Cultura de Célula e Tecidos

Aplicações in vitro
Básico
o Atividade intracelular – transcrição de DNA, síntese de proteínas, metabolismo de energia,
metabolismo de drogas, ciclo celular, diferenciação e apoptose;
o Fluxo intracelular – processamento de RNA, recetores de hormonas, fluxo de metabolitos,
mobilização de cálcio, sinais de transdução e tráfico de membrana;
o Genómicos – análise genética, transfeção, infeção, transformação, imortalização e senescência;
o Proteómicos – produtos genéticos, fenótipos celulares e vias metabólicas;
o Interação célula-célula – morfogénese, controlo parácrino, proliferação celular, cinética,
cooperação metabólica, adesão e motilidade celular, interação de matriz e invasão.

Aplicado
o Produto celular – biotecnologia, design de bioreatores, colheita da produto e processamento a
jusante;
o Imunologia – epítopos celulares superficiais, hibridomas, citocinas e sinalização e inflamação;
o Farmacologia – ação de drogas, interação ligando-recetor, metabolismo de drogas e resistência
de drogas;
o Engenharia tecidual – construção de tecido, matrizes e andaimes, fonte de células-tronco,
propagação e diferenciação;
o Toxicologia – infeção, citotoxicidade, mutagénese, carcinogénese, irritação e inflamação.

Cultura de células animas

o Uso como sistema modelo evita o uso de animais para estudos preliminares;
o Testes de efeitos de drogas no crescimento celular (teste de toxicidade);
o Teste de efeitos terapêuticos de drogas em linhagens de células cancerosas;
o Utilizado para engenharia de tecidos;
o Produção de vacinas e de anticorpos monoclonais;
o Estudo da replicação e do ciclo de vida dos vírus;
o Cultura de embriões;
o Produção de proteínas terapêuticas.

Desempenha um papel importante em biotecnologia, terapia celular, campos da medicina

regenerativa, etc.

Problemas em culturas de células

o Crescimento lento;
o Diferenciação espontânea;

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o Evaporação;
o Contaminação;
o Segurança.

Questões
Suponha que estás num laboratório a trabalhar com um agente biológico potencialmente nocivo.
– Onde completarias o teu trabalho?
– Quais equipamentos e práticas de proteção usarias?
– Como conterias o agente biológico para limitar a contaminação ou contato acidental?

Biossegurança e perigos biológicos

Perigo
o Um objeto ou uma situação que tem o potencial de causar efeitos adversos quando um
organismo, sistema ou (sub)população é exposto a ele;
o No caso de biossegurança laboratorial, o perigo é definido como agentes biológicos que têm o
potencial de causar efeitos adversos ao pessoal e/ou humanos, animais e à comunidade e ao
meio ambiente em geral;
o Um perigo não se torna um “risco” até que a probabilidade e as consequências desse perigo
causar dano sejam levadas em consideração.

Biossegurança
o “Princípios, tecnologias e práticas de contenção que são implementados para prevenir a
exposição não intencional a agentes biológicos ou sua liberação inadvertida.”;
o É a aplicação de precauções de segurança que reduzem o risco de exposição a um agente
potencialmente infecioso e limitam a contaminação do ambiente de trabalho e, em última
análise, da comunidade.

Principais considerações na estrutura de avaliação de risco

Passo
1. Coletar informações (identificação de § Que agentes biológicos serão manuseados e quais são suas características
perigo) patogênicas?
§ Que tipo de trabalho de laboratório e/ou procedimentos serão realizados?
§ Que tipo(s) de equipamento será(ão) utilizado(s)?
§ Que tipo de instalação de laboratório está disponível?
§ Que fatores humanos existem (por exemplo, qual é o nível de competência
do pessoal)?
§ Que outros fatores existem que podem afetar as operações do laboratório
(por exemplo, legal, cultural, socioeconômico, perceção pública)?
2. Avaliar o risco § Como poderia ocorrer uma exposição e/ou liberação?
§ Qual é a probabilidade de uma exposição e/ou liberação?
§ Quais informações coletadas influenciam mais a probabilidade?
§ Quais são as consequências de uma exposição e/ou liberação?
§ Qual informação/fator influencia mais as consequências?
§ Qual é o risco inicial geral das atividades?
§ O que é um risco aceitável?
§ Quais riscos são inaceitáveis?
§ Os riscos inaceitáveis podem ser controlados ou o trabalho não deve
prosseguir?
3. Desenvolver uma estratégia de § Quais recursos estão disponíveis para medidas de controle de risco?
controlo do risco § Quais estratégias de controle de risco são mais aplicáveis aos recursos
disponíveis?
§ Os recursos são suficientes para obter e manter essas medidas de controle
de risco?
§ As estratégias de controle propostas são eficazes, sustentáveis e
alcançáveis no contexto local?
4. Selecionar e implementar medidas de § Existem regulamentações nacionais/internacionais que exigem medidas
controlo do risco de controle de risco prescritas?
§ Que medidas de controle de risco estão disponíveis localmente e são
sustentáveis?
§ As medidas de controle de risco disponíveis são adequadamente eficientes
ou devem ser usadas várias medidas de controle de risco em combinação
para aumentar a eficácia?

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 § As medidas de controle de risco selecionadas estão alinhadas com a
estratégia de controle de risco?
§ Qual é o risco residual após a aplicação das medidas de controle de risco e
agora é aceitável?
§ São necessários recursos adicionais e disponíveis para a implementação de
medidas de controle de risco?
§ As medidas de controle de risco selecionadas estão em conformidade com
os regulamentos nacionais/internacionais?
§ Foi concedida autorização para a realização do trabalho?
§ As estratégias de controle de risco foram comunicadas ao pessoal
relevante?
§ O item necessário foi incluído no orçamento e adquirido?
§ Os procedimentos operacionais e de manutenção estão em vigor?
§ O pessoal foi devidamente treinado?
5. Revisão dos riscos e das medidas de § Houve alguma mudança nas atividades, agentes biológicos, pessoal,
controlo do risco equipamentos ou instalações?
§ Existe algum novo conhecimento disponível sobre os agentes biológicos
e/ou os processos que estão sendo usados?
§ Existem lições aprendidas com relatórios de incidentes e investigações que
possam indicar melhorias a serem feitas?
§ Foi estabelecido um ciclo de revisão periódica?

Rota de Exposição
A via de exposição é a forma como um agente biológico obtém acesso a um organismo vivo.
Existem quatro vias principais de exposição:
§ Percutânea, através de pele quebrada ou danificada;
§ Inalação;
§ Membranas mucosas dos olhos, nariz e boca;
§ Ingestão;
§ Auto-inoculação percutânea (injeção ou incisão).

Níveis de Biossegurança (BSLs)

Quantos são?
§ Existem quatro níveis de biossegurança – BSL-1 a BSL-4;:
§ Cada nível possui controles específicos para contenção de micróbios e agentes biológicos

Riscos primários considerados (que determinam níveis de contenção)

§ Infeciosidade;
§ Gravidade da doença;
§ Transmissibilidade;
§ Natureza do trabalho realizado;
§ A origem do micróbio (ou o agente em questão) e a via de exposição também são
importantes.

Cada nível de biossegurança baseia-se nos controles do nível anterior.

Todo laboratório, independentemente do nível de biossegurança, segue práticas padrão.

Práticas padrão de segurança de laboratório

§ As boas práticas de laboratório são parte integrante da realização de pesquisas com segurança;
§ Controles de engenharia podem limitar a exposição a perigos e equipamentos de proteção
individual podem proteger o corpo de um pesquisador;
§ As boas práticas de laboratório incluem:
o Sem comida ou bebida
• Comer ou beber no laboratório pode aumentar o risco de exposição a materiais
perigosos;
• Alimentos ou bebidas podem deixar uma bagunça, aumentando os riscos de
contaminação de seus experimentos e potencialmente atraindo pragas;
• Comer ou beber no laboratório também pode ser uma distração que pode levar a um
derramamento ou a um incidente mais sério.

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 o Use seu equipamento de proteção individual e traje de laboratório adequado
• Calças compridas e sapatos que cubram completamente a parte superior do pé devem
ser usados em todos os momentos;
• Batas de laboratório protegem roupas e pele de respingos, derramamentos ou outras
exposições a agentes químicos ou biológicos e chamas em alguns casos;
• Óculos de segurança protegerão os olhos de danos físicos ou químicos (a pele
cicatrizará após pequenas queimaduras ou lacerações, mas os olhos não);
• As luvas protegem sua pele de materiais perigosos com os quais suas mãos podem
entrar em contato (no entanto, pode ocorrer exposição ao remover as luvas).
o Boa Higiene
• Lave as mãos após manusear quaisquer materiais perigosos, antes e depois de comer
e antes de sair do laboratório;
• Manter itens pessoais separados do trabalho de laboratório – isso evitará a
propagação de reagentes perigosos e cortará uma rota de exposição potencial;
• Não aplique cosméticos enquanto estiver no laboratório – aplicar qualquer coisa no
rosto, especialmente ao redor da boca ou dos olhos, representa um risco significativo
de exposição;
• A pele seca e rachada pode fornecer uma rota de exposição – usar loção para manter
a pele das mãos saudável pode ajudar a prevenir a exposição.
o Use recipientes de armazenamento adequados
• Armazenar solventes orgânicos em garrafas plásticas pode comprometer o recipiente,
assim como ácidos em recipientes de metal ou HF em vidro – os produtos químicos
devem ser armazenados em recipientes feitos de materiais que não reagirão;
• Grandes volumes de produtos químicos inflamáveis devem ser armazenados em
armários à prova de fogo – os ácidos e cáusticos devem, idealmente, ser armazenados
em armários separados forrados com plástico para evitar que quaisquer vapores
reajam com o invólucro de metal (produtos químicos conhecidos por reagirem
violentamente quando misturados devem ser armazenados separadamente);
• Assim como no armazenamento de produtos químicos, os resíduos devem ser
armazenados em recipientes não reativos ou recipientes com revestimentos não
reativos.
o Espaço de trabalho de etiqueta
• Todos os recipientes devem ser rotulados com seu conteúdo – isso é crucial para que
qualquer pessoa que visite o laboratório saiba quais riscos podem estar presentes.
Idealmente, os perigos presentes devem ser incluídos em qualquer rótulo;
• Qualquer processo de pesquisa com um perigo específico também deve ser rotulado
com esse perigo.
o Descontaminação rotineira de superfícies de trabalho

BSL-1 a 4
BSL-4
Agentes exóticos que apresentam alto risco de infeções laboratoriais transmitidas por aerossóis e
doenças potencialmente fatais, frequentemente fatais, para as quais não há vacinas ou tratamentos.
Exemplos: vírus Ebola, vírus smalLpox

BSL-3
Micróbios indígenos ou exóticos que podem causar doenças graves ou potencialmente letais por
inalação.
Exemplos: tuberculose, SARS-Cov-2, gripe aviária de alta patogenicidade, peste (Yersinia pestis)

BSL-2
Os micróbios representam um risco potencial moderado para o pessoal e o meio ambiente.
Exemplos: herpes simples, vírus do resfriado comum (R$V, rinovírus), salmonela

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BSL-1
Micróbios não conhecidos por causar doenças consistentemente
em humanos adultos imunocompetentes, de risco potencial
mínimo para o pessoal do laboratório e o meio ambiente.
Exemplos: bactérias da pele, levedura

Grupos de risco de micróbios

Grupo de Risco 1 (nenhum ou baixo risco individual e comunitário):
Um microrganismo que provavelmente não causa doença humana ou animal.

Grupo de Risco 2 (risco individual moderado, risco comunitário baixo):

Um patógeno que pode causar doenças humanas ou animais, mas é improvável que seja um risco
sério para os trabalhadores de laboratório, a comunidade, o gado ou o meio ambiente.
As exposições laboratoriais podem causar infeções graves, mas o tratamento eficaz e as medidas
preventivas estão disponíveis e o risco de propagação da infecão é limitado.

Grupo de risco 3 (alto risco individual, baixo risco comunitário)

Um patógeno que geralmente causa doenças graves em humanos ou animais, mas normalmente não
se espalha de um indivíduo infetado para outro.
Tratamento eficaz e medidas preventivas estão disponíveis.

Grupo de risco 4 (alto risco individual e comunitário)

Um patógeno que geralmente causa doenças graves em humanos ou animais e que pode ser
facilmente transmitido de um indivíduo para outro, direta ou indiretamente.
Tratamento eficaz e medidas preventivas geralmente não estão disponíveis.

BSLs
Nível de Biossegurança 1:
• Práticas, equipamentos de segurança e projeto e construção de instalações são apropriados para
o trabalho com cepas definidas e caracterizadas de microrganismos viáveis que não causam
doenças em adultos saudáveis;
• Adequado para trabalhar com agentes bem caracterizados que não causam doenças em
humanos saudáveis (Grupo de Risco 1);
• Práticas de laboratório:
o Práticas microbiológicas padrão;
o O trabalho pode ser realizado em uma bancada ou mesa de laboratório aberto.
• Equipamento de segurança:
o Equipamentos de proteção individual, jalecos, luvas, proteção para os olhos são usados
conforme necessário.
• Construção de instalações:
o Uma pia deve estar disponível para lavar as mãos;
o O laboratório deve ter portas para separar o espaço de trabalho do resto da instalação.
• Organismo de amostra:
o Escherichia coli

Nível de Biossegurança 2:
• Práticas, equipamentos de segurança e projeto e construção de instalações são apropriados para
trabalhar com um amplo espectro de agentes indígenas de risco moderado que estão presentes
na comunidade e associados a doenças humanas de gravidade variável;
• Adequado para trabalhar com agentes que apresentam riscos moderados (operadores e meio
ambiente) – os micróbios são tipicamente indígenos e associados a doenças de gravidade
variável (Grupo de Risco 2);
• Práticas de laboratório:

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 o Acesso ao laboratório restrito durante o trabalho.
• Equipamento de segurança:
o Equipamento de proteção individual adequado, incluindo jalecos e luvas. Proteção para
os olhos e protetores faciais usados conforme necessário;
o Todos os procedimentos que podem causar infeção por aerossóis ou respingos são
realizados dentro de uma cabine de segurança biológica;
o Uma autoclave ou um método alternativo de descontaminação está disponível para
descarte adequado.
• Construção de instalações:
o O laboratório possui portas de fechamento automático;
o Uma pia e lava-olhos.
• Organismo de amostra:
o Staphylococcus aureus

Nível de Biossegurança 3:
• Práticas, equipamentos de segurança e projeto e construção de instalações são apropriados para
o trabalho com agentes indígenas e exóticos com potencial de transmissão respiratória e que
podem causar infecção grave e potencialmente letal – no BSL 3, mais ênfase é colocada na
contenção primária e secundária para proteger o pessoal em áreas contagiosas, a comunidade
e o meio ambiente da exposição a aerossóis potencialmente infeciosos;
• Práticas de laboratório:
o Os operadores estão sob vigilância médica e podem receber imunizações para micróbios
com quem trabalham;
o O acesso ao laboratório é sempre restrito e controlado.
• Equipamento de segurança:
o Equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados, e respiradores
podem ser necessários;
o Todo o trabalho com micróbios deve ser realizado dentro de uma Cabine de Segurança
Biológica (BSC Biological Safety Cabin) apropriada.
• Construção de instalações:
o Duas portas de fechamento automático ou intertravadas, janelas seladas e superfícies de
parede e sistemas de ventilação filtrados;
o Uma pia e lava-olhos;
o Esses laboratórios devem usar fluxo de ar controlado ou “direcional” para garantir que o
ar flua de áreas não laboratoriais (como o corredor) para áreas de laboratório como
medida de segurança adicional.
• Organismo de amostra:
o Bacillus anthracis, Brucella abortus, Clostridium botulinum, Mycobacterium tuberculosis

Nível de Biossegurança 4:
• Práticas, equipamentos de segurança e projeto e construção de instalações são apropriados para
o trabalho com micróbios altamente perigosos e exóticos – as infeções causadas por esses tipos
de micróbios são frequentemente fatais e vêm sem tratamento ou vacinas;
• O mais alto nível de segurança biológica;
• Os micróbios em um laboratório BSL 4 são perigosos e exóticos (Grupo de Risco 4);
• O acesso aos laboratórios BSL-4 é cuidadosamente controlado e requer treino significativo;
• Práticas de laboratório:
o Troque de roupa antes de entrar;
o Chuveiro ao sair;
o Descontaminar todos os materiais antes de sair.
• Equipamento de segurança:
o Todo o trabalho com o micróbio deve ser realizado dentro de um recipiente hermético
apropriado Classe III BSC A;

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 o O pessoal do laboratório deve usar roupas de corpo inteiro com suprimento de ar – todo
o pessoal toma banho antes de sair do laboratório e passa por uma série de
procedimentos projetados para descontaminá-los completamente antes de sair.
• Construção de instalações:
o Um laboratório BSL-4 é extremamente isolado – muitas vezes localizado em um prédio
separado ou em uma zona isolada e restrita do prédio;
o O ar de exaustão da área do traje é filtrado por dois conjuntos de filtros HEPA instalados
em série – suprimentos e materiais necessários na instalação são trazidos por meio de
autoclave de porta dupla, câmara de fumigação ou câmara de ar, que é adequadamente
descontaminada entre cada uso;
o Uma pia e lava-olhos.
• Organismo de amostra:
o Vírus Ebola e Marburg e amostras extraterrestres.

Nível de BSL-1 BSL-2 BSL-3 BSL-4

biossegurança
Descrição Sem contenção; Contenção; Muita contenção; Contenção máxima;
Organismos Risco moderado; Transmissão aérea; “Exótico” – agentes de
definidos; Doença de gravidade Doenças alto risco;
Improvável de variável. sérias/potencialmente Doença com risco de vida
causar doenças. letais.
Organismos de E. coli Influenza, HIV, Tuberculose Vìrus Ebola
amostra doença de lyme
Tipo de patógeno Agentes que Agentes associados a Agentes indígenas ou Agentes perigosos e
apresentam um doenças humanas e exóticos - agentes que exóticos que
potencial de pedigo representam um apresentam potencial de representam um alto
mínimo para o risco moderado para transmissão de aerossóis e risco de infeções
pessoal e o o pessoal e o meio agentes causadores de laboratoriais
ambiente ambiente doenças graves ou transmitidas por
potencialmente letais aerossóis e doenças com
risco de vida
Requerimento de Nenhum Nenhum Autoclave de passagem Autoclave de passagem
autoclave (pass-thru) com Bioseal (pass-thru) com Bioseal
necessária na sala de necessária na sala de
laboratório laboratório

Relação dos grupos de risco com níveis, práticas e equipamentos de biossegurança

Grupos de risco Nível de Tipo de Práticas de laboratório Equipamentos de segurança
biossegurança laboratório
1 Básico – nível de Ensino básico; GMT Nenhum, trabalho de
biossegurança 1 Pesquisa bancada aberta
2 Básico – nível de Serviços de saúde GMT + roupas de Trabalho de bancada aberta
biossegurança 2 primária; proteção + sinal de risco + BSC para potenciais
Serviços biológico aerossóis
diagnósticos;
Pesquisa
3 Contenção – nível Serviços de Como no nível 2 + roupa BSC e/ou outros dispositivos
de biossegurança diagnóstics de proteção + acesso primários para todas as
3 especiais; controlado + fluxo de ar atividades
Pesquisa direcional
4 Contenção Unidades de Como no nível 3 + BSCs de class III ou fatos de
máxima – nível de patógenos entrada da câmara de ar pressão positiva em conjunto
biossegurança 4 perigosos + chuveiro à saída + com BSCs classe II, autoclave
descarte de lixo especial de dupla extremidade
(através da parede), ar
filtrado

Desinfeção e esterilização
• Biocidas, microbicidas, germicidas químicos, agentes antimicrobianos, químicos ou misturas de
químicos que matam organismos;
• Esporocidas – químico ou mistura de químicos que mata microrganismos e esporos;
• Antisético – substância que inibe o crescimento de microrganismos sem matá-los
necessariamente (aplicado na superfície do corpo);

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• Desinfetante – químico ou mistura de químicos que matam microrganismos, mas
necessariamente matar os esporos (aplicado em superfícies ou objetos inanimados);
• Desinfeção – ato físico ou químico de matar microrganismos, sem necessariamente matar
esporos;
• Esterilização – processo que elimina e/ou mata microrganismos, neutralizando químicos
perigosos e materiais radioativos.

Requisitos específicos de descontaminação/esterilização dependem do tipo de trabalho

experimental e da natureza do(s) agente(s) infecioso(s) manipulado(s).

Tempos de contato para desinfetantes são específicos para cada material e fabricante. Portanto,
todas as recomendações de uso de desinfetantes devem seguir as especificações dos fabricantes.

Tecnologia de DNA recombinante

Combinando material genético de diferentes fontes, criando organismos geneticamente modificados
(GMO - genetically modified organisms) que podem nunca ter existido na natureza antes.

Objetivos:
• Produtos de genes específicos de superexpressão para estudos adicionais;
• Animais e plantas transgênicos e “nocauteadores”;
• Terapia génica;
• ...

A reunião da Califórnia estabeleceu padrões que permitem aos geneticistas levar a pesquisa ao seu
limite sem colocar em risco a saúde pública.

Usando sistemas de expressão biológica (vetores e células hospedeiras):

Avaliação de risco de biossegurança à Propriedades patogênicas e quaisquer perigos potenciais
podem ser novos e não bem caracterizados à determinação do nível de biossergurança e
identificação de sistemas de contenção biológicos e físicos à Construção ou uso de GMOs.

Níveis mais altos de biossegurança podem ser necessários quando:

• Para vetores de expressão:
o A expressão de sequências de DNA derivadas de organismos podem aumentar a
virulência do GMO
o As sequências de DNA inseridas não são bem caracterizadas (por exemplo, durante a
preparação de bibliotecas de DNA genómico de microrganismos);
o Produtos gênicos têm atividade farmacológica potencial;
o Código de produtos génicos para toxinas.
• Para animais transgênicos e “knock out”:
o Animais transgênicos devem ser manuseados em níveis de contenção adequados às
características dos produtos dos genes estranhos;
o Animais com deleções direcionadas de genes específicos (animais “knock out”)
geralmente não apresentam riscos biológicos particulares.

Aerossóis (bioaerossóis)
Microrganismos ou partículas gases, vapores ou fragmentos de origem biológica (vivos ou liberados
de um organismo vivo que está no ar.

Podem ser criados das seguintes formas:

• Agitar, derramar, mexer ou deixar cair líquido em uma superfície ou em outro líquido;
• Espalhar placas de ágar, inocular frascos de cultura de células com uma pipeta, usar uma pipeta
multicanal para dispensar suspensões líquidas de agentes infecciosos em placas de microcultura;
• Homogeneização e vortex de materiais infeciosos;

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• Centrifugação de líquidos infeciosos;
• Trabalhando com animais.

Partículas de aerossol:
• < 5 μm de diâmetro;
• Pequenas gotículas de 5 - 100 μm de diâmetro não visíveis a olho nu;
• O funcionário do laboratório geralmente não está ciente de que tais partículas estão sendo
geradas e que podem ser inaladas ou podem contaminar os materiais da superfície de trabalho.

BSC são projetados para proteger:

• O operador;
• O ambiente do laboratório;
• Materiais de trabalho da exposição a aerossóis e respingos infeciosos

Conceitos de Design:
• Filtro de ar particulado de alta eficiência (HEPA) para o sistema de exaustão retém 99,97% das
partículas de 0,3μm Ø);
• O ar filtrado HEPA é direcionado sobre a proteção da superfície de trabalho dos materiais da
superfície de trabalho.
• Três classes de BSCs:
o Biological Safety Cabinets (Class I; II and III).

Biological Safety Cabinets

Biological Safety Cabinets (Class I)
• Vantagens:
o Fornece proteção tanto ou ambiente como ao pessoal;
o Podem também ser utilizados para trabalhos com radionuclídeos e produtos químicos
tóxicos voláteis.
• Desvantagens:
o Não é considerado para fornecer proteção de produto consistentemente confiável.

O ar ambiente é aspirado pela abertura frontal, passando pela superfície de trabalho e sendo
descarregado do gabinete através do duto de exaustão.

Biological Safety Cabinets (Class II – A1, A2, B1, B2)

• Vantagens:
o Fornece proteção dos materiais da superfície de trabalho contra o ar contaminado,
permitindo que apenas o ar de um suprimento filtrado (estéril) HEPA flua sobre a
superfície de trabalho.
• Utilizado para:
o Trabalhar com agentes infeciosos nos Grupos de Risco 2 e 3:
§ Pode ser usado com agentes infeciosos do Grupo de Risco 4 quando são usados
trajes de pressão positiva.

Biological Safety Cabinets (Class III)

• O mais alto nível de proteção pessoal:
o O ar fornecido é filtrado por HEPA e o ar de exaustão passa por dois filtros HEPA;
o O fluxo de ar é mantido por um sistema de exaustão dedicado externo ao gabinete, que
mantém o interior do gabinete sob pressão negativa;
o O acesso à superfície de trabalho é feito por meio de luvas de borracha resistentes, que
são fixadas nas portas do gabinete.
• Usado para:

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 o Trabalhar com agentes infeciosos em Grupos de Risco 4.

• Trabalho “limpo” para “sujo”;

• Utilizar bandejas de pipetas horizontais e recipientes internos de risco biológico;
• Desinfeta derramamentos com desinfetante apropriado;
• Não colocar itens na grade frontal ou bloqueie a grade traseira;
• Evite turbulências ao trabalhar no BSC, use movimentos lentos e deliberados ao mover a mão
para fora do gabinete.
Armários de saída horizontais e verticais (estações de trabalho de ar limpo):
• Projetado para proteger os materiais de trabalho da exposição a aerossóis e respingos infeciosos;
• Para uso na maioria dos ambientes sensíveis à contaminação;
• Controlo de contaminação por partículas;
• Fechado em 3 lados e uma pressão de ar positiva constante é mantida para evitar a intrusão de
qualquer ar contaminado.

Armários de fluxo laminar vertical – PRÓS:

• Maior proteção do operador;
• Armário não tão profundo;
• Adequado para composição de produtos estéreis;
• Segurança: O ar não soprará diretamente no operador e a faixa fornece uma barreira;
• Menos turbulência do ar atingindo grandes objetos ou equipamentos;
• Menos contaminação cruzada de itens posicionados na superfície de trabalho.

Armários de fluxo laminar vertical – CONTRAS:

• Não é possível colocar itens ou mãos em cima de outros itens, pois isso obstruirá o fluxo de ar;
• Aumento do efeito turbulento do ar atingindo a superfície de trabalho.

Armários de fluxo laminar horizontal – PRÓS:

• Maior proteção do produto;
• Efeito turbulento reduzido da superfície de trabalho de impacto de ar;
• Mais fácil de trabalhar e posicionar o equipamento, mas o ar sopra diretamente no operador.

Armários de fluxo laminar horizontal – CONTRAS:

• Amostras grandes obstruem o fluxo de ar laminar, podem contaminar amostras a jusante;
• Sopra fumos e/ou pós no rosto do operador.

As cabines de saída horizontal e vertical ("estações de trabalho de ar limpo") não são cabines de
segurança biológica e não devem ser usadas como tal. Não deve ser usado com aerossóis perigosos,
alérgenos e toxinas.

Organismos Infeciosos por Risco

Classificação de microrganismos infeciosos por grupo de risco

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 Diretrizes do NIH para pesquisa
Classificação do grupo de risco envolvendo moléculas de DNA
recombinante 2002
Agentes não associados a doenças em
Grupo de risco 1 humanos adultos saudáveis.
Agentes associados a doenças humanas
raramente graves e para as quais as
Grupo de risco 2 intervenções preventivas ou
terapêuticas estão frequentemente
disponíveis.
Agentes associados a doenças humanas
graves ou letais para as quais podem
Grupo de risco 3 estar disponíveis intervenções
preventivas ou terapêuticas (alto risco
individual, mas baixo risco comunitário).
Agentes suscetíveis de causar doenças
humanas graves ou letais para as quais
as intervenções preventivas ou
Grupo de risco 4 terapêuticas geralmente não estão
disponíveis (alto risco individual e alto
risco comunitário).
Resumo dos Requisitos de BSL
a – Isolamento ambiental e funcional do tráfego genérico
b – Dependente da localização do escapamento
c – Depende dos agentes utilizados no laboratório
d – Por exemplo, janela, circuito fechado de televisão, comunicação bidirecional
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Manual de biossegurança laboratorial
da Organização Mundial da Saúde
terceira edição (2004)
(Nenhum ou baixo risco individual e
comunitário)
Um microrganismo improvável de
causar doença humana ou animal.
(Risco individual moderado; risco
comunitário baixo)
Um patógeno que pode causar doenças
humanas ou animais, mas é improvável
que seja um perigo sério para os
trabalhadores de laboratório, a
comunidade, o gado ou o meio
ambiente. As exposições laboratoriais
podem causar infeções graves, mas o
tratamento eficaz e as medidas
preventivas estão disponíveis e o risco
de propagação da infeção é limitado.
(Alto risco individual; baixo risco para a
comunidade)
Um patógeno que geralmente causa
doenças graves em humanos ou
animais, mas normalmente não se
espalha de um indivíduo infetado para
outro. Tratamento eficaz e medidas
preventivas estão disponíveis.
(Alto risco individual e comunitário)
Um patógeno que geralmente causa
doenças graves em humanos ou animais
e pode ser facilmente transmitido de um
indivíduo para outro, direta ou
indiretamente. Tratamento eficaz e
medidas preventivas geralmente não
estão disponíveis.
Biossegurança em Microbiologia e Laboratório Biomédico
Nivel de Agente infecioso Exemplos Práticas e Equipamento Construções
biossegurança técnicas segurança (barreira (barreiras
primária) secundárias)
1 Não se sabe que Bacillus Práticas Nada solicitado Necessário pia de
causa subtilis, microbiológicas bancada aberta
consistentemente Naegle ria padrão
doenças em adultos gruberi,
saudáveis. Canino
infecioso,
vírus da
hepatite,
E.coli.
2 Associado a Measles Nível 1 mais: Barreiras primárias:
doenças humanas. virus, Acesso limitado; BSCs Classe I ou II ou Nível 1 mais:
Os riscos primários salmonellae, Sinais de alerta de outros dispositivos Autoclave disponível.
são lesão Toxoplasma risco biológico; de contenção física
percutânea, spp, vírus da Precauções dos usados para todas as
ingestão, exposição hepatite B. "pontiagudos"; manipulações de
da membrana Manual de agentes que causam
mucosa. biossegurança respingos ou
definindo aerossóis de
quaisquer materiais infeciosos.
políticas de Equipamento de
descontaminação proteção pessoal:
de resíduos ou Bata de laboratório,
vigilância médica luvas, proteção facial
necessárias; caso necessário.
Proteção
respiratória
conforme
necessário.

3 Agentes indígenas M. Nível 2 mais: Barreiras primárias: Nível 2 mais:

ou exóticos com Tuberculose, Acesso BSCs Classe I ou II ou Separação física dos
potencial de vírus da controlado; outros dispositivos corredores de acesso;
transmissão por encefalite de Descontaminação de contenção física Auto-fechamento,
aerossol, doença São Luís, de resíduos; usados para todas as acesso de porta dupla;
pode ter Coxiella Descontaminação manipulações Ar de exaustão não
consequências Burnetii, de roupas de abertas de agentes. recirculado;
graves ou letais. Bacillus laboratório; Equipamento de Fluxo de ar negativo
anthracis Amostras de soro proteção pessoal: para o laboratório.
(nível de de linha de base Roupas de
produção). do pessoal do laboratório, luvas,
laboratório. proteção respiratória
caso necessário.

4 Agentes Ebola zaire, Nível 2 mais: Barreiras primárias: Nível 3 mais:

perigosos/exóticos Vírus Sin Acesso Todos os Edifício separado ou
que representam Nombre, controlado; procedimentos zona isolada;
um alto risco de Febre do Vale Descontaminação conduzidos em BSCs Sistemas dedicados
doença com risco de do Rift. de resíduos; Classe III ou I ou II em de vácuo de
vida. Infeções Descontaminação combinação com alimentação/exaustão
laboratoriais de roupas de traje pessoal de e descontaminação;
transmitidas por laboratório; corpo inteiro, com Requisitos adicionais
aerossol ou agentes Amostras de soro suprimento de ar e conforme descrito em
relacionados com de linha de base pressão positiva. Biossegurança em
risco de transmissão do pessoal do Laboratórios
desconhecido. laboratório. Microbiológicos e
Biomédicos.

Contaminação
• Contaminantes químicos (por exemplo, presentes na água e no meio, resíduos de detergente);
• Contaminantes biológicos (por exemplo, bactérias, fungos, micoplasma, parasita, virion e
contaminação cruzada) – o problema mais comum nos estudos de cultura de células;
• Mycoplasma: 5 - 30% de todas as culturas de células hoje estão contaminadas;
• Vírus: a incidência em linhagens celulares comuns ultrapassou 25% em um estudo.

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Contaminantes biológicos

Contaminações cruzadas:
• Mistura de um tipo de célula/linhagem celular diferente em uma cultura de células
anteriormente homogênea;
• Identificação errônea de linhas celulares.

Prevenção e eliminação da contaminação

• Prevenção:
o Sempre manuseie apenas uma linha de células na bancada de cada vez;
o Use frasco médio separado para cada linha celular
• Diagnóstico:
o Geralmente não é fácil, especialmente quando as morfologias são semelhantes;
o Sinais: mudanças nas taxas de crescimento, morfologias e taxas de produção ou resultados
que mudam repentinamente.
• Trabalhando no Gabinete de Segurança Biológica;
• Pipetagem e prevenção de Aerossóis
• Desinfeção: as superfícies e equipamentos de trabalho devem não apenas minimizar o risco de
contaminação, mas também ser seguros para o pessoal do laboratório:
o Hipoclorito de sódio (ou alvejante):
§ Bom desinfetante de uso geral;
§ Ativo contra vírus;
§ Corrosivo contra metais;
§ Deve ser usado fresco;
§ Use uma solução de 10% (v/v) no líquido residual ou para desinfeção de
superfícies.
o Álcool (por exemplo, etanol, bom desinfetante de uso geral)
§ Concentrações efetivas;
§ 70% para etanol, 60-70% para isopropanol;
§ Eficaz contra bactérias;
§ O etanol é eficaz contra a maioria dos vírus;
§ O isopropanol não é eficaz contra vírus.
• Esterilização por autoclavagem:
o 121°C por 15 a 20 min;
o Princípio – vapor saturado em suspensão;
o Coloque o sensor no recipiente de referência no meio;
o Indicador de esterilização (fita de autoclave);
o Acondicionamento na autoclave (garrafas com tampa de rosca, folha de polietileno,
folha de alumínio);
o Verificar a autoclave uma vez por ano, realizar controles estéreis (ampolas de esporos
ou fita com esporos de Geobacillus ou Bacillus).
• Esterilização por calor seco:
o 160°C por pelo menos 180 min ou 180°C por 30 min;
o Princípio – calor seco;
o A carga deve estar absolutamente seca;

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 o Água residual leva ao aumento da resistência dos esporos devido à redução parcial da
temperatura devido à evaporação;
o Indicador de esterilização (fita autoclave, Steam Clox).
• Filtração estéril:
o Método de esterilização: filtração:
§ Filtração com seringa e filtro ou via bomba de vácuo e filtro top de garrafa.
o Tamanho de poro habitual: 0,2μm. No entanto, apenas tamanhos de poros abaixo de
0,1 μm protegem da contaminação por Mycoplasma;
o Quanto menor o tamanho dos poros, maior a perda de proteína;
o Antibióticos em meios não protegem da contaminação – eles podem manter a
contaminação subaguda e então podem induzir um aumento de bactérias resistentes.

Congelamento de Células (criopreservação)

Porquê criopreservar?
• Ameaças à cultura de células:
o O envelhecimento celular e as alterações genéticas são observados em relação ao
aumento do número de passagens em estudos de cultura de células;
o Risco de contaminação com diferentes agentes.
• Culturas celulares podem ser necessárias no laboratório de forma contínua ou esporádica.

Criopreservação:
• Usado para armazenar e estocar células:
o Armazenamento em nitrogênio líquido;
o Resfriamento a 1°C por minuto;
o Meios criogênicos influenciam a formação de cristais de gelo;
o Descongele rapidamente a 37°C.
• Caixa de Congelamento:
o Adequado para taxas de
resfriamento lentas de cerca de
1oC/min.
• Equipamento de Armazenamento de
Nitrogênio Líquido:
o Adequado para taxas de
resfriamento lentas de cerca de
1oC/min.
• Um crioprotetor é frequentemente usado
para proteger o tecido biológico de danos
por congelamento (ou seja, devido à
formação de gelo);
• Soluções frequentemente usadas:
o DMSO;
o Glicerol – alto uso para células bacterianas;
o Etilenoglicol (mais tóxico);
o A série de banco de células (mistura de DMSO, um polímero específico, pH),
modificadores, glicose, albumina sérica bovina) – para células de mamíferos;
o Prolina;
o Sorbitol.

Comunicação de perigo: Rotulagem e Fichas de Dados de Segurança

Sistema Global Harmonizado de classificação e rotulagem de produtos químicos (GHS)
• Aborda a classificação de produtos químicos por tipos de perigo;
• Propõe elementos de comunicação de perigos harmonizados, incluindo rótulos e fichas de
dados de segurança;

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 • Destina-se a garantir que as informações sobre os perigos físicos e a toxicidade dos produtos
químicos estejam disponíveis para aumentar a proteção da saúde humana e do meio
ambiente durante o manuseio, transporte e uso desses produtos químicos;
• A ILO (International Labour Organization – Organização Internacional do Trabalho) iniciou
este projeto como acompanhamento da adoção da Convenção de Produtos Químicos, 1990.

Ficha de dados de segurança

Fornece informações abrangentes sobre uma substância ou mistura:
• Fonte de informação sobre perigos, incluindo ambientais;
• Conselhos sobre precauções de segurança;
• Permitir que o empregador:
o Desenvolver um programa ativo de medidas de proteção ao trabalhador, incluindo
treinamento;
o Considerar quaisquer medidas que possam ser necessárias para proteger o meio
ambiente.

As informações são dadas na seguinte ordem:

1. Identificação;
2. Identificação dos perigos;
3. Composição/informação nos ingredientes;
4. Medidas de primeiros socorros;
5. Medidas de combate a incêndio;
6. Medidas de liberação acidental;

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 7. Manuseio e armazenamento;
8. Controlo de exposição/proteção individual;
9. Propriedades físicas e químicas e características de segurança;
10. Estabilidade e reatividade;
11. Informação toxicológica;
12. Informação ecológica;
13. Considerações sobre descarte;
14. Informação de transporte;
15. Informações regulamentares;
16. Outra informação.

O mundo microbiano
O que é um microrganismo?
• Formas microscópicas de vida (pequenas demais
para serem vistas a olho nu);
• Geralmente consistem em organismos unicelulares;
• Onipresente;
• Tanto útil quanto problemático.

Em uma gota (1 mL) de água do mar, pode-se encontrar

10 milhões de vírus, 1 milhão de bactérias e cerca de
1.000 pequenos protozoários e algas (chamados de
“protistas”).

Algumas características de micróbios e vírus

Grupo Organização Presença de parede Tipo de Presença de Causa doenças
celular celular informação compartimentos infeciosas em
genética internos humanos
Bactéria Procariótico A maioria sim; Cromossoma Alguns Algumas
Composta por único de DNA
peptidoglucano. circular
Archaea Procariótico Sim; Cromossoma Alguns Nenhuma
Diferente das único de DNA conhecida
bactérias. circular
Protistas Eucariótico Algas sim; Várias Muitos Algumas
Composta por cromossomas de
celulose. DNA linear
Fungos Eucariótico Sim; Várias Muitos Algumas
Composta por cromossomas de
quitina. DNA linear
Vírus Acelular Não DNA ou RNA Nenhum Algumas

A árvore da vida

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E os vírus? Os vírus estão vivos?
Ainda em discussão.

Dimensões microbianas

Cultura de microrganismos
1. Os microrganismos devem ser removidos do ambiente natural e cultivados no laboratório.
Isso requer meios artificiais e superfícies nas quais eles podem crescer – conhecimento dos
requisitos nutricionais e ambientais (como temperatura de incubação e/ou oxigênio);
2. Os microrganismos de interesse devem ser separados de todos os outros na amostra
ambiental – isso requer técnicas de separação que permitem o isolamento de uma cultura
pura de um tipo;
3. Uma cultura pura é alcançada, nenhum contaminante pode ser produzido a partir do
ambiente – isso requer que todos os meios e suprimentos de laboratório sejam estéreis;
4. São necessárias técnicas que facilitem o trabalho com culturas puras – isso requer técnicas
assépticas e técnicas de armazenamento para culturas puras.

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Vírus
• Sem organização celular;
• Diâmetro inferior a 200 nm;
• Informação genética (DNA ou NA)
cercada por uma capa de proteína;
• Replicam ativamente dentro de células
vivas (hospedeiras);
• Falta um ribossoma, impedindo-os de
produzir suas próprias proteínas;
• Infetam toda a vida celular;
• Causam doenças infeciosas (hepatite,
gripe, AIDS, Covid-19, ...);
• A terapia viral converte-os em agentes terapêuticos, reprogramando para tratar doenças:
o Vírus oncolíticos anticancerígenos;
o Vetores virais para terapia génica;
o Imunoterapia viral.

Cultivando vírus
• Como os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios, eles não podem ser cultivados em
nenhum meio de cultura inanimado;
• Os vírus podem ser cultivados em hospedeiros adequados, como uma célula viva;
• Não há célula universal que suporte todos os vírus;
• Os vírus tendem a ser específicos do host, portanto:
o Os vírus humanos crescem
melhor em células de origem
humana;
o Vírus bovinos em células
bovinas;
o Fagos em células bacterianas;
o Enquanto alguns vírus não
crescem in vitro;
o No laboratório, o vírus suspeito
deve ser cultivado usando um
método de cultura conhecido
por apoiar seu crescimento.
• Células hospedeiras infetadas (eucarióticas ou procarióticas) podem ser cultivadas e cultivadas;
• O meio de crescimento pode ser colhido como fonte de vírus;
• Os virões (a partícula infeciosa projetada para transmissão do genoma do ácido nucleico entre
hospedeiros ou células hospedeiras) no meio líquido podem ser separados das células
hospedeiras por centrifugação ou filtração;
• Filtração:
o Os filtros podem remover fisicamente qualquer coisa
presente na solução que seja maior que os viriões;
o Os vírus podem então ser coletados no filtrado.
Os filtros de membrana podem ser usados para remover células ou vírus
de uma solução. O tamanho dos poros no filtro determina o que é
capturado na superfície do filtro (animal [vermelho] e bactérias [azul]) e
removido do líquido que passa. Observe que os vírus (verde) passam pelo
filtro mais fino.

• Os vírus podem ser cultivados:

o In vivo – dentro de todo um organismo vivo, planta ou animal;

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 o In vitro – fora de um organismo vivo em células em ambiente artificial, como tubo de
ensaio, frasco de cultura celular ou placa de ágar.
• Vírus animais
o Requerem células dentro de um animal hospedeiro (in vivo) ou tecidos – cultura de
células derivadas de um animal (in vitro).
• O cultivo de vírus animal é importante para:
o Identificação e diagnóstico de vírus patogênicos em espécimes clínicos;
o Produção de vacinas;
o Estudos de pesquisa básica.
• Cultivo in vivo:
o Pode ser um embrião em desenvolvimento em um ovo de ave embrionado (por
exemplo, galinha, peru) ou um animal inteiro:
§ Por exemplo, a maior parte da vacina contra a gripe fabricada para os
programas anuais de vacinação contra a gripe é cultivada em ovos de galinha.
o O embrião ou animal hospedeiro serve como incubadora para a replicação viral;
o A localização dentro do embrião ou
animal hospedeiro é importante:
tropismo tecidual;
o Dentro de um embrião, os locais de
destino incluem:
§ Cavidade amniótica;
§ A membrana corioalantóica;
§ O saco vitelino.
o Vários tipos de células podem ser usados para apoiar o crescimento de vírus:
§ Linhas celulares primárias (preparadas na hora a partir de órgãos ou tecidos
animais);
§ Linhas celulares contínuas (derivadas de células transformadas ou tumores).

o O método preferido para fabricar as vacinas contra a gripe.

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• Tropismo tecidual:
o São as células e tecidos de um hospedeiro que suportam o crescimento de um
determinado vírus ou bactéria:
§ Algumas bactérias e vírus têm um amplo tropismo tecidual e podem infectar
muitos tipos de células e tecidos;
§ Outros vírus podem infetar principalmente um único tecido.
Por exemplo, o vírus da raiva afeta principalmente o tecido neuronal.
o Portanto, deve ser introduzido em um local específico para crescimento.
• Tropismo viral:
o Tropismo celular:
§ O vírus se replica em um tipo de célula, mas não se conhece outro.
o Tropismo tecidual:
§ O vírus se replica em um tecido ou órgão específico, mas nenhum outro é
conhecido.
o Tropismo do hospedeiro:
§ O vírus se replica em uma espécie hospedeira, mas não se conhece outra.

• Cultivo in vitro:
o Deteção/identificação de vírus – as culturas de células fornecem um ambiente
adequado para deteção e identificação de muitos patógenos virais humanos;
o Pesquisa de interação hospedeiro-patógeno – sistemas de cultura de células in vitro
podem facilitar o acesso experimental para investigação do modo e fatores etiológicos
da infeção viral;
o Estrutura e replicação viral – os sistemas de cultura de células podem facilitar o
crescimento do vírus e elucidar o desenvolvimento e as interações com as células
hospedeiras em todas as fases da replicação;
o Produção de vacinas – os sistemas de produção de vacinas baseados em células
oferecem uma abordagem flexível e econômica para atender às necessidades de
produção de vacinas (as vacinas baseadas em vírus produzidas em células de mamíferos
também podem oferecer melhor proteção contra infeções virais, pois replicam mais de
perto os vírus em circulação do que as vacinas produzidas em ovos de galinha).

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• Cultivo de bacteriófagos in vitro:
o Pode ser cultivado na presença de uma camada densa de bactérias (grama bacteriano)
cultivada em ágar mole 0,7% em uma placa de Petri ou frasco plano (horizontal);
o O ágar mole permite que os fagos se difundam facilmente pelo meio;
o Para fagos líticos, a lise dos hospedeiros bacterianos é prontamente observada quando
uma zona clara chamada placa é detetada.

Protistas – Protozoa and Algae

Protistas
• Não formam um grupo natural ou clado
(organismos que não são animais, plantas ou
fungos);
• Todos os protistas são eucariotos, com
membranas nucleares e organelas ligadas à
membrana;
• Unicelular ou unicelular-colonial que não forma
tecidos (de acordo com Whitaker);
• Heterotrófico, autotrófico e às vezes
parasitário;
• Reprodução assexuada a sexual;
• Patogénico a benéfico;
• Séssil para celular.

Protistas movem-se:
• Flagelo;
• Cílios;
• Pseudópode.

Animal-like:
• Amoeba;
• Paramcium;
• Stentor.

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 Amoeba ingerindo a paramécium Stentor Paramecium com vacúolos alimentares
corados de vermelho
Plant-like:
• Autótrofos, fotossíntese:
o Euglena;
o Algas;
o Diatomáceas.

Protistas parasitas e patogênicos:

• Plasmodium;
• Giárdia;
• Tripanossomas.

Protistas benéficos e necessários:

• Algas:
o Grande parte da fotossíntese do mundo;
o Produzem ~ 90% do oxigênio atmosférico.
• Protistas heterotróficos + animais:
o Papel ecológico chave na base da teia alimentar.

Tipos nutricionais no metabolismo de protistas

Tipo nutricional Fonte de energia Fonte de carbono Exemplos
Fotoautotrofia Luz solar Compostos orgânicos ou Maioria das algas
fixação de carbono
Quimioheterotrofia Compostos orgânicos Compostos orgânicos Apicomplexa, Tripanossomas
ou Amoeba

Manutenção de culturas
• Existem vários métodos para manter culturas de estoque de parasitas protozoários:
o Subculturas repetidas;
o Congelamento a -20°C;
o Congelamento de temperatura ultrabaixa de -70°C a -196°C usando crioprotetores
como 10-30% de glicerol, 5% de dimetilsulfóxido e sacarose;
o Eles também podem ser armazenados como tiras de papel de filtro secas à temperatura
ambiente.
• As formas ambientais de alguns parasitas protozoários, como esporos e oocistos, são cultiváveis
em células hospedeiras suscetíveis;
• Diferentes métodos de cultura (requisitos):
o Cultivo xênico – o parasita é cultivado na presença de uma flora indefinida;
o Cultivo monoxênico – o parasita é cultivado na presença de uma única espécie
associada;
o Cultivo axênico – o parasita é cultivado na ausência de quaisquer outras células
metabolizadoras.

Cultivo de protistas
Exemplo – axenização de Entamoeba histolytica:

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 o Processo trabalhoso e demorado;
o As culturas xênicas do organismo são primeiramente adaptadas ao crescimento
monoxênico;
o Os organismos são adaptados de um estilo de vida fagocitário para um onde os
nutrientes são obtidos em grande parte por pinocitose;
o Todo o processo geralmente leva meses.

Trofozoítos de E. histolytica com eritrócitos ingeridos corados com tricrômio. Os eritrócitos

ingeridos aparecem como inclusões escuras. Os parasitas acima mostram núcleos que possuem o
típico cariossoma pequeno, localizado centralmente, e cromatina periférica fina e uniforme.

Animais usados para cultivo in vivo de parasitas

O refinamento progressivo das condições de cultivo inclui a mudança da água de coleta para soluções
salinas sintéticas definidas e, no caso de organismos fagotróficos, de uma dieta indefinida para uma
específica.

Meio importante usado para cultivar protistas parasitas luminais

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Para outros parasitas de veiculação hídrica, como Giardia lamblia e Cyclospora cayatenensis, o
cultivo do estágio ambiental (o cisto ou oocisto) ainda é um desafio.

Potencial industrial de Euglena gracilis

Xenodiagnóstico
Triatomídeos têm sido empregados no diagnóstico de infeções por Trypanosoma cruzi onde não foi
possível demonstrar os organismos em esfregaços sanguíneos:
• Insetos criados em laboratório são alimentados com sangue do paciente;
• O conteúdo intestinal dos insetos é examinado para flagelados 10-30 dias após a refeição de
sangue;
• Estes podem então ser inoculados em camundongos para confirmação adicional.

A identificação de Borrelia hispanica utilizou carrapatos e cobaias.

Fungos (mofos, cogumelos e leveduras)

Fungos
• Fungos multicelulares formam filamentos, leveduras
crescem unicelularmente;
• Principais decompositores;
• Simbiontes e parasitas;
• Elevado potencial biotecnológico (antibióticos,
detergentes, enzimas...);
• Estimativa de meio milhão a 10 milhões de espécies;
• Cerca de 120.000 espécies de fungos formalmente
classificadas;
• 5 filos (classificados de acordo com suas estruturas
reprodutivas).

Fungos filamentosos
• Heterotróficos (quimio-organo-heterotróficos):

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 o Sem fotossíntese;
o Requerem matéria orgânica.
• Podem viver como saprófitas (usar plantas e animais
mortos ou seus resíduos) ou parasitas assimilando tecidos
de plantas e animais vivos;
• Um ciclo de vida fúngico típico: formação de hifas
vegetativas filiformes que formam um micélio (uma
estrutura tridimensional de hifas capaz de assimilação
eficaz de nutrientes e crescimento agressivo);
• Esporos, hifas e micélios:
o Esporos – o esporo é uma unidade de reprodução
sexuada ou assexuada que pode ser adaptada para dispersão e sobrevivência, muitas
vezes por longos períodos de tempo;
o Micélio – o micélio é a parte vegetativa de um fungo, consistindo em uma massa de
hifas ramificadas e semelhantes a fios;
o Hifas – na maioria dos fungos, as hifas são o principal modo de crescimento vegetativo
e são chamadas coletivamente de micélio.

Isolamento de fungos
• Uma variedade de tipos de meios:
o Sólido ou líquido;
o A maioria cresce em meio contendo uma fonte alta de carboidratos, fonte de nitrogênio,
pH de 5-6 e faixa de temperatura de 15 a 37 oC;
o Alguns não podem ser cultivados in vitro e sobrevivem apenas em sua planta hospedeira
(exemplo: Plasmopara viticola, o agente causal do míldio da videira).

Cultivo de fungos
• Finalidade para cultivo em culturas líquidas:
o Biomassa crescente:
§ Produção de enzimas;
§ Produção de antibióticos.
• Para fins industriais, os fungos filamentosos
são cultivados em fermentadores (até
100.000 L de volume) onde os parâmetros de
cultivo podem ser controlados e o processo
automatizado;
• Os meios de cultura podem ser:
o Naturais:
§ Caules herbáceos ou lenhosos;
§ Sementes, folhas;
§ Fubá;
§ Trigo;
§ Germe e farinha de aveia: (ágar de farinha, ágar de
dextrose de batata, ...).
o Sintéticos:
§ Contém quantidades definidas de carboidratos,
nitrogênio e fontes de vitaminas (meio Czapek-Dox,
glicose-asparagina e meio mínimo Neurospora crassa).
• Obter uma cultura pura:
o Inocular um único esporo ou um pedaço de micélio no meio de ágar em tubos inclinados
ou em placas de Petri;
o Os tubos ou placas são colocados em uma incubadora (geralmente mantida a uma
temperatura de 30-37°C) por alguns dias, após os quais as placas de ágar e as inclinações
mostrarão o crescimento do fungo na forma pura.

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Bactérias procarióticas e Archaea
Bactéria
• Ampla gama de capacidades metabólicas e, portanto, encontrada em uma variedade de
ambientes (extremos);
• Pode ser fotossintética (Cianobactérias) ou não fotossintética (obter energia de compostos
orgânicos ou inorgânicos);
• Biofilme ou estilo de vida planctónico;
• Crescimento na presença de ar (aeróbio) ou na sua ausência (anaeróbio) ou pode ser anaeróbico
facultativo.
Morfologia celular

Archaea
• Menor gama de capacidades metabólicas do que bactérias e mais do que eucariotas;
• Idêntico morfológico com bactérias (com exceções, como Haloquadratum walsbyi);
• Genes e várias vias metabólicas mais intimamente relacionadas aos dos eucariotos (como
enzimas envolvidas na transcrição e tradução);
• Nenhuma espécie conhecida forma esporos;
• Inicialmente pensado para ser exclusivo de ambientes extremos, mas são onipresentes;
• Sem associação com patogenicidade.
Termófilos produzem algumas cores brilhantes

Archaea – biotecnologia
• Archaea produtora de metano - usada para produção de biogás e tratamento de esgoto;
• Enzimas de extremófilos que podem suportar altas temperaturas e solventes orgânicos química
verde – usada para sintetizar compostos orgânicos;
• Enzimas termoestáveis de PCR;
• Lipases arqueais – por exemplo: produção de queijo;

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• Proteases Archaeal (por exemplo, padaria, carne macia).

Cultivo de bactérias
Requisitos para o crescimento
• Requisitos físicos:
o Temperatura;
o pH;
o Oxigênio;
o Pressão hidrostática;
o Pressão osmótica.
• Requisitos químicos:
o Carbono;
o Nitrogênio;
o Enxofre;
o Fósforo;
o Vestígios;
o Oxigênio;
o Fator de crescimento orgânico:
§ Compostos orgânicos essenciais que um organismo é incapaz de sintetizar
(vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas).

Nutrição bacteriana e design de meios de cultura

• Baseado no metabolismo bacteriano;
• pH da cultura;
• Oxidação da cultura - potencial de redução;
• Requisitos gasosos:
o Oxigênio, dióxido de carbono e outros gases.

pH do meio de cultura
• Requisitos físicos:
o pH ótimo: o pH em que o microrganismo cresce melhor;
o A maioria cresce entre pH 6,5 e 7,5;
o A maioria das bactérias clinicamente importantes cresce melhor
em reação neutra ou levemente alcalina (pH 7,2-7,6);
o Podem ser classificados de acordo com sua tolerância ao pH.

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Temperatura
• Temperatura ideal de crescimento - maior taxa de crescimento.

Crescimento de E.coli em ágar nutriente em três temperaturas diferentes:

Uso de oxigénio

Meio de cultura
• Classificação de acordo com:
o Estado físico;
o Composição química;
o Tipos de função.
• Pode ser usado para:
o Enriquecer o número de bactérias;
o Selecione para certas bactérias e suprima outras;
o Diferenciar entre os diferentes tipos de bactérias.
• Estado físico:
o Meio líquido: por exemplo, caldo nutritivo;
o Meio semi-sólido;
o Meio sólido: por exemplo, ágar nutriente.

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 Os meios sólidos contêm uma Os meios líquidos contêm
alta % de ágar (1-5%), o que soluções à base de água
permite a formação de colônias geralmente denominadas
discretas caldos, leites e infusões

Meio de cultura – Agar

• Polissacarídeo complexo;
• Usado como agente solidificante para meios de cultura em placas de Petri, inclinações e fundos;
• Geralmente não metabolizado por micróbios;
• Liquidifica a 98ºC;
• Solidifica a aproximadamente 42ºC;
• Adicionado ao meio de cultura na concentração de 1,2% a 2% para torná-lo sólido.

Como cultivamos micróbios?

• Para cultivar (ou cultura) microrganismos;
• Uma amostra (inoculo) é colocada em caldos (meio líquido – imagem de
cima) e meio sólido (resto das imagens);
• Os microrganismos que crescem a partir de um inóculo são chamados
de cultura;
• Cultura visível em meio sólido como unidades discretas são chamadas
de colônias.

Meio de cultura
• Composição química:
o Meios naturais (empíricos) - por exemplo: sucos, leite, sangue;
o Semi-sintético (meio complexo) – o meio possui componentes naturais (composição
química desconhecida) e determinados nutrientes específicos, por exemplo: soja
tríptica;
o Meio Sintético (meio químico definido) – todos os produtos químicos de composição
conhecida são misturados em proporções definidas (por exemplo, cromocult).
• Meio definido (meio sintético):
o Um meio em que todos os componentes químicos são
conhecidos;
o Meio quimicamente definido composto por
quantidades exatas de produtos químicos puros;
o Usado para experimentos de pesquisa específicos.
• Meio complexo;
o Meio que contém alguns ingredientes de composição
desconhecida;
o São úteis, pois as necessidades nutricionais de um determinado organismo são
desconhecidas e, portanto, um meio definido não pode ser construído;
o Meios complexos contêm componentes não identificados como peptonas, extrato de
carne e extrato de levedura.

Meios de cultura: tipos funcionais

• Meio seletivo – estimula o crescimento de alguns organismos, mas suprime o crescimento de
outros (por exemplo, antibióticos);

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• Meio diferencial - contém um constituinte que causa uma mudança observável (por exemplo,
ágar MacConkey);
• Meio enriquecido – contém nutrientes especiais que permitem o crescimento de um organismo
específico que poderia não estar presente em número suficiente para permitir que seja isolado
e identificado.
Estes três tipos de meios ajudam a estabelecer a presença de patógenos.
Muitos meios seletivos são também meio diferenciais.

Como você sabe quando você tem uma cultura pura?

A abordagem padrão:
1. Após a obtenção de colónias isoladas, as células de algumas colônias devem ser novamente
rastreadas;
2. A cultura é considerada pura se:
A. As colónias são todas
morfologicamente idênticas;
B. As colónias são compostas por um
único morfotipo celular.
Normalmente, se A e B forem satisfeitos, uma colónia
bem isolada pode ser usada para estabelecer uma
cultura pura.

Para melhor caracterizar a cultura/para confirmar:

• Marcadores bioquímicos;
• Marcadores genéticos e moleculares.

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Métodos para isolar bactérias puras

Como eles realmente crescem?

A curva de crescimento em culturas fechadas (cultura de lote)
• Nenhum nutriente é adicionado e a maioria dos resíduos
não é removida;
o Exemplo de uma cultura em lote na natureza –
uma lagoa na qual um pequeno número de células
cresce em um ambiente fechado;
• A densidade da cultura é definida como o número de
células por unidade de volume;
• Em um ambiente fechado, a densidade da cultura também
é uma medida do número de células na população;
• Quando o número de células vivas é plotado em relação ao
tempo, fases distintas podem ser observadas na curva

Lucie Bosquet | UA
Sistema de cultura fechado
• Os nutrientes não são adicionados e os resíduos e as células mortas não são removidos;
• Em muitos casos, é vantajoso manter as células na fase logarítmica de crescimento, tal como nas
indústrias que colhem produtos microbianos.

Cultura contínua
• Um quimiostato é usado para manter uma cultura contínua na qual os nutrientes são
fornecidos em uma taxa constante;
• Uma quantidade controlada de ar é misturada
para processos aeróbicos;
• A suspensão bacteriana é removida na
mesma taxa que os nutrientes fluem para
manter um ambiente ideal.

Um quimiostato (biorreator) é um recipiente de

cultura equipado com uma abertura para adicionar
nutrientes (alimentação) e uma saída para remover o
conteúdo (efluente), diluindo efetivamente os
resíduos tóxicos e as células mortas. A adição e
remoção de fluidos é ajustada para manter a cultura
na fase logarítmica de crescimento. Se bactérias
aeróbicas são cultivadas, os níveis de oxigênio
adequados são mantidos.

Lucie Bosquet | UA