Rastreamento e testes

genéticos
 Testes genéticos
avanços significativos têm ocorrido em muitas áreas da genética
diagnóstica (tecnologias de sequenciamento, mapeamento e terapia de
genes causadores de doenças e técnicas citogenéticas);

Esses avanços abriram caminho para testes mais precisos e eficientes de

doenças genéticas;

Testes genéticos podem ser definidos como a análise de cromossomos,

DNA, RNA, proteínas ou outros para detectar alterações que podem
causar uma doença genética.
 Tipos de testes genéticos

Técnicas disponíveis diferem no custo, disponibilidade e em sua

habilidade para esclarecer condições genéticas;

Conhecer a fonte genética de uma condição é apenas a primeira etapa do

processo e o surgimento de novas técnicas sempre tem melhorado o
diagnóstico...
2020 Crispr/Cas9 – edição de DNA
2020 Hi-Chromatin
2021 Todas as técnicas em Epigenética
 Banda G
A análise do cariótipo permite identificar alterações em larga
escala em número e estrutura cromossômica;

Utilizando imagens de alta

resolução de cromossomos
descondensados podem detectar
em torno de 800 a mil bandas ;

Cada banda contém em média 25 genes;

FISH – Fluoresce in situ Hybridization
 Possibilidades da FISH
Qualquer locus clonado pode ser mapeado em sua posição
específica;

Nesse processo, uma sonda marcada é adicionada em uma lamina

pré-preparada para receber o mix de DNA colorido;

Fragmentos de DNA clonados com cerca de 100kb estão

disponíveis para uso como sondas de FISH em vários centros de
recursos genéticos no mundo todo na forma de BACs.
FISH – Fluoresce in situ Hybridization
A amniocentese consiste
na aspiração
transabdominal de uma
pequena quantidade de
fluido amniótico da bolsa
amniótica, que envolve o
feto.

É aconselhada aos pais

perante a probabilidade de
alterações genéticas
durante a gravidez.
 Avanços em testes genéticos
Citogenética
Utilizando a FIHS, a confirmação genética de uma condição apenas clinicamente
suspeita pela banda G foi possível;

Antes, o diagnóstico para síndrome de Williams era apenas com critérios clínicos
(déficits cognitivos, malformações cardíacas, e outros;
 Avanços em testes genéticos
Citogenética

Um dos genes deletado na síndrome de Williams é o gene da elastina

(forma tecido conectivo com propriedades elásticas);

A deleção normalmente envolve apenas uma cópia – haploinsuficiência

dos genes e de seus produtos.

Ao longo das últimas décadas, a técnica de FISH foi sendo aprimorada e
atualmente temos muitas variantes desta (Oligo-FISH, FISH-multisky)
 Avanços em testes genéticos
Citogenética
Após FISH, um único exame atesta 100% de certeza o diagnóstico!
Painéis de sondas que fazem a
cobertura de todos os cromossomos

Útil para detectar segmentos

desconhecidos de cromossomos
anormais, como os cromossomos
marcadores (evolução de seq.
normalmente não presentes no
cariótipo);

Útil no estudo da progressão do CA.

Outra vantagem da FISH é análise de núcleos interfásicos e uso de
sondas teloméricas;

O resultado pode ficar pronto em até 24h, ou menos.

Útil no diagnóstico pré-natal;

 Bandeamento
Multicor

Detecta inversões, deleções,

duplicações e outros no cariótipo
Humano - citogenética clínica
 Hibridização Genômica Comparativa
(CGH)
• É uma técnica para medir alterações no número de cópias de
DNA;

• Utilizado no rastreamento de células tumorais para

deleções/duplicações e aneuploidias em geral;

• Fornece informações de mapas genômicos e detecta qualquer

alteração maior que 50kb;
 Princípio da Técnica (CGH)
DNA do paciente com câncer é marcado em vermelho (1:1);
DNA normal marcado em verde (1:1);
Lâmina com genoma normal;
O conjunto de sondas é hibridizado em metáfases normais;
Resultado interpretado pela diferença de cor (Ex: uma amplificação irá gerar uma
banda vermelha forte).
 HGC-microarray
A array-CGH utiliza o genoma fragmentado em microarranjos possibilitando a detecção de
alterações que afetam total ou parcialmente um único gene, ou vários genes.

Esse exame é recomendado em casos de:

 Deficiência intelectual e atraso de desenvolvimento neuropsicomotor;

Síndromes genéticas não reconhecíveis clinicamente;
Cariótipo normal (não visto pela HGC simples) ou inconclusivo;
Cariótipo com cromossomo marcador ou translocações;
Análise de material de abortos;
Genitália ambígua;
Transtorno do espectro autista (TEA) e Epilepsia;
Malformações congênitas, entre outras indicações;
Câncer por amplificação de sequencias.
HGC-array
 Avanços em testes genéticos
Microarranjo cromossômico
Após o aumento do número de sondas
(mais de 205 mil seq/oligo no genoma)
surgiram novas “síndromes sem nome”
que agora são conhecidas apenas como
sua descrição genética;

A “síndrome da deleção 1q21.1” são

microdeleções que ocorrem
frequentemente em pacientes com
problemas neural/comportamental;
Perfil completo de uma célula de câncer
de pulmão
Análise de uma alteração cromossômica com
diferentes técnicas incluindo CGH-array

Exame pré-natal
sugere deleção de
região do braço
curto do
cromossomo 5
 Análises de polimorfismos de
nucleotídeo único (SNP)
São detectados diferenças de um único nucleotídeo que se
enquadram na definição de polimorfismo;

Um dos líderes na descoberta dos “snips” foi o The SNP Consortium
(TSC) – um grupo de companhia farmacêuticas - e o Wellcome
Trust do Reino Unido.

Estima-se que haja mais de 10 milhões de SNPs na população.

Ocorrem 1 a cada 1.300 bases de nucleotídeos.

 Análises de polimorfismos de
nucleotídeo único (SNP)
A importancia do SNP é o seu papel como marcador de locus de
DNA;

Alguns SNPs são a base de uma mutação clínica, mas outros são
neutros e podem
ser usados para avaliar
traços poligênicos (mais de 1%)
(genética forense ou de
Paternidade também);
São úteis também nas decisões individuais com a identificação de
medicamentos que podem ser genótipos específicos
(farmacogenética personalizada);

- metabolismo dos antidepressivos com CYP2D6, ou nos genes codificantes da proteína

transportadora de serotonina (5-HTT), podendo fornecer importantes subsídios para a
personalização da escolha de medicações;

- ISRS - medicamentos inibidores seletivos de recaptação de serotonina.

 Estratégias de sequenciamento
de DNA
O método de Sanger é um procedimento tradicional de sequenciamento
desenvolvido pelo bioquímico britânico Frederick Sanger na década de 70 ;

O sequenciamento usa uma reação de replicação de DNA modificadas na qual

uma proporção de dideóxi é adicionado à mistura a ser sequenciada;

O método Sanger de sequenciamento é caro e ineficiente para projetos de larga

escala, como o sequenciamento de um genoma inteiro, sendo substituído por
novas técnicas de sequenciamento de larga escala rápidas e menos caras (Seq.
Next Generation).
 Estratégias de sequenciamento
de DNA
Um nucleotídeo normal, possui uma OH na cadeia 3’, mas um didéoxi,
não possui oxigênio nas cadeias 2 e 3, sendo, portanto, um nucleotídeo
modificado.

Esse nucleotídeo modificado não

consegue ser inserido na cadeia de
replicação pela polimerase,
momento em que a
replicação com esse didéoxi
específico finaliza.
 Estratégias de sequenciamento
de DNA
Logo, a próxima base que seria incorporada naquela sequência era
exatamente o didéoxi inserido na amostra.

Quatro reações de sequenciamento

complementares são montadas,
cada uma delas com um ddNTP
para as 4 bases.
 Estratégias de sequenciamento
de DNA com fluorescência
• A leitura é dada em Real Time;

• Cada nucleotídeo recebe uma

molécula fluorescente/o gráfico é
mostrado no computador;

• Muito eficiente, mas caro!

...logo foi substituído pelo

SEQUENCIAMENTO DE ALTA
PERFOMANCE (rápido e barato)
Sequenciamento de nova geração
O primeiro seq Next-generation completo foi em E.coli em 2005
(alta precisão e custo reduzido);

Realizou sequenciamentos múltiplos para ler milhões de fitas de

DNA;

Foi baseado no pirossequenciamento (Illumina);

Fragmentos de DNA fita simples com 300 a 800pb são ligados a

esferas em emulsão de água e óleo antes da PCR;
•O segredo está na capacidade de isolar, amplificar e sequenciar milhões de sequências em
paralelo;
•Um fragmento por esfera/poço/emulsão de água e óleo que é amplificado milhares de vezes
por PCR antes do sequenciamento;
 Sequenciamento de Nova Geração – NGS

1. Pirosequenciamento com detecção de pirofosfato (454 – Roche/Illumina);

2. Sequenciamento por ligação (SOLiD);
3. Metodologia de semicondutores (Ion);
4. Sequenciamento por síntese (Illumina);
5. Sequenciamento de moléculas únicas (Pacific Biosciences e o Oxford
Nanopore).

As metodologias NGS possuem o grande diferencial de proporcionarem

o sequenciamento direto e paralelo de milhões/bilhões de moléculas de
DNA, aumentando consideravelmente a escala e a resolução das
análises.
 Sequenciamento de exoma
completo
Se concentra na porção codificadora do genoma e sequencia
apenas éxons (com bases em seq. fixas pré-definidas);

Válido para maioria dos genes, PORÉM o defeito clínico nem

sempre está no éxon, mas no Splicessoma do conjunto éxon/íntron;

Ou em um gene que não codifica proteína, mas apenas RNAi que
deve interferir no RNAm, fragmentando-o;
 Sequenciamento de exoma
completo
A síndrome de Kabuki não foi identificada por testes genéticos padrão
(citogenética e microarray) em alguns pacientes;

Por muito tempo o diagnóstico foi dado apenas pela clínica/sem

confirmação;

Em 2010, um grupo usando sequenciamento de exoma local + associação

epigenética num grupo de pessoas com a síndrome identificaram o gene
MLL2 na região 12q12 a 12q14 em ¾ dos pacientes.
 Sequenciamento de exoma
completo
Os outros ¼ dos pacientes apresentaram mutações noutro gene, o
KDM6A no cromossomo Xp11.3 identificado com todas as técnicas;

Em todos os casos era uma mutação heterozigota de caráter autossômico

dominante que ocorre em um ou dois genes, ou mais;

Esses dos dois genes codificam enzimas modificadoras de histonas e

DNA, indicando erros inatos do aparato epigenético.

Outros genes estão envolvidos..(KMT2D ou no KMT2A) – todos levando a

atraso global.
Sequenciamento de exoma
completo
 Sequenciamento de RNA ou
transcriptoma
Foca especificamente nos RNAs que são expressos em um tecido em um
determinado tempo;

Valioso para o estudo do CA ou na regulação epignética;

Aberto um campo novo, A TRANSCRIPTÔMICA, que explora resultados da

regulação gênica em vez de conteúdo do genoma;
 Crispr/Cas9 para edição
de genoma.
• Prêmio Nobel de Química/2020 pelo
desenvolvimento do método de edição do
DNA Crispr/Cas9 com a descoberta da
molécula tracrRNA;

• Aplicação futura ampla no tratamento das

doenças monogênicas raras e complexas..
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL DE
DOENÇAS GENÉTICAS
E DEFEITOS CONGÊNITOS
 Amniocentese
É realizada entre a 15a e a 17a semana após o último período menstrual (LMP, de
last menstrual period) da gestante;

Uso de ultrassom para localizar a placenta e determinar a posição do feto - uma

agulha é inserida através da parede abdominal até o saco amniótico;

essas células podem ser utilizadas para testes bioquímicos ou também para
diagnóstico genético molecular de qualquer doença genética;
Amniocentese
 Análise do DNA Fetal na
Circulação Materna
É a capacidade de isolar o DNA fetal do DNA do sangue materno durante a
gravidez (sangue periférico);

chamada de triagem pré-natal não invasiva (NIPT)/amplamente usada nos

últimos anos;

Durante a gestação, um pequeno número de células fetais cruza a barreira

placentária para entrar na circulação materna já na sexta a oitava semanas.

Tais células podem ser analisadas com a utilização de algumas de técnicas, como
FISH ou PCR.
 Análise do DNA Fetal na
Circulação Materna
A técnica usa fragmentos do DNA livre de células (cfDNA, de cell-free DNA)
liberados na circulação materna a partir de trofoblastos que sofreram morte
celular programada;

O cfDNA fetal é diferenciado do cfDNA materno pela identificação de haplótipos

de SNP que ocorrem com frequência elevada na circulação materna.
 Análise do DNA Fetal na
Circulação Materna
O cfDNA é usado para identificar o sexo do feto (presença ou ausência do SRY e
outros genes DYS14 e DAZ)

 e seu tipo de Rh (especialmente importante se a mãe for Rh negativa e o feto

puder ser Rh positivo);

O cfDNA pode ser avaliado para mutações ou aneuploidias com o uso de

sequenciamento de alto Rendimento (pela superepresentação de genoma).
 Diagnóstico Genético Pré-
implantacional
O tipo mais comum de PGD (preimplantation genetic diagnosis) é realizado em
um blastômero obtido no processo de fertilização in vitro.

O processo é iniciado três dias após a fertilização, quando o embrião contém

entre seis e oito células.

Um ou dois blastômeros podem ser removidos do embrião com segurança.

A análise por FISH pode ser utilizada para diagnosticar aneuploidias.

 Diagnóstico Genético Pré-
implantacional
O DNA da célula pode ser amplificado usando-se uma PCR para diagnóstico de
doenças monogênicas pelo sequenciamento.

Se o embrião for morfologicamente normal e não for detectada a mutação

causadora da doença, nem uma aneuploidia, o mesmo é implantado no útero
materno.

Protocolos de teste foram desenvolvidos para dezenas de doenças genéticas (p.

ex., fibrose cística, doença de Tay-Sachs, β-talassemia, distrofia miotônica, doença
de Huntington e distrofia muscular de Duchenne).
Diagnóstico do corpúsculo polar

Envolve a análise do primeiro ou do segundo corpúsculo polar produzido com

o ovócito.

 O DNA do corpúsculo é testado para determinar se ele contém uma mutação

causadora de doença.

Se não tiver, supõe-se que o ovócito também não.

 Esse ovócito é então fertilizado e implantado usando as técnicas tradicionais

de fertilização in vitro.
 Diagnóstico do corpúsculo polar

CUIDADOS!!!

Como apenas o corpúsculo polar é examinado (e este é produzido apenas pelas

mães), mutações paternas não podem ser avaliadas;

O diagnóstico do corpúsculo polar é, portanto, mais útil quando somente a mãe

está em risco de transmitir uma mutação causadora de doença, ou quando se
testa uma aneuploidia (porque a maioria das aneuploidias tem origem materna);
 Rastreamento genético
É uma busca na população, por pessoas saudáveis que possuem
um genótipo que:

1. Está associado com uma predisposição a uma doença;

2. Pode levar a uma doença em seus descendentes;
3. Produz outras variantes cuja associação com doenças é
desconhecida;
4. Pode ser conduzido em vários momentos/etapas...
 Triagem
Os programas de triagem geralmente utilizam testes que são amplamente
aplicáveis e baratos para identificar uma população em risco (p. ex., programa
de triagem de fenilcetonúria [PKU];

Membros dessa população são então encaminhados para testes subsequentes

que são mais precisos, mas também mais caros e demorados (testes genéticos);

Neste contexto, o teste de triagem deve ser capaz de separar efetivamente

pessoas que têm a doença daquelas que não têm.
 Triagem para Erros Inatos do
Metabolismo em Recém-nascidos
A triagem de recém-nascidos é uma estratégia eficaz de saúde pública para
doenças tratáveis como PKU, hipotireoidismo, galactosemia e anemia falciforme.

- justifica pelo fato de que até 15% das crianças não tratadas com anemia
falciforme morrem de infecções antes dos cinco anos de idade;

- Justifica porque a restrição dietética de fenilalanina, quando iniciada antes de

quatro semanas de idade, é altamente eficaz para alterar o curso da doença.
 Triagem para Erros Inatos do
Metabolismo em Recém-nascidos
Muitos países estabeleceram os programas de triagem expandida de recém-
nascido para fornecer um rápido tratamento das condições detectadas;

O American College of Medical Genetics and Genomics desenvolveu diretrizes e

planos de ação para todas as condições
que atualmente são triadas (https://www.acmg.net);

está desenvolvendo também novos planos

para distúrbios cuja triagem está sendo
considerada (p. ex., doença de Pompe);
 Triagem de Heterozigotos
Consiste em testar uma população-alvo para identificar portadores (Aa) não
afetados de um gene causador de doença.

Assim, os portadores podem receber informações sobre riscos e opções

reprodutivas;

Um bem-sucedido é o programa de triagem de Tay-Sachs na América do Norte

(doença autossômica recessiva de armazenamento de lisossomos em que a
enzima lisossômica β-hexosaminidase A (HEX A) é deficiente);
 Triagem de Heterozigotos
A β-talassemia, outra doença autossômica recessiva grave, é especialmente
comum entre muitas populações mediterrâneas e sul-asiáticas;

Programas eficazes de triagem de portadores resultaram em uma redução de

75% na prevalência de recém-nascidos com essa doença na Grécia, Chipre e Itália;

A triagem de portadores também é possível para fibrose cística, outra doença

autossômica recessiva.
 Triagem de Heterozigotos
Como a doença é invariavelmente fatal, opções como interrupção da gestação
ou inseminação artificial por doadores não portadores são aceitáveis para muitos
casais.

Num trabalho de triagem bem planejado, o número de nascimentos com doença

de Tay-Sachs entre judeus asquenazes nos Estados Unidos e Canadá diminuiu 90%;

de 30 a 40 por ano antes de 1970, para três a cinco por ano na década de 1990,
e para zero em 2003.
 Diretrizes
Além dos critérios para estabelecer um programa de triagem populacional para
doenças genéticas, foram desenvolvidas diretrizes relacionadas aos aspectos éticos
e legais;
 Diagnóstico Pré-sintomático
O teste é realizado para identificar pessoas que herdaram um gene causador de
doença antes que elas desenvolvam sintomas;

Exemplos: doença de Huntington, doença renal policística do adulto e câncer de

mama/ovário autossômico dominante;

O diagnóstico pré-sintomático pode ajudar na tomada de decisões reprodutivas

e profiláticas (retirada das mamas, ovários, tireoidectomia).

Ela é geralmente recomendada apenas para pessoas sabidamente em risco para

a doença, geralmente devido a uma história familial positiva.
Implicações Psicossociais da Triagem
e do Diagnóstico Genético
A carga de ansiedade, o custo e a potencial estigmatização em torno de um teste
com resultado positivo devem ser bem considerados diante da necessidade de
detecção;

Com frequência, testes de triagem são erroneamente entendidos como

diagnosticamente conclusivos (precisa confirmar com o teste genético);
Implicações Psicossociais da Triagem
e do Diagnóstico Genético

 Triagem iniciais para portador de anemia falciforme nos anos 1970 causaram
constrangimentos em virtude de mal entendidos acerca das implicações da
condição de portador;

 Ocasionalmente, a detecção de portador levava ao cancelamento de seguros de

saúde ou à discriminação do empregado.
 Questões práticas dos testes
genéticos
Muitas das questões envolvem custos, considerações éticas e detalhes de como
o teste será realizado;

Além do mais, não há tratamento efetivo para a maioria das doenças detectadas,
e aí?

O teste deve ser realizado? Vale a pena saber da possibilidade de uma doença
futura e sem cura? Logo, o paciente precisa estar de total acordo com o exame.
Se for a/o ....
Cap 11