
 MAAP
◦ Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir
todas as pequenas variações na técnica)
 Microssatélites

◦ também conhecido como Simple Sequence Repeat (SSR),

 Seqüências curtas (2 a 9 bases) repetidas em tandem

 Normalmente locus simples e multi-alélico
 Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições
◦ Escorregamento da DNA polimerase durante a replicação
◦ Crossing-over desigual entre cromátides irmãs

 Codominante

 Altamente reprodutível
Sondas multilocais: VNTR (Variable Number
Tandem Repeat) ou STR (Short Tandem Repeats)
gtgtgtgtgtgt
..CTGATTCGAGCTAGG cacacacacaca TTGCTTGACAGGT..
..GACTAAGCTCGATCC gtgtgtgtgtgt AACGAACTGTCCA..

Alec Jeffreys, 1985

 PCR: Microssatélites = STR (Short Tandem
Repeats)

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG

GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

Primer FOR

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN

Repetição CA
Primer REV
VNTR (Número Variável de Repetições em Tandem)
STR (Short Tandem Repeats): aplicação no testes de
vínculo genético
 Extração de DNA genômico

Marcador VNTR e STR Quantificação de DNA Marcador STR

Tratamento do DNA com uma

enzima de restrição
apropriada PCR usando primers específicos
para o alvo
Eletroforese em gel de
agarose
Eletroforese em gel de
agarose

Hibridização com sonda

marcada
Revelação com sonda
marcada
Alec Jeffreys, 1985
 13 Loci STR com sua posição no
cromossomo
TPOX

D3S1358

TH01
D8S1179
D5S818 VWA
FGA D7S820
CSF1PO

AMEL

D13S317
D16S539 D18S51 D21S11 AMEL
SISTEMAS DE AMPLIFICAÇÃO
 PCR Multiplex

 Até 16 marcadores podem ser utilizados

por tubo.
 Pode ser utilizado pequenas quantidades de
DNA(1 ng)
 DNA de baixa qualidade e degradado.
 O uso de fluorescencias de cores diferentes
permitem a análise de produtos de PCR de
mesmo tamanho.
 SSR (Repetições de Sequência Simples) ou Microssatélites

- Simple sequence repeats (SSR) – 13.000 marcadores disponíveis

GACTAAGCTCG
..CTGATTCGAGCTAGG cacacacacaca TTGCTTGACAGGT..
..GACTAAGCTCGATCC gtgtgtgtgtgt AACGAACTGTCCA..
CTTGACAGGT

Indivíduo Número de repetições Fragmento pb

A 15 127
B 21 139

A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9
AFLP- Polimorfismo de comprimento de
fragmentos amplificados
 Marcadores AFLP são dominantes

 Grande poder de detecção de variabilidade genética.

 Da mesma forma que o ensaio de RAPD, o ensaio AFLP não requer

conhecimento prévio de sequencia de DNA.

 O ensaio de AFLP é bem mais eficaz quando comparado ao ensaio de

RAPD, pois na etapa de PCR, são utilizados primers bem mais longos,
o que aumenta a especificidade da amplificação
SNP- Single Nucleotide Polymorphism
(Polimorfismo de nucleotídeo único)
 Polimorfismo baseados na alteração de uma única base no
genoma
◦ Exemplo: AAGGTTA muda para ATGGTTA

 Podem ocorrer em regiões expressas e não expressas

 Abundância no genoma e elevado grau de polimorfismo
◦ Genoma humano: 90% polimorfismo
 Detecção de diferentes alelos para genes de interesse

 Sequenciamento de DNA em grande escala

SNP- Single Nucleotide Polymorphism
(Polimorfismo de nucleotídeo único)
 São encontrados no genoma em :
◦ Individuais
◦ Haplogrupos: mutações que ocorrem próximas e são herdadas
juntas

Indivíduo Sequencia encontrada Haplogrupo

1 GATATTCGTACGGATGTATC AG
2 GATGTTCGTACTGATGTATC GT