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Anlise e deteco de acidos nucleicos

Anlise e deteco de RNA


Porque analisar DNA: -Acesso a informaes genticas do individuo que permitem prever determinados fentipos -Identificao de indivduo -Confirmao da presena de gene de interesse em uma espcie

Anlise e deteco de RNA


Porque analisar RNA: -Acesso direto as mensagens codificantes (Sem introns) -Abundancia relativa pode ajudar a entender processos celulares -Comparao entre amostras diferentes (diversos tecido ou estgios de um ciclo de vida) permitem identificar genes crticos para determinados processos Desvantagem: RNA possui uma estabilidade muito menor que o DNA (Digesto por RNAses).

Abundancia relativa entre mRNAs


Em clulas de ovidutos de galinha -50% das moleculas de mRNA so transcritos de um nico gene (ovalbimina) (100.000 molculas por clula) -15% das molculas de mRNA so transcritos de 7 a 8 genes. -35% das moleculas de mRNA so transcritos de cerca de 13.000 genes (5 moleculas por gene)

Marcao da sonda atravs da sntese in vitro com nucleotdeos radioativos (32P-dATP)

Marcao da sonda com

32P

na extremidade 5(32P ATP)

Experimento de hibridizao
Hibridizao da membrana com sonda radioativa

Eletroforese do DNA em gel de agarose Exposio a filme de Raios-X

Transferncia para membrana

Southern Blot:Exemplo

Gel de Agarose 0h

Northern Blot 24h

28S

18S

Sonda Gene A

Gel de Agarose 0h

Northern Blot 24h

28S

18S

Sonda Gene B

Quantificaes de cidos nuclicos via PCR A quantidade de produto de PCR amplificado de diferentes amostras proporcional a quantidade de acido nuclico presente nesta amostra, devido a isso pode-se utilizar o PCR para quantificao de amostras. No entanto: -Nos ciclos finais do PCR ocorre uma saturao de produto, que passa competir com o primer na renaturao. Devido a isso, neste estagio a quantidade de produto amplificado deixa de ser proporcional a quantidade inicial. -Cada primer possui eficincia diferente portanto comparaes diretas entre amplificaes com diferentes primers no possvel.

PCR Semi-quantitativo

Real-Time PCR (PCR em tempo real)

Pode-se utilizar sondas (figura acima) ou molculas que possuem fluorescncia maior quando ligadas a dupla fita do DNA (SYBR green)

Real-Time PCR (PCR em tempo real)

Para ser quantitativa a medida deve ser feita no perodo antes da saturao da reao de PCR

Anlises de DNA para o diagnstico clnico


Como o DNA pode se relacionar com um diagnostico clinico: -Uma serie de doenas genticas so causadas por mutaes em genes conhecidos. -Possibilidade de diagnosticar portadores assintomticos. -Organismos patolgicos podem ter sua deteco atravs da analise da presena do seu DNA no hospedeiro

Anlises de DNA para o diagnstico clnico


Deteco de diferenas entre genomas de indivduos devido a variaes na sequncia de bases (polimorfismos) resultantes de mutaes pontuais (SNPs*), delees, inseres ou da presena de um nmero variado de sequncias repetidas em srie.

Impresses Digitais de DNA por RFLP* e Southern Blot Mais demorado e requer muita amostra Impresses Digitais de DNA atravs de mtodos baseados em PCR Rpido, sensvel, requer pouca quantidade de amostra
SNP = Poliformismo de um nico nucleotdeo RFLP= Restriction Fragment Length Polymorphisms

Doenas genticas que podem ser diagnsticadas por anlise de DNA (PCR/RFLP ou RFLP/Southern)*
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) Leucemia Mielide Crnica Anemia falciforme Doena de Hunntington (doena neurodegenerativa) Doena cardaca coronariana (formao precoce de placas aterosclerticas) Fibrose Cstica Deteco de mutaes em oncogenes e supressores tumorais

*Diagnstico pr-natal ou para aconselhamento gentico

Deteco de infeces por bactrias, fungos e vrus atravs de PCR e Southern*


Neisseria gonorrhoehae Clamdia Tuberculose Vrus de Epstein Bar Citomegalovrus HIV * Em substituio a testes sorolgicos e microbiolgicos convencionais

Deteco de infeces por bactrias, fungos e vrus atravs de PCR e Southern*

Deteco da mutao no gene da -globina: anemia falciforme RFLP/ Southern Blot Gene normal com stio para MstII

Gene mutante sem stio para MstII poliformismo no stio da enzima restrio
(RFLP= restriction fragment lenght polymorphism)

Testes de identidade via DNA - Verificao de identidade de indivduos atravs da analise da variabilidade gentica

- Indivduos possuem baixo nvel de variabilidade em suas seqncias codificantes para protenas (preservao de funo)

- Existem regies repetitivas no genoma de funo desconhecida na qual existe um maior nvel de variabilidade

Impresses digitais de DNA para comprovao de parentesco (realizado em 1985 por Alec Jeffreys) Andrew filho de Christiana e irmo de David, Joyce e Diana. X= DNA de pessoa no relacionada * No havia amostra do DNA do pai O Southern do DNA digerido com enzimas de restrio hibridizado com sondas multilocus

Impresses digitais de DNA de sete suspeitos e da amostra de sangue recolhida na cena do crime.

Quem o provvel culpado?

O Southern do DNA digerido com enzimas de restrio hibridizado com sondas multilocus

Mtodos de anlise de DNA baseados em PCR


Extrao de DNA Amplificao por PCR: 1. par de primer especfico para um gene 2. Multiplex primers para amplificao de STRs (Short Tandem Repeats)

Separao e Deteco dos produtos de PCR: Amostras: sangue, dente, ossos, cabelo, semen, urina, osso, tecidos, lquido amnitico Eletroforese em gel de agarose corado com EtBr ou prata Southern blot e sondas radiativas Eletroforese em gel de poliacrilamida Primers fluorescentes na reao de PCR

Identificao de ndividuos com PCR multiplex (alelos STR)

AATG ou TCAT

Alelo 1

Alelo 2

Alelo 1

Alelo 2

Identificao de ndividuos com PCR multiplex (alelos STR): at 10 pares de primers com fluorforos distintos em uma nica reao

Posio Cromossomal de 13 marcadores STR