Engenharia Genética - Teórica

O que é “Engenharia Genética”?

Diferentes definições podem ser encontradas:
ú Manipulação artificial, modificação e
recombinação de DNA ou outras moléculas
de ácido nucleico para modificar um
organismo ou população de organismos;
ú Alteração do material genético por
intervenção direta na genética processos
com a finalidade de produzir novas
substâncias ou melhorar funções dos
organismos existentes;
ú Conjunto de técnicas aplicadas de genética
e biotecnologia usadas para cortar e juntar
material genético e especialmente DNA de uma ou mais espécies de organismos e introduzir o
resultado em um organismo a fim de alterar uma ou mais de suas características;
ú A engenharia genética, também chamada de tecnologia do DNA recombinante, envolve o
conjunto de técnicas usadas para cortar e juntar material genético, especialmente DNA de
diferentes espécies biológicas, e introduzir o DNA híbrido resultante em um organismo para
formar novas combinações de material genético hereditário;
ú Modificação genética onde um gene sintético ou DNA estranho é inserido em um organismo de
interesse.

Conceitos
O que é clonagem?
Definição de CLONE (vem da palavra grega “klon”, que significa galho):
ú Um grupo de células idênticas derivadas de um ancestral comum;
ú Reprodução de organismos geneticamente idênticos, natural ou artificialmente, por reprodução
assexuada.

DNA recombinante
Moléculas de DNA formadas pela ligação de DNA de diferentes fontes (organismos).

Transgênico
Organismo ou célula na qual um ou mais genes de outra fonte (organismo) foram incorporado.

Organismo geneticamente modificado

Organismo cujo genoma foi modificado para permitir a expressão/produção de características ou
produtos desejados.

Visão histórica
1940 A. Jost cunha o termo engenharia genética.
1966: Código Genético decifrado.
1967: DNA ligase.
1968/1970: Enzimas “cortadoras” de DNA.
1973: Juntando fragmentos de DNA e um plasmídeo (tecnologia de DNA recombinante estabelecida).
1976: Primeira Empresa de Engenharia Genética (Genentech).
1977: Métodos de sequenciamento de DNA estabelecidos.

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1978: Genentech produz insulina humana em E. coli.
1980: O primeiro camundongo geneticamente modificado foi desenvolvido.
1982: Primeira vacina animal produzida por metodologias de DNA recombinante é aprovada para
uso na Europa.
1983: Mullis desenvolveu a PCR. Plasmídeos de Ti modificados são usados para transformar plantas.
1988: O primeiro milho transgênico foi desenvolvido.
1990: A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA aprovou o primeiro produto alimentar
geneticamente modificado. Quimosina recombinante é usada para fazer queijo nos Estados Unidos.
1991: A terapia genética foi experimentada e testada pela primeira vez em humanos.
1995: Primeiro genoma bacteriano completo foi sequenciado.
1996: Nasce Dolly, o primeiro (já tinham sido clonados rãs e outros microrganismos, mas foi o
primeiro a ser clonado a partir de uma célula já diferenciada, uma somática) animal clonado. Plantio
comercial de culturas OGM.
1998: FDA aprova o primeiro medicamento antisense.
2001: Lançado o primeiro rascunho da sequência do genoma humano.
2009: Primeiro ensaio clínico com células-tronco embrionárias. FDA aprova primeiro medicamento
produzido em animal geneticamente modificado.
2010: Pesquisadores criam a primeira célula sintética.
2012: Doudna e Charpentier demonstram clivagem direcionada de DNA por CRISPR-Cas.
2015: Primeiro animal transgênico para consumo humano.
2016: Tecnologia de edição de genoma CRISPR em um ensaio clínico.
2017: FDA aprova terapia genética in vivo para tratamento de uma forma hereditária de retina
distrofia.
2018: Nascimento de bebês editados pelo genoma na China.
2019: Ensaios clínicos começam a testar a segurança e eficácia da edição do genoma CRISPR-Cas para
tratar duas doenças do sangue.
2021: Primeiro alimento editado pelo CRISPR a entrar no mercado. Liberação experimental de
mosquitos geneticamente modificados nos Estados Unidos.

Milestones

Riscos da tecnologia de DNA recombinante

Conferência Asilomar (1975)
Grupo de biólogos que se juntou com alguns advogados e doutores para criar diretrizes para o uso
seguro de DNA geneticamente modificado.

Objetivo: abordar os riscos biológicos apresentados pela tecnologia de DNA recombinante

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Recomendações:
ú O projeto experimental deve considerar a contenção;
ú A contenção deve corresponder ao risco estimado;
ú Barreiras biológicas devem ser criadas para limitar a
disseminação de DNA recombinante.

Consequências:
ú Impacto público sobre os benefícios;
ú Setor de biotecnologia

Impactos:
ú Pesquisa: estrutura e função do gene;
ú Medicina: vacinas, anticorpos monoclonais, modelos
animais, doadores de animais, terapia gênica;
ú Indústria: proteínas e enzimas;
ú Agricultura: alimentos geneticamente modificados
resistentes a pragas, doenças e herbicidas.

Em direção a biologia sintética

Montagem do genoma infeccioso completo do bacteriófago phiX174 (5386 pb) a partir de um único
conjunto de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente.

“Laboratório de Mycoplasma” - JCVI-syn1.0

1ª célula bacteriana sintética

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Sequenciação de DNA
É importante determinar a sequência de DNA para fazer alterações, melhorias, descobrir doenças,
entre outros - ferramenta fundamental.
“... faz uso dos análogos de 2',3'-didesoxi e
arabinonucleosídeos dos trifosfatos de
desoxinucleosídeos
normais, que atuam como
inibidores específicos de
terminação de cadeia da
DNA polimerase.”

The Principle of Dideoxy (Sanger) Sequencing

Método de Sanger – sequenciação por polimerização.
Utilização de nucleótidos modificados que têm diferenças,
alteração em que em vez de OH temos H. Isto interrompe a
síntese e não avança.

Reação de síntese com DNA molde, template e eram

adicionados dNTPs. Mistura de diferentes cadeias e
tamanhos diferindo num nucleótido. Quando adiciona o
dideoxy a polimerização pára ali.

Passou de um sistema manual para um sequenciador

automático, fazendo a leitura das diferentes cadeias.

Evolução na sequenciação de DNA

Melhorias na taxa de sequenciamento de DNA nos últimos 30 anos e no futuro

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Sanger vs Next-gen
Fluxo de trabalho de sequenciamento convencional versus sequenciamento de segunda geração
Em ambos os casos um dos primeiros passos é a fragmentação de DNA

a. Teríamos de passar por um processo de clonagem in vivo.

Selecionar clones, vetores, replicar etc.

b. Não precisamos de vetores nem de hospedeiros e etc,

pegamos nos fragmento e ligamos os adaptadores que permitem
fazem a aplicação in vitro com PCR sem precisarmos de
hospedeiro. Diferentes plataformas em que podemos sequenciar
em simultâneo múltiplos fragmentos.

(a – Sanger; b – Next-gen)

Next-gen
Amplificação clonal de recursos de sequenciamento na
sequenciação de segunda geração

a) PCR em emulsão – ligam-se os adaptadores

aos fragmentos, permitem ligar os fragmentos
a pequenas esferas e imobilizar misturando
com outros formando uma emulsão e dentro
ocorre a reação de PCR e cada nova cópia
gerada vai ligar à esfera.
b) PCR bridge - matriz sólida que tem um
conjunto de regiões complementares a primers
e fragmentos imobilizados nessa placa. Forma
uma ponte.

Estratégias de imobilização de modelo – outros exemplos

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Estratégias para sequenciamento de matriz cíclica Fase cíclica – fazer as leituras de cada nucleótido

Pirosequenciamento
Sequenciamento de DNA em tempo real usando a deteção de liberação de pirofosfato.

Sistema 454 pirosequenciamento

Sequenciação de um pedação de DNA numa superfície
solida – ELIDA
Adição sequencial de nucleótidos, utilização de
diferentes atividades enzimáticas

Polimerase que adiciona os nucleótidos, é libertado

pirofosfato que é convertido em ATP que vai ser
utilizado pela luciferase e gerar luz.
Incorporação de um nucleótido emite um sinal
luminoso.

1) Reação de polimerização de ácido nucleico (polimerase)

2) PPi inorgânico é liberado
3) PPi é subsequentemente convertido em ATP por ATP sulfurilase
4) Luciferase oxida luciferina e gera luz

Tecnologia 454

A sequenciação é feita nestas placas, nos seus poços.

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 Permite sequenciar uma quantidade enorme de
DNA.

Sinais luminosos num cromatograma, processo

cíclico que permitem fazer umas leituras enormes.

Tecnologia Ion Torrent

Diferença: como é feita a incorporação, no
sistema 454 é a emissão de um sinal
luminoso e neste é libertado protão H+,
detetado pelo sensor.

No final a deteção da incorporação dos

nucleótidos não é um sinal luminoso, as
esferas num poço com uma película que
na base tem um sensor, é libertado um
protão por adição de nucleótido, deteta
uma pequena variação de pH.

Tecnologia Iluminna
Um dos mais utilizados. Não tem as esferas onde se imobilizam os fragmentos, mas tem um sistema
onde se ligam a uma matriz sólida. Cada um dos nucleótidos tem um marcador fluorescente então o
processo de incorporação que é cíclico.

O nucleótido é incorporado, detetado o marcador e desbloqueado no 3’ e cliva o sinal fluorescente.

Os adaptadores ligam a uma matriz sólida, no final

ficam com os fragmentos em cadeia simples. O
processo é de incorporação cíclico. Detetado o sinal
fluorescente da adição do nucleótido. Desbloqueia
o sistema 3’ e só depois incorporado o nucleótido
seguinte.

São leituras relativamente pequenas, mas no total

fazemos muito mais leituras.

+ Barato que o PacBio

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Tecnologia PacBio
SMRT - Sequenciamento em tempo real de molécula única desenvolvido pela Pacific BioSciences
(PacBio).

Ao contrário do SGS, o sequenciamento PacBio é um método para sequenciamento em tempo real

e não requer uma pausa entre as etapas de leitura. Essas características distinguem o
sequenciamento do PacBio do SGS, por isso é classificado como o sequenciamento de terceira
geração (TGS).

Oferece comprimentos de leitura muito mais longos e execuções mais rápidas do que os métodos
SGS, mas é prejudicado por um menor rendimento, maior taxa de erro e maior custo por base. Não
requerem pausa para ler, incorporar, etc., este é feito continuamente. Permite ler fragmentos muito
maiores. No entanto, o rendimento total em termos no número de pares de bases que detetamos é
menor, tem uma taxa de erro maior (erros da polimerase) e ainda um custo superior por base. Não
há pausa no espaço de leitura, feito continuamente que permite ter leituras de fragmentos muito
maiores. No entanto o rendimento total é menor, menos leituras, uma taxa de erro maior. Custo
superior por base.

Uma vantagem importante do sequenciamento do PacBio é o comprimento da leitura, ou seja, o

tamanho das sequências que lemos. Enquanto o sistema PacBio RS original com a primeira geração
de química (química C1) gerou comprimentos médios de leitura em torno de 1500 bp, o sistema
PacBio RS II com a química C4 atual possui comprimentos médios de leitura acima de 10 kb, com um
N50 de mais de 20 kb (ou seja, mais da metade de todos os dados estão em leituras com mais de 20
kb) e comprimentos máximos de leitura acima de 60 kb. Em contraste, o comprimento máximo de
leitura do Illumina HiSeq 2500 é apenas 250 bp de extremidade emparelhada (usando o modo de
execução rápida).

Template SMRTbell
É um DNA circular fechado de fita simples que é criado ligando adaptadores em grampo a ambas as
extremidades de uma molécula de DNA de fita dupla alvo.
A polimerase (cinza) é ancorada na parte inferior de um ZMW e incorpora bases na fita de leitura.

Milhares de pequenos poços onde estão imobilizados uma DNA polimerase e para que o processo
ocorra é necessário gerar um template.
Liga-se à DNA polimerase e inicia o processo com a ligação do adaptador ao template circular.

Célula SMRT única

Cada célula SMRT contém 150.000 ZMWs (pequenos poços onde estão
imobilizados DNA polimerase). Aproximadamente 35.000–75.000 desses
poços produzem uma leitura em uma execução que dura 0,5 – 4h,
resultando em 0,5 – 1 Gb de sequência.
É diferente dos outros métodos pois o que está imobilizado na matriz é a
DNA polimerase e para que este método ocorra é necessário um Template
SMRTbell.

Sequenciamento por meio de pulsos de luz

Pulsos detetados pelo aparelho com o que está a acontecer no poço.
Utilizar ilumina e PacBio, combinação das duas dá uma sequências mais rigorosa.

A. Um SMRTbell (cinza) se difunde em um ZMW, e o adaptador se liga a uma polimerase imobilizado

na parte inferior.

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B. Cada um dos quatro nucleotídeos é marcado com um corante fluorescente diferente para que
tenham espectros de emissão distintos. Como um nucleotídeo é mantido no volume de deteção pela
polimerase, um pulso de luz é produzido que identifica a base.

Tecnologia nanopore
Identifica as bases do DNA medindo as mudanças na
condutividade elétrica geradas conforme as fitas do
DNA passam por um poro biológico de proteínas. À
medida que a cadeia passa no poro vai sendo medida a
condutividade elétrica.

Dispositivo de sequenciamento Nanopore MinION

Medindo apenas 10 × 3 × 2 cm e pesando apenas 90 g, o MinION é o menor dispositivo de
sequenciamento disponível atualmente. Ele pode ser conectado diretamente a uma porta USB3
padrão em um computador com baixo requisito de hardware e configuração simples.

Capacidade de sequenciar moléculas únicas,

comprimentos de leitura longos, análise em
tempo real e custo-benefício

A taxa de transferência por execução da célula de

fluxo não é muito estável (as reações não têm
todas o mesmo rendimento) e as taxas de erro
são maiores do que as leituras do PacBio. A real
vantagem é ser um equipamento portátil.

Recorre ao uso de poros biológicos, proteínas que já o foram,

são imobilizados numa membrana e ao passar a cadeia de DNA
vai gerando uma alteração na competitividade elétrica e vai
sendo lida a alteração de competitividade.

Sequenciador portátil.

Não se consegue um rendimento alto e elevadas taxas de erro.

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Resumo das tecnologias de sequenciação de DNA
Diferentes tecnologias de sequenciação de DNA. Primeiro passo é quebrar. Os fragmentos vão ser
sujeito a processos de reparação dos terminais. Ligam-se os adaptadores, geram-se mais cópias e
entra-se no processo de sequenciação cíclica.

Comparação dos métodos

Sequenciação de Sanger
ú Sequenciamento de genes únicos;
ú Sequenciamento de 1-100 alvos de amplicon com o menor custo;
ú Sequenciamento de até 96 amostras por vez, sem código de barras;
ú Identificação Microbiana;
ú Análise de fragmentos, genotipagem de alto rendimento;
ú Análise de microssatélites ou STR;
ú Confirmação NGS.

NGS
ú Interrogando > 100 genes por vez de maneira econômica;
ú Encontrar novas variantes, expandindo o número de alvos sequenciados em um corrida única;
ú Amostras de sequenciamento que têm baixas quantidades de entrada de material de partida;
ú Sequenciamento de genomas microbianos.

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Manipulação da expressão génica
Com a análise da sequência conseguimos fazer uma previsão da
estrutura, função e atividade da proteínas. Precisamos de
expressar e purificar com diferentes métodos e ferramentas.

Para expressar precisamos de clonar, vetor de expressão é um

vetor de clonagem com mais características específicas. Vetor de
clonagem não tem de se expressar corretamente porque não é
para analisar no fim e em grande quantidade.

Produção de proteínas recombinantes

Vantagens das tecnologias recombinantes
ú Enzimas superproduzidas por fermentações microbianas;
ú Produção de enzimas de organismos difíceis de cultivar ou
manipular geneticamente;
ú Produção de enzimas de espécies patogénicas ou produtoras de
toxinas.

Muitos hospedeiros disponíveis

Necessitamos de hospedeiros para atingir os níveis de expressão.

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Hospedeiro preferencial – E.coli fácil de cultivar e sem grandes requisitos nutricionais.
Linhas celulares de mamíferos e outros.

Escolher o vetor e o hospedeiro - fatores em ter em consideração

Sistema de expressão

Comparação de vários sistemas de expressão de proteína

recombinante comercial
Varia com o tipo de sistema de expressão.
Afeta a seleção que fazemos do sistema a utilizar.
Animais pior em rapidez por exemplo e bactérias melhor.

Não existe uma estratégia única para obter a expressão máxima de cada
gene clonado – muitos parâmetros biológicos devem ser manipulados
para obter níveis ótimos de expressão gênica.

Vetor de expressão (procariotas) - características gerais

Comum aos vetores de clonagem básicos: marcador de seleção
(importante para selecionar as células transformadas e depois garantir
que o vetor vai ser mantido dentro da célula), origem de replicação (para
que o plasmídeo se replique), sítio de clonagem múltipla.

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Promotor: inicia a transcrição e conduz a expressão da
proteína recombinante; posicionado 10-100
nucleotídeos a montante do RBS (local de ligação ao
ribossoma).

Geralmente, deve:
ú Ser forte para permitir o acúmulo de produto;
ú Ter um nível de expressão basal muito baixo (fortemente regulado);
ú Ser fácil de induzir.

Promotores comumente usados para expressão de genes clonados em hospedeiros procarióticos

Por que é desejável usar um promotor forte, mas regulável, para controlar a transcrição?
ú Carga metabólica;
ú Instabilidade do plasmídeo.

Terminador de transcrição: reduz a transcrição indesejada; aumenta a estabilidade do plasmídeo e

do mRNA.

Sequência Shine-Dalgarno: necessária para o início da tradução; determina a eficiência da iniciação

da tradução; posicionados 4-14 nucleotídeos a montante do codão de início com o espaçamento
ideal sendo 8 nucleotídeos.

Gene regulador (repressor): evita a expressão de baixo nível

na ausência de indutor (expressa constitutivamente).

Local de clivagem da protease: para remover um marcador

ou parceiro de fusão da proteína de fusão.

Proteínas que funcionam como marcadores – local de

clivagem para protease para a jusante se consiga clivar a
proteína de fusão que não nos interessa.

Vetor de expressão (eucariotas)

As principais características de um vetor de expressão eucariótico são:
ú Uma unidade de transcrição eucariótica com um promotor (p);
ú Um local de clonagem múltipla (MCS) no qual inserir um gene alvo;
ú Um segmento de DNA com terminação de transcrição e sinais de
poliadenilação (t);
ú Um gene marcador selecionável eucariótico (ESM);
ú Uma origem de replicação que funciona na célula hospedeira eucariótica
(orieuk);
ú Uma origem de replicação que funciona em E. coli (oriE);
ú Um gene marcador selecionável de E. coli (por exemplo, Ampr).
Plasmídeo de levedura 2μm
Baculovírus
Cromossoma artificial de levedura (YAC)

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Tags e proteínas de fusão:
Melhorando a expressão: a fusão de uma proteína heteróloga com um parceiro de fusão altamente
expresso pode resultar em um alto nível de expressão da proteína de fusão.

Melhorar a solubilidade: a fusão de uma proteína heteróloga com um parceiro de fusão solúvel pode
melhorar a solubilidade.

Deteção: fusão de uma proteína a um pequeno peptídeo ou proteína que é reconhecida por um
anticorpo, ligação proteína ou outros métodos (por exemplo, GFP) permitindo a deteção durante a
expressão e purificação.

Melhorar a purificação: proteínas fundidas a marcadores ou proteínas que se ligam especificamente

a resinas de afinidade.

Que tipo de proteína deve ser expressa?

Origem procariótica?
Provavelmente um sistema de E. coli é a melhor escolha.

Origem eucariótica?
Devemos considerar outros fatores.

A proteína é solúvel quando expressa em E. coli?

Se tem origem bacteriana ou procariota provavelmente e coli a melhor escolha.
Se for de origem eucariótica em alguns casos bactérias podem ser usadas

Expressão de proteínas em corpos de inclusão

Quando as proteínas recombinantes se acumulam intracelularmente em agregados insolúveis-

Vantagens
ú Os corpos de inclusão podem representar mais de 50% da proteína celular total;
ú Os corpos de inclusão contêm quase exclusivamente a proteína superexpressa;
ú A proteína é protegida da degradação proteolítica;
ú A célula está protegida contra a toxicidade da proteína recombinante;
ú Quando as proteínas recombinantes se acumulam intracelularmente em agregados insolúveis.

Desvantagens
Para recuperar proteínas ativas e solúveis de corpos de inclusão em alto rendimento, é necessário
realizar protocolos complexos, demorados, caros e às vezes ineficazes para:
ú Isolar os corpos de inclusão (por exemplo, centrifugação);
ú Solubilizar as proteínas agregadas (por exemplo, agentes desnaturantes e temperatura);
ú Refold das proteínas;

Para recuperar é mais difícil por serem complexos, demorados e por vezes pouco eficazes os
métodos.

Expressão de proteínas em corpos de inclusão

A expressão da proteína alvo como uma proteína de fusão com um
parceiro altamente solúvel, como glutationa-S-transferase (GST),
proteína de ligação à maltose (MBP) ou DsbA pode melhorar sua
solubilidade.
Podemos utilizar proteínas de fusão para facilitar combinado com outras
proteínas altamente solúveis.

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Melhorar a solubilidade da proteína
ú Reduzir a síntese de proteínas (por exemplo, temperatura mais baixa, promotor mais fraco,
indutor);
ú Mudar o meio de cultura (por exemplo, controlar o pH, adicionar co- fatores, osmoprotetores
etc.);
ú Co-expressar dobrases e acompanhantes;
ú Induzir a secreção para o periplasma (por exemplo, pela adição de uma sequência líder).

Ou mudar para um sistema de expressão eucariótico!!

Modificações pós-tradução - um problema para E. coli

Uso de codão - limitação à expressão de proteínas

Preferência de codões.
Código genético é universal, igual e redundante (mesmo aminoácido a ser codificado por múltiplos
codões).

Se o uso de codão da proteína alvo difere significativamente do uso de codões do hospedeiro:

ú Diminuição da estabilidade do mRNA (ao desacelerar a tradução);
ú Término prematuro da transcrição e / ou tradução, o que leva a uma variedade de produtos
proteicos truncados;
ú Frameshifts, exclusões e misincorporations;
ú Inibição da síntese de proteínas e crescimento celular.

Alguns organismos preferem um tipo de codões e outros preferem outros para codificar o mesmo
aminoácido:
ú Relevante na síntese de proteínas;
ú Atrasa o processo por a cadeia estar cheia de codões não preferenciais, diminuindo a
estabilidade do mRNA, síntese prematura, proteínas truncadas não funcionais, etc.

Em cada célula, a população de tRNA reflete de perto o viés de codões da população de mRNA.

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 Os codões que especificam os aminoácidos são usados em
diferentes graus em vários organismos.
As células produzem tRNAs correspondentes a um codão específico
em aproximadamente a mesma quantidade relativa que aquele
codão específico é usado na produção de proteínas.
Quando um gene clonado tem codões que raramente são usados
pela célula hospedeira, isso diminui
a eficiência da tradução.

Os 8 codões menos frequentemente usados em casa organismo.

Se a proteína contém codões raros de E. coli, ela pode ser expressa em uma cepa que coexpressa
os tRNAs para esses codões raros:

Representação esquemática da expressão de proteínas estranhas

em uma célula hospedeira típica de E. coli (A) e em uma célula
hospedeira de E. coli que foi projetada para superexpressar vários
tRNAs raros (B).

Mutagénese dirigida ao local para substituir codão raro por codão comumente usado.
Os níveis expressos também podem ser melhorados por:
ú Examinando o segundo codão: a eficiência da expressão varia dependendo deste codão;
ú Minimizando o conteúdo de GC na extremidade 5 ': Um alto conteúdo de GC na extremidade 5'
do gene de interesse geralmente leva à formação de uma estrutura secundária no mRNA;
ú Adicionando um terminador de transcrição;
ú Adiçionando um parceiro de fusão;
ú Usando cepas hospedeiras deficientes em protéase.

Muito mRNA dificulta

Terminador no sítio certo e codão de stop

O que é uma proteína recombinante?

Uma proteína cuja sequência de aminoácidos é codificada por um gene clonado.
A proteína recombinante é uma forma manipulada de proteína nativa, que é gerada em várias
maneiras, a fim de aumentar a produção de proteínas, modificar sequências de genes e fabricar
produtos comerciais úteis.

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Porque é que precisamos de proteínas recombinantes?
ú Pesquisa biomédica para entender saúde e doença;
ú Proteínas recombinantes para bioterapia;
ú Biotecnologia;
ú Etc.

Por exemplo: fatores de crescimento ou hormônios purificados, proteases, DNA polimerases,

transcriptases reversas, ligases, fosfatases ou anticorpos que reconhecem um epítopo particular de
interesse, etc.

Purificação de proteínas recombinantes

A tarefa é separar o componente desejado - um único tipo de moléculas - de uma mistura complexa,
mas isso nem sempre é possível ou necessário.

Níveis típicos de pureza de proteína necessários para diferentes aplicações de pesquisa:

Aplicações típicas Níveis recomendados de pureza
Espetofotometria de massa Moderado a elevado, 80% a 90%
Antigénio para imunização
Estudos funcionais Muito elevado, 95% a 99%
(p.e.: ensaio de ligação usando ressonância
plasmônica de superfície)
Estudos estruturais
(p.e.: cristalografia de raios-X)
Proteínas terapêuticas Mais elevado, > 99%

Purificação de proteínas
Proteínas celulares
ú Grande número de proteínas (>> que o número de genes);
ú A maioria dos tipos de células em organismos multicelulares expressam dezenas de milhares de
proteínas diferentes;
ú Abundâncias relativas de várias proteínas variam amplamente – grande faixa dinâmica (faixa
dinâmica é a razão entre o maior e o menor valor que uma certa quantidade pode assumir).

Usando E. coli, uma fermentação de 2 litros usando meios complexos gera aproximadamente 50 a
80 g (peso húmido das células).
ú Entre 100 e 300 mg de proteína recombinante está disponível nas células (assumindo uma
expressão proteica modesta de 2% a 5% da proteína celular total);
ú As proteínas solúveis podem ser recuperadas com bons rendimentos (>50%);
ú Proteínas insolúveis têm rendimentos mais modestos (5% a 20%).

Portanto, o uso de proteínas de fermentação em pequena escala (ou subdomínios das mesmas)
geralmente pode ser produzido em quantidades suficientes (10 a 100 mg) para iniciar a maioria dos
estudos.

Objetivos da purificação de proteínas

ú Obter uma determinada proteína livre de outras e de outros componentes celulares;
ú Obter um bom rendimento (quantidade absoluta e proporção da quantidade inicial).

Geralmente é importante manter a atividade do componente durante todo o processo

ú Rendimento é importante;
Alcançar um é muitas vezes à custa do outro.
ú Atividade/conformação também o é;
ú Manter a atividade/função da proteína; .
ú Evitar a proteólise e desnaturação irreversível.

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Purificação de proteínas – Workflow
1. Desenvolver um ensaio quantitativo
ú Medição quantitativa da atividade;
ú Imunoensaio quantitativo;
ú Geralmente deseja aumentar a atividade específica (U/mg prot) em
cada etapa.

2. Ou um ensaio qualitativo
ú Ensaios de placa;
ú Ensaio de eletroforese em gel (imunotransferência ou ensaio de
atividade de gel zimografia);
ú Imunoensaios.

Immunoblot
proteases lacases

3. Definir a escala
ú Preparativa – visam obter uma quantidade relativamente grande de proteínas purificadas
para uso posterior (exemplos: a preparação de produtos comerciais, como enzimas);
ú Analítica – visam obter uma quantidade relativamente pequena de uma proteína para uma
variedade de pesquisas ou propósitos analíticos (identificação e caracterização).

4. Extração
ú Dependendo da fonte, a proteína deve ser colocada em solução quebrando o tecido ou as
células que a contêm.
• Congelamento e descongelamento repetidos
• Sonicação
• Homogeneização por alta pressão
• Permeabilização da membrana celular (por exemplo, por solventes orgânicos)

5. Evitar degradação/desnaturação/perda de atividade

ú Por proteases:
Uso de um host de expressão deficiente em protéase, trabalho rápido e a baixas temperaturas.
ú Por valores extremos de pH;
ú Estar ciente da concentração de proteínas.

6. Definir técnicas
As etapas de separação podem explorar diferenças em:
ú Tamanho ou peso molecular – centrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho;
ú Propriedades físico-químicas – pontos isoelétricos, cromatografia de troca iônica;
ú Polaridade/hidrofobicidade - cromatografia de fase reversa, cromatografia de interação
hidrofóbica;

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 ú Ligação/atividade biológica – cromatografia de afinidade.

Centrifugação

Cromatografia
Cada procedimento de purificação subdivide a mistura de proteínas em várias frações, uma ou mais
das quais conterá a proteína de interesse, enquanto outras frações conterão proteínas que não são
necessárias e, portanto, serão descartadas.

Principais tipos de cromatografia

Exclusão de tamanho (ou filtração em gel)

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Troca iônica

Afinidade

Cromatografia de afinidade
Separa as proteínas através de uma interação reversível entre a proteína alvo e um ligante específico
ligado a uma matriz cromatográfica.
ú Interação bioespecífica
Através de um anticorpo
ú Interação não específica
Através de um ião metálico imobilizado ou substância corante

Oferece alta seletividade e resolução juntamente com uma capacidade intermediária-alta.

ú A amostra é primeiro ligada ao ligante usando condições favoráveis para isso vinculativo;
ú Em seguida, o material não ligado é lavado da coluna e a eluição de proteína pura é obtida
usando um ligante competitivo ou alterando o pH, força iônica ou polaridade;
ú Esta estratégia de purificação pode lucrar com o uso de DNA recombinante tecnologia como o
marcador de afinidade pode ser fundido com a proteína de interesse durante a clonagem.

Purificação de proteínas
ú Primeiro passo no esquema de purificação – menor poder de resolução

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 Por exemplo: precipitação com sulfato de amônio, centrifugação ou, para algumas proteínas,
desnaturação por calor – esses procedimentos têm a vantagem de reduzir bastante a quantidade
total de proteína na amostra.

ú Últimos passos em um esquema de purificação – procedimentos de resolução muito alta, mas

de baixa capacidade
Por exemplo: cromatografia de afinidade – frequentemente aplicado apenas tardiamente em
um esquema de purificação quando a quantidade total de proteína é relativamente pequena e
as proteínas contaminantes estão presentes em concentrações bastante baixas.

Normalmente é mais eficiente escolher uma série de métodos que exploram diferentes propriedades
físicas ou funcionais das proteínas em vez de uma série de etapas explorando a mesma propriedade.

Esquemas de purificação típicos:

ú Pelo menos um procedimento de fracionamento por tamanho (filtragem em gel) e pelo menos
uma etapa de fracionamento de carga (cromatografia de troca iônica);
ú Por fim, cromatografia em coluna.

Estratégias para produção de proteínas solúveis em E. coli.

A. Vetores de expressão: seleção

cuidadosa para incorporar características
que afetam a produção de proteínas,
como solubilidade e/ou marcadores de
fusão de afinidade, e direcionar a síntese
proteica para o citoplasma ou periplasma
de E. coli. Outras características incluem:
o replicão, marcadores de resistência a
antibióticos e promotores de transcrição.

B. Otimização das condições de expressão

para a produção de proteína solúvel em E.
coli depende de tentativa e erro: para
obter TP solúvel (Proteína Alvo), pode ser
necessário selecionar e testar várias cepas
de E. coli e condições de cultivo e, às
vezes, a o vetor de expressão inicial
também deve ser redesenhado.

C. A estratégia já deve ser definida ao

selecionar o vetor de expressão: se um
marcador de afinidade for incorporado,
então uma primeira etapa de
cromatografia de afinidade deve ser
realizada. Por outro lado, se um marcador
de afinidade for proibido, outras estratégias, a saber, troca iônica, exclusão de tamanho ou
cromatografia de interação hidrofóbica devem ser testadas. Após a primeira etapa de purificação, o
TP pode ou não ser suficientemente puro. Quando não é puro, é necessário realizar mais etapas de
purificação com outras estratégias cromatográficas.

D, E. A qualidade da proteína é essencial para muitos estudos de aplicação estrutural e funcional:

uma proteína solúvel purificada pode ser agregada, sem uma estrutura secundária definida, e
também pode apresentar baixa estabilidade térmica. Portanto, muitas vezes é necessária uma
caracterização biofísica antes de prosseguir para a aplicação final da proteína.

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Tags de fusão
ú Expressão melhorada;
ú Melhor solubilidade;
ú Os compartimentos celulares podem ser direcionados;
ú Deteção melhorada (ex: fluorescência ou imunoensaio);
ú Purificação melhorada (ex: usando troca iônica ou
cromatografia de afinidade)
ú Péptidos pequenos:
GFP, marca de poli-histidina, BANDEIRA-tag, Myc-tag.
ú Péptidos grandes:
Proteína de ligação a maltose (MBP), domínio de
ligação à quitina, domínio de ligação à celulose.

Mutagénese
As mutações são alterações hereditárias no material genético e
podem ocorrer espontaneamente ou podem ser induzidas. Eles
fornecem variabilidade genética e são uma das forças motrizes
da evolução.

Aplicações
ú Estudo da estrutura e função do gene/proteína;
ú Investigação de vias celulares;
ú Seleção ou rastreio de mutações (DNA, RNA ou nível de proteína) com uma propriedade
desejada;
ú Introdução ou remoção de locais de restrição por endonuclease e tags;
ú Evolução dirigida;
ú Engenharia de proteínas;
ú Terapia de genes;
ú ...

Mutagênese generalizada (ou aleatória)

Criação de mutações em locais indefinidos e não requer
conhecimento de sequência ou função.

Mutagênese direcionada ao local (ou específica do local)

Produção de uma alteração predeterminada específica em uma
sequência de DNA.
Forward Genetics Reverse Genetics
Mutação generalizada/aleatória
ú Permite criar um grande número de mutações em um gene ao
mesmo tempo;
ú “Imita” a evolução natural;
ú Pode criar diversidade e novas propriedades.

Exemplos:
ú Mutagénese química;
ú Irradiação UV;
ú Error-prone PCR (mutagénese enzimática);
ú PCR com primers degenerados;
ú Cepas mutantes;
ú Análogos de nucleotídeos;
ú Recombinação de DNA.
O experimento Beadle – Tatum:

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Identificação e caracterização de mutantes nutricionais de Neurospora.

Enzimas de alto desempenho para PCR

A evolução dirigida é um método de engenharia de proteínas

que simula a seleção natural no laboratório. O processo
começa com um gene que codifica uma enzima de interesse
“tipo selvagem”, ou não modificada.
A variação aleatória é introduzida no gene através de um
processo de mutagénese, gerando uma biblioteca de milhões
de genes, cada um codificando uma variante de enzima única.
Uma pressão de seleção funcional é então aplicada à
biblioteca, e apenas os genes que codificam as enzimas de
maior desempenho “sobrevivem”. Este processo de mutação
e seleção aleatória é repetido até que a função enzimática
desejada evolua.

Transposões – genes saltitantes

Composto por dois elementos:
1. Enzima transposase (Tn5), catalisa a reação de
transposição;
2. Sequência de DNA transponível (Transposão) contendo
sequências de reconhecimento de transposase.

Mutagénese de transposões
A reação de transposição pode ser realizada in vitro ou in vivo.
O transposão é inserido no DNA alvo de maneira altamente
aleatória e imparcial.

Os transposões conferem a função desejada ao DNA alvo.

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Uma enzima transposase catalisa a inserção aleatória de um transposão “artificial” em qualquer
outro DNA.

Transposão EZ-Tn5™ - um transposão EZ-Tn5 pode ser qualquer sequência de DNA que esteja entre
as sequências Mosaic End (ME) de repetição invertida de 19 pb adequadamente orientadas que são
reconhecidas específica e exclusivamente pela Transposase EZ-Tn5™. O Sistema EZ-Tn5 é baseado
no sistema de transposição hiperativo Tn5 in vitro descrito por IY Goryshin & WS Reznikoff1. Este
sistema mantém as características de inserção do Tn5 -
o sistema de transposão mais aleatório conhecido - mas
tem uma frequência de transposição 1000 vezes maior
do que o Tn5 Epicenter de tipo selvagem também
possui um sistema de transposição HyperMu™ in Vitro
que é 50-100 vezes mais ativo do que outros Sistemas
MuA Transposase.

Complexo EZ-Tn5™ Transposoma™

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Ideal para gerar bibliotecas de nocautes de genes aleatórios.
Otimizado para que em média apenas um Transposão EZ-Tn5 seja inserido no DNA de uma célula.
Aplicações:
ú Caracterização do genoma;
ú Identificação de novos genes
ú Identificação de genes essenciais.

PCR e mutagénese

Error-prone PCR
Método usado para criar bibliotecas de mutações dentro de
genes únicos.
ú Concentração de pico de dCTP e dTTP (em comparação
com dGTP e dATP);
ú Aumentar a concentração de Mg2+ (MgCl2);
ú Introduzir concentração de Mn2+ (MnCl2);
ú Polimerase Taq de baixa fidelidade (sem atividade de revisão).

A área que sofre mutagénese é determinada pela

posição dos primers.

Biblioteca de mutagénese aleatória

Ensaio funcional de mutantes e sequenciamento

Mutagénese sítio-dirigida (site-directed)

Mutagénese cassete
ú 1 vetor de plasmídeo;
ú 2 oligonucleotídeos sintéticos contendo a mutação;
ú O cassete de DNA mutado é substituído no plasmídeo;
ú O plasmídeo é usado para transformar células bacterianas

Quase 100% de eficiência

Introdução de uma ou mais mutações
Limitado pela disponibilidade de locais de restrição adequados

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 Mutagénese oligonucleotídica
ú 1 vetor ssDNA;
ú Hibridizado com um oligonucleotídeo contendo a mutação;
ú Síntese de fita complementar;
ú O plasmídeo é usado para transformar células bacterianas.

Bacteriofago M13
Genoma
DNA circular de fita simples de 4,5 a 8
kb que codifica de 4 a 10 proteínas. A
replicação ocorre via dsDNA
intermediário e círculo rolante.

Vetores M13
ú Baseado na RF de fita dupla;
ú Sítio de clonagem múltipla para gerar DNA recombinante de
fita dupla circular;
ú Pode ser transfectado em cepas adequadas de E. coli;
ú Partículas de fago são colhidas e despojados de seus
revestimentos de proteína para liberar DNA recombinante de
fita simples.

Vetor fágico M13 mp18

Obtendo ssDNA M13

Mutagénese Kunkel
Tensão
ú dut-: desoxiuridina trifosfatase não funcional (dUTPase),
que degrada dUTP. A mutação permitirá que o dUTP se acumule e
seja incorporado ao DNA.
ú ung-: uracil-N-glicosilase não funcional (corta U’s
encontrados no DNA, promovendo reparo por excisão de base do
sítio). Em seguida, o U mutante permanece no DNA.

dUTP é incorporado em M13 ssDNA em uma cepa de E. coli

defeituosa nas duas enzimas uracil-N-glicosilase (ung) e dUTPase
(dut).

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O oligo mutagénico é emparelhado com DNA molde contendo uracila (U), e a síntese de DNA in vitro
é realizada para gerar DNA de fita dupla.
A sequência do oligo é perfeitamente complementar à sequência do gene na região a ser mutada,
mas com uma única diferença: no local de mutação pretendido, ele possui uma base que é
complementar ao nucleotídeo mutante desejado e não ao original.
DNA polimerase
DNA ligase
dNTPs

Após a transformação de E. coli ung+, dut+, a cadeia molde é degradada e o fagemídeo de cadeia
dupla sobrevivente é isolado e sequenciado ou os clones são rastreados.

Mutagénese sítio-dirigida (site-directed) – usando PCR

Não requer modificações ou cepas únicas e incorpora mutações no
DNA por PCR com primers padrão.

Utiliza primers (A e D) complementares às extremidades da

sequência alvo e primers internos com extremidades
complementares (B e C).
Os primers internos contêm a mutação desejada e hibridizam com a
região a ser alterada. Durante a primeira rodada de PCR, os
fragmentos AB e CD são criados.
Esses produtos são misturados para a segunda PCR usando os
primers A e D. As extremidades complementares dos produtos
hibridizam nesta segunda PCR para criar o produto final, AD, que
contém a sequência interna mutada.

Extensão de sobreposição
Os primers internos, B e C, são posicionados em ambos os lados
da região a ser deletada para evitar que ela seja incorporada nos
fragmentos AB e CD da primeira rodada de PCR.
As sequências complementares nas extremidades desses
fragmentos, criadas pelos primers B e C, permitem a hibridização
de AB com CD durante a segunda rodada de PCR, e o produto
final com a deleção desejada (AD) é criado.

PCR inversa
Uma polimerase de alta-fidelidade que cria produtos de extremidades cegas é usada para produzir
um fragmento linearizado com a mutação, que é então recircularizado por ligação intramolecular.
(A) Deleção: São usados primers que hibridizam para ambos os lados da área a ser deletada.

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(B) Substituição: Um dos primers contém a mutação desejada (azul).
(C) Inserção: Primers hibridizam para ambos os lados. Um primer contém a sequência adicional.

Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit

Incorporação rápida e eficiente de inserções, deleções e substituições em DNA de plasmídeo de fita
dupla. A primeira etapa é uma amplificação exponencial usando primers padrão e uma mistura
principal de polimerase de DNA de alta-fidelidade de inicialização a quente. A segunda etapa envolve
a incubação com uma mistura única de enzimas contendo uma quinase, uma ligase e DpnI. Juntas,
essas enzimas permitem a rápida circularização do produto de PCR e a remoção do DNA molde. A
última etapa é uma transformação de alta eficiência em células quimicamente competentes.

ú A polimerase de alta-fidelidade é crucial para minimizar as chances de introdução de mutações

indesejadas;
ú Uma enzima “hot start” é desejável, pois a capacidade de leitura de prova da maioria dessas
enzimas pode degradar os primers durante a configuração;
ú Após PCR, a digestão de DpnI é crucial. Esta enzima cliva apenas em locais metilados, de modo
que digere o plasmídeo molde, mas não o produto da PCR. Isso significa que o plasmídeo molde
não pode vir de uma cepa deficiente em metilação.

Substituição de genes direcionados/nocaute de genes

ú Técnica para inativar seletivamente um gene, substituindo-o por um alelo mutante em um
organismo normal;
ú Essa técnica de interromper a função dos genes é uma ferramenta poderosa para desvendar os
mecanismos pelos quais ocorrem os processos celulares básicos;
ú O gene é alterado in vitro;
ú É introduzido no hospedeiro;
ú Seleção.

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Vetor de suicídio: um vetor que não é capaz de se replicar – ele será eliminado da célula, mas parte
pode ser integrada ao cromossomo por recombinação.

O evento molecular básico na substituição de genes direcionados

Em bactérias
Usando DNA circular vs. Usando DNA linear

Processo utilizado para

inativar cada um dos
genes em E.coli.

Explora genes de recombinação homóloga de bacteriófagos.

Projeto de primer e construção de mutantes de deleção de gene único

Deixa uma marca

que mostra que o
processo foi feito.

Em leveduras São diploides, isto é, o processo

1) Plasmídeo recombinante: pode ser mais complicado.
Por recombinação homóloga
ú Gene URA3 (marcador selecionável) - gene mutante (amarelo) podemos substituir – temos de
2) Transformar células de levedura diplóides que requerem uracila (Ura3−). fornecer uracilo, conseguimos
selecionar as células recombinantes

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As células com plasmídeo crescem na ausência de uracila.
A recombinação intracromossómica produz células que perderam URA3 e
retêm o gene HIS3 de tipo selvagem ou o mutante his3.
As células portadoras do gene mutante his3 são detetadas por
plaqueamento na presença e ausência de histidina.

Células recombinantes podem sintetizar actina?

Como determinar se a actina é essencial para a célula?

3) Induzir meiose e esporulação (inanição celular) - esporos haploides.

A experiência demonstra que o gene da actina é essencial para a

viabilidade da levedura. Sabemos que é vital visto que a célula tem duas cópias – induzir o processo
de meiose, produzir esporos haploides (dois com gene alterado),
cultivando individualmente conseguimos perceber se é viável e necessário.
O sistema delitto perfetto
Sistema de mutagénese in vivo específico do local que foi
desenvolvido para gerar mudanças à vontade no genoma da
levedura. Usa oligonucleotídeos sintéticos e fornece uma ampla
variedade de modificações do genoma por meio de recombinação
homóloga.

Plasmídeos CORE usados na técnica delitto perfetto

A cassete CORE contém um marcador COntraselecionável
(permite a seleção de células de levedura que perdem o
cassete CORE pela integração do oligonucleotídeo mutado)
e um gene REpórter (permite a seleção de células de
levedura que recebem o cassete CORE) – recursos
adicionais opcionais.

As duas etapas do delitto perfetto: conseguimos fazer uma alteração sem deixar nenhuma evidência/marca
1 - Inserção do cassete CORE no locus a ser alterado;
2 - Remoção completa do cassete com oligonucleotídeos e/ou outro material genético e
transferência da(s) modificação(ões) genética(s) esperada(s) para o locus de DNA escolhido.

Em ratos
Poderoso sistema experimental para estudar:
ú Desenvolvimento;
ú Comportamento;
ú Fisiologia;
ú Doenças genéticas.

Ratos transgénicos
Três métodos principais desenvolvidos para produzir ratos transgênicos.

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 Transformação de uma Microinjeção de um Células estaminais
célula embrionária ovo fertilizado embrionárias

As células-tronco embrionárias (Embryonic stem – ES) são

linhagens celulares pluripotentes com capacidade de auto-
renovação e ampla plasticidade de diferenciação.
As células ES de ratos são capazes de se reintegrar totalmente em
embriões viáveis quando injetadas em um blastocisto hospedeiro
ou agregadas a uma mórula hospedeira.
Depois que esses embriões de pré-implantação são implantados
em uma mãe de aluguel, eles se desenvolvem em descendentes
de mosaico conhecidos como quimeras.

(a) DNA exógeno é introduzido nas células ES e a inserção aleatória ocorre com muito mais
frequência do que a inserção direcionada ao gene.
neor (rosa) - gene de resistência à neomicina; inserido no cromossomo em recombinação homóloga
e não homóloga.
tkHSV (roxo) - gene da timidina quinase do vírus herpes simplex que modifica o ganciclovir em um
composto tóxico, inserido no cromossomo apenas em recombinação não homóloga.
(b) As células recombinantes são selecionadas por tratamento com neomicina e as células
sobreviventes são tratadas com ganciclovir.
Como distinguir a recombinação homóloga e a não homóloga - usar marcadores.

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 As células ES são manipuladas em cultura e contribuem para todos os
tecidos do embrião, incluindo a linha germinativa.
A transmissão do transgene pode ser confirmada verificando se os
descendentes de embriões quiméricos carregam marcadores de cor de
revestimento de células ES.

Procedimento para gerar camundongos transgênicos usando células ES

transformadas
1. Alelos mutantes são introduzidos
por recombinação homóloga em
células-tronco embrionárias (ES);
2. Células ES contendo uma mutação
nocaute em um alelo do gene em
estudo são introduzidas em embriões
precoces de ratos – os ratos
resultantes serão quimeras contendo
tecidos derivados tanto das células ES transplantadas quanto das
células hospedeiras, podendo essas células contribuir tanto para as
populações de células germinativas quanto de células somáticas;
3. Ratos quiméricos são cruzados para avaliar se a mutação é
incorporada na linhagem germinativa;
4. Os ratos heterozigotos para a mutação nocaute são acasalados
para produzir ratos nocaute homozigotos. Recolha do blastocisto e produção de
células estaminais embrionárias.
Células que foram misturadas de dois
O sistema Cre-lox indivíduos resultando numa quimera.
Controlar a expressão de um determinado gene de um determinado tecido.
ú É um sistema poderoso e específico para controlar a expressão génica;
ú Foi aplicado com sucesso em leveduras, plantas, culturas de células de mamíferos e ratos;
ú Com base na capacidade do gene de recombinação de ciclização do bacteriófago P1 (Cre)
recombinase (cre) para efetuar a recombinação entre pares de sítios loxP – permite a
recombinação de locais específicos, o material é reorganizado, podemos ativar ou inativar um
gene de interesse;
ú Cre recombinase reconhece sítios loxP de 34 pb, e a orientação e localização dos sítios loxP
determinam como o material genético será rearranjado;
ú Tal recombinação em um camundongo "Cre-lox" pode ativar ou inativar um gene de interesse;
ú Geralmente, as cepas Cre e loxP são desenvolvidas separadamente e depois cruzadas.

Inversão: se os sítios loxP flanqueiam o

segmento de DNA em um arranjo cis e estão
orientados em direções opostas.

Deleção: se os sítios loxP flanquearem um

segmento de DNA em um arranjo cis e
estiverem orientados na mesma direção.

Translocação: se os sítios loxP estão

localizados em fitas diferentes de DNA e
estão orientados na mesma direção.

Knockout de gene específico do tipo de célula

1. Locais loxP são inseridos em cada lado do gene de
interesse (ou seja, gene X) (azul) (a função do gene não é interrompida);

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2. O rato loxP é cruzado com um rato portador de um promotor específico do tipo de célula que
controla a expressão da Cre recombinase, que induz a recombinação entre os locais loxP (só está
ativo naquele tipo de células e tecidos);
3. No rato Cre-loxP resultante, a proteína Cre é produzida apenas nas células em qual o promotor
está ativo (deleção do exão 2) – inativar em determinadas células em vez de em todo o organismo.

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