SENAI – Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial

Técnico em Biotecnologia – 3º Período

ANNA LUIZA DA ROCHA TORRÃO

TÉCNICAS DA BIOLOGIA MOLECULAR PARA ANÁLISE DO DNA – PESQUISA

CURITIBA, 12 DE MARÇO DE 2023

 Método de Sanguer

Desenvolvida pelo bioquímico britânico Fred Sanguer e seus colaboradores em

1977, no projeto Genoma Humano, foi utilizado para determinar sequências de muitos
fragmentos relativamente pequenos do DNA humano, embora os genomas sejam
agora tipicamente sequenciados usando outros métodos mais rápidos e baratos, o
método Sanger ainda é amplamente usado para o sequenciamento de fragmentos
individuais de DNA, como fragmentos gerados pela Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR). Ele consiste na produção de fragmentos de DNA com tamanhos
que diferem em um (1) nucleotídeo, utilizando como molde uma fita simples de DNA. A
utilização de um primer complementar ao DNA alvo determina qual sequência será
produzida.
Atualmente, equipamentos automatizados de sequenciamento utilizam capilares
extremamente finos nos quais, por meio da migração por eletroforese capilar, os
fragmentos são alinhados com base no seu tamanho, do menor ao maior, e são
detectados por um feixe de laser. A marcação de cada um dos quatro ddNTPs (A, T, C
ou G) com uma molécula fluorescente diferente permite identificar qual foi o
nucleotídeo adicionado em cada posição terminal dos fragmentos, construindo-se
assim a sequência da molécula de DNA alvo (Fig. 1.8). Essa técnica permite o
sequenciamento de moléculas entre 100 e 1000 pb aproximadamente. A combinação
do sequenciamento utilizando equipamentos automatizados com diferentes
abordagens de clonagem e mapeamento genético tem permitido a obtenção da
informação do genoma inteiro de diferentes organismos, resultando em grandes
avanços nos estudos genéticos.
 Clonagem de DNA

A ideia de clonagem surgiu em 1938 quando Hans Spermann, embriologista

alemão (Nobel de Medicina, 1935) propôs um experimento que consistia em transferir
o núcleo de uma célula em estágio tardio de desenvolvimento para um óvulo.
Clonagem de DNA é o processo de fazer várias cópias idênticas de um pedaço
específico de DNA. Num procedimento típico de clonagem, o gene ou outro fragmento
de interesse (talvez um gene para uma proteína humana de interesse médico) é
primeiramente inserido numa peça circular de DNA chamada plasmídeo. A inserção é
feita utilizando-se enzimas que “cortam e colam” DNA, e produz uma molécula de
recombinante, ou seja, DNA montado a partir de fragmentos de várias fontes. Em
seguida o plasmídeo recombinante é introduzido em bactérias. As bactérias contendo
plasmídeo são selecionadas e cultivadas. Conforme elas se reproduzem, replicam o
plasmídeo e o transmitem para seus descendentes, produzindo cópias do que ele
contém.
Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma sequência de DNA num
plasmídeo? Em alguns casos, precisamos de muitas cópias para realizar experimentos
ou construir novos plasmídeos. Em outros, o pedaço codifica uma proteína útil, e as
bactérias são usadas como "fábricas" para produção dessa proteína. Por exemplo, o
gene da insulina humana é expresso em bactérias E. coli para produzir a insulina
usada pelos diabéticos.
Outros usos para a clonagem do DNA:
• Biofarmacêuticos. A clonagem do DNA pode ser usada para produzir
proteínas humanas com aplicações biomédicas, como a insulina mencionada
acima. Outros exemplos de proteínas recombinantes incluem o hormônio do
crescimento humano, que é ministrado a pacientes incapazes de sintetizá-lo, e
o ativador de plasminogênio tecidual (tPA/ APt), que é usado para tratar
derrames e prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como
estas. frequentemente são produzidas em bactérias.

• Terapia genética. Em algumas desordens genéticas, os pacientes não

possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética tenta
fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. Por
exemplo, a clonagem do DNA foi usada para construir plasmídeos com uma
versão normal do gene que é não funcional na fibrose cística. Quando os
plasmídeos foram liberados nos pulmões dos pacientes com fibrose cística, a
função pulmonar deteriorou menos rapidamente.

• Análise genética. Em laboratórios de pesquisa básica , os biólogos

geralmente usam a clonagem de DNA para construir versões artificiais,
recombinantes dos genes que os ajudam a compreender como é a função
normal dos genes num organismo.
BIBLIOGRAFRIA
Fontes: https://statics-submarino.b2w.io/sherlock/books/firstChapter/131481668.pdf
https://pt.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-
regulation/biotechnology/a/dna-sequencing

Fontes: https://www.comciencia.br/dossies-1-
72/reportagens/clonagem/clone02.htm#:~:text=A%20id%C3%A9ia%20de%20clonage
m%20surgiu,de%20desenvolvimento%20para%20um%20%C3%B3vulo.
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-
tutorial/a/overview-dna-cloning