Resumos de Cultura de Células e Tecidos - Parte Animal

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Bárbara Campos e Patrícia Vigário

Licenciatura em Biotecnologia
 Módulo 3
AULA 6
 O que é a cultura de células animais?
• A cultura de células refere-se à remoção de células de um animal e o seu subsequente
crescimento in vitro favorável.
• As células podem ser removidas diretamente do tecido e desagregados por métodos
enzimáticos ou mecânicos antes da cultura - cultura de células primárias
• Ou podem ser derivadas de uma linha celular que já tenha sido estabelecida.
 Linha do tempo: marcos nas culturas celulares

• 1885 – Roux mostra que as células embrionárias de pintinhos podem ser mantidas vivo em
soro fisiológico solução fora do animal corpo.
• 1907 – Harrison cultiva espinal medula anfíbia num coágulo linfático, e portanto
demonstrando que os axónios são produzidos como extensões de células nervosas únicas.
• 1910 – Rous induz um tumor utilizando um extrato filtrado de células tumorais de galinha,
mais tarde comprovado que contém um RNA de vírus (vírus do rous sarcoma).
• 1913 – Carrel introduziu com rigor técnicas assépticas para que as células pudessem ser
cultivadas por longos períodos
• 1943 – Estipulação da célula-L de fibroblasto de rato; primeira linha de células contínua (Eart
et al.)
• 1952 – Gey et al. estabelece uma linha contínua de células derivadas de um carcinoma cervical
humano, que mais tarde se tornar a conhecido HeLa (Helen Lane) linha de células.
• 1954 – Levi-Montalcini et al. Mostra que o fator de crescimento nervoso (NGF) estimula o
crescimento de axónios em cultura de tecidos.
• 1955 – Eagle estudou os nutrientes necessários para as células selecionadas em cultura e
estabeleceu o primeiro meio quimicamente definido, largamente utilizado.
• 1961 – Hayflick e Moorhead mostram que os fibroblastos humanos morrem após um número
finito de divisões na cultura.
• 1965 – Ham introduz um meio definido sem soro capaz de suportar o crescimento clonal de
certas células de mamíferos.
• 1975 – Kohler e Milstein produzem o primeiro hibridoma capaz de secretar um anticorpo
monoclonal
• 1976 – Sato et al. mostra que as diferentes linhas celulares exigem diferentes misturas de
hormonas e fatores de crescimento em meio sem soro para crescerem.
• 1976 – Totipotência de células estaminais embrionárias (Illmensee & Mintz)
• 1980-87 – Desenvolvimento de muitas linhas celulares especializadas
• 1991 – Cultura de mesenquimais de células estaminais do Homem adulto (Caplan)
• 1998 – Cultura de mesenquimais de células estaminais do Homem adulto (Thomson et al.)
• 2002 – Exploração da engenharia de tecido (Atala & Lanza)
• 2007 – Reprogramação de células adultas para se tornarem células estaminais pluripotentes
(Yu et al)
Descarregado por Rita Esteves (ryta.2403@gmail.com)

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 O que são os 3Rs?

• Os princípios dos 3R fornecem um enquadramento para o desempenho de uma investigação
animal mais humana.
• Os princípios dos 3Rs têm sido incorporados em sistemas nacionais e legislações
internacionais e regulamentos relativos à utilização de animais em procedimentos científicos,
bem como nas políticas de organizações que financiam ou realizar investigação animal.
• Os princípios dos 3R foram propostos pela primeira vez em 1959 e mantêm-se para:
 Substituição - Evitar ou substituir a utilização de animais; por exemplo, utilização de
culturas celulares, modelos informáticos, ou tecidos humanos ou voluntários.
 Redução - Quando for necessária a utilização de animais, reduzir ao mínimo os números;
por exemplo utilização de métodos estatísticos para determinar o menor número de
animais que podem ser utilizados numa experiência.
 Refinamento - Quando a utilização de animais é necessário, minimizando a dor e o
sofrimento e melhorar o bem-estar; por exemplo, utilizar o alívio da dor e proporcionar
uma habitação que permite que os animais desempenhem os seus comportamentos
naturais.
 Substituição
• Tecnologias ou abordagens que substituam diretamente ou evitem a utilização de animais em
experiências em que de outra forma teriam sido utilizados.
• Substituição total:
 Evita a utilização de quaisquer animais de investigação.
 Inclui a utilização de voluntários humanos, tecidos e células, matemáticas e modelos
informáticos e linhas de células estabelecidas.
• Substituição parcial:
 Inclui a utilização de alguns animais que, com base no pensamento científico atual, não
são considerados capazes de sentir sofrimento.
 Isto inclui invertebrados como Drosophila, Nemátodos e Amebóide, e formas imaturas de
vertebrados.
 Inclui também a utilização de células (e tecidos) primárias retiradas de animais abatidos
exclusivamente para este fim (ou seja, não ter sido utilizado num procedimento científico
que causa sofrimento).
• Alternativas:
 Substituições relativas, que substituem a utilização de animais "protegidos” com outras
espécies, por exemplo, Invertebrados, formas larvares de anfíbios e peixes até à fase em
que se tornem capazes de alimentação
• Substituição absoluta: técnicas que não envolvem animais em qualquer ponto, tais como:
 Sistemas de bases de dados de computadores
 Metodologias in vitro (por exemplo, engenharia de tecidos; culturas de células, tecidos e
órgãos)
 Utilização de voluntários humanos.

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 Redução
• Métodos que minimizem o número de animais utilizados por experiência ou estudo coerente
com os objetivos científicos. É essencial para a redução que os estudos com animais sejam
adequadamente concebidos e analisados para assegurar conclusões sólidas e reprodutíveis.
• Métodos que permitem recolher a informação por animal numa experiência a ser maximizada
a fim de reduzir a utilização de animais.
• Partilha de dados e recursos (por exemplo, animais, tecidos e equipamento) entre grupos e
organizações de investigação também podem contribuir para redução.
 Refinamento
• Métodos que minimizem a dor, o sofrimento, a angústia ou os danos duradouros que possam
ser experimentados pelos animais de investigação, e que melhoram o seu bem-estar.
• O refinamento aplica-se a todos os aspetos da utilização dos animais, desde o seu alojamento
e o de animais para os procedimentos científicos neles realizados.
• Exemplos:
 Assegurar que os animais disponham de alojamento que permita a expressão de
comportamentos específicos de cada espécie,
 Utilizando anestesia e analgesia adequadas para minimizar a dor
 Treino dos animais para cooperarem com procedimentos destinados a minimizar
qualquer aflição.
• As provas sugerem que a dor e o sofrimento podem alterar o comportamento de um animal,

fisiologia e imunologia. Tais alterações podem levar a variações em resultados experimentais
que prejudicam tanto a fiabilidade como a repetibilidade dos estudos.
 Os "Três Rs" na EU - quadro legislativo

• 1986: Primeira legislação da UE para a proteção dos animais utilizados para foi adotada uma
abordagem experimental e outros fins científicos.
• Diretiva 2010/63/UE relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos pela
primeira vez na legislação da UE, é enunciado o princípio de os "Três Rs" e torna-o uma
exigência jurídica firme.
• Os princípios dos "3R" devem ser considerados sistematicamente.
• O termo "fins científicos" abrange todas as utilizações dos animais para efeitos de investigação
fundamental, tradução e investigação aplicada, ensaios regulamentares e produção bem
como para efeitos de educação e formação.
• A diretiva alarga a Refinação de modo a abranger todos os animais durante alojamento,
reprodução e cuidados mesmo que o animal não esteja a ser submetido a um procedimento
científico.

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 Quais são as alternativas aproxima-se?

• O termo "alternativas" neste contexto inclui todos os ensaios, testes, métodos, técnicas,
instrumentos, estratégias e abordagens, etc., que contribuem para a aplicação prática dos
"3R". Ou seja:
 Para obter as informações necessárias sem a utilização de animais vivos;
 Para reduzir o número de animais, obtendo simultaneamente o mesmo nível de
informação;
 Para refinar a utilização de animais vivos de modo a causar menos dor, angústia ou
sofrimento, ou melhorar o bem-estar dos animais.
• As abordagens alternativas oferecem oportunidades para fazer avançar os "3R", mas
visam igualmente desenvolver instrumentos científicos melhores e mais preditivos para
proteger a saúde humana e animal e o ambiente.
 Legislação aplicável em Portugal

• Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do conselho de 22 de Setembro de 2010,
relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos
• Decreto-Lei n.º 113/2013 - Diário da República n.º 151/2013, Série I de 2013-08-07; Transpõe
a Diretiva n.º 2010/63/UE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010,
relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos
• Despacho n.º 2880/2015 - Diário da República n.º 56/2015, Série II de 2015-03-20 66810377,
Ministério da Agricultura e do Mar - Direção-Geral de Alimentação e Veterinária; Constituição
do órgão responsável pelo bem-estar dos animais a que se refere o n.º 4 do artigo 34.º do
Decreto-Lei n.º 113/2013, de 7 de agosto
• DL nº 113 / 2013 - “Os cuidados a prestar aos animais e a sua utilização para fins científicos
regem-se pelos princípios da substituição, da redução e do refinamento, genericamente
designados «3Rs», pelo que o presente decreto-lei dá execução a estes princípios,
nomeadamente no tocante à escolha dos métodos que deverão ser aplicados, conferindo
preferência à utilização de métodos alternativos.”
 “Os animais têm um valor intrínseco, que deve ser respeitado, e a sua utilização em
procedimentos suscita preocupações éticas, pelo que devem ser tratados como criaturas
sencientes. A sua utilização em procedimentos deve ser limitada aos domínios em que
essa utilização proporcione benefícios para a saúde humana ou animal, ou para o
ambiente.” “... A utilização de animais para fins científicos ou educativos apenas deve ser
considerada quando não existir uma alternativa não animal.” “... Deve ser selecionado um
método suscetível de proporcionar resultados satisfatórios e de provocar o mínimo de
dor, sofrimento ou angústia ao animal.”
 “... É estabelecida uma classificação da severidade dos procedimentos com base nos níveis
estimados de dor, sofrimento, angústia e dano duradouro infligidos aos animais.” “De um
ponto de vista ético, é fixado um limite máximo de dor, de sofrimento e de angústia a
partir do qual os animais não podem ser submetidos a procedimentos científicos, sendo
proibida a realização de procedimentos severos que causem dor, sofrimento ou angústia,
suscetíveis de serem prolongados e sem possibilidade de serem aliviados.” “Importa,
também, assegurar que a utilização de animais em procedimentos não constitui uma
ameaça para a biodiversidade e que, em consonância, a utilização de espécies ameaçadas
de extinção seja limitada ao mínimo indispensável.“

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 Aplicações das culturas celulares:

• Estudos básicos sobre celular metabolismo:
1. ACTIVIDADE INTRACELULAR: Transcrição de ADN, síntese de proteínas, metabolismo
energético, metabolismo de drogas, ciclo celular, diferenciação, apoptose
2. FLUXO INTRACELULAR: Processamento de ARN, recetores hormonais, fluxo metabólico,
mobilização de cálcio, transdução de sinal, membrana tráfico de seres humanos
3. GENÓMICA: Análise genética, transfeção, infeção, transformação, Imortalização,
senescência
 Análise genética, transfeção, infeção, transformação, Imortalização, senescência
4. PROTEÓMICA: Produtos genéticos, fenótipo celular, vias metabólicas
5. INTERACÇÃO CÉLULA/CÉLULA: Morfogénese, controlo parácrino, proliferação celular,
cinética, metabólica cooperação, aderência e motilidade celular, interação matricial,
invasão
• Estudos aplicados:
1. PRODUTOS CELULARES: Biotecnologia, conceção de biorreatores, colheita de produtos, a
jusante transformação
2. IMUNOLOGIA: Epítopos de superfície celular, hibridomas, citocinas e sinalização,
inflamação
3. FARMACOLOGIA: Ação da droga, interações entre ligantes e recetores, metabolismo da
droga, resistência às drogas
4. ENGENHARIA DE TECIDOS: Construções de tecidos, matrizes e andaimes, células-tronco
fonte, propagação, diferenciação
5. TÓXICOLOGIA: Infeção, citotoxicidade, mutagénese, carcinogénese, irritação, inflamação
 CULTURAS DE TECIDOS:
• Vantagens:
 Controlo do Ambiente
→ Controlo do pH, temperatura, osmolalidade, gases dissolvidos
→ Controlo das concentrações de hormonas e nutrientes
→ Regulação da matriz, interação célula/células, difusão gasosa
 Caracterização e Homogeneidade das Amostras
→ Disponibilidade de meios seletivos; clonagem de células
→ Citologia fácil de realizar, perfil de ADN, imunoglobulina
→ Stocks armazenados em azoto líquido
→ Origem, história, pureza autenticada e registada
→ Fácil quantificação e análise estatística mínima
 Economia, Escala e Mecanização
→ Capacidade de definir dose, concentração, Tempo
→ Disponível com microtitulação e robótica
→ O número de réplicas pode ser substancialmente aumentado
→ Tempo de ensaio reduzido, pelo menos, por ordem de magnitude
 Modelação in vitro de condições in vivo
→ Redução da utilização animal
→ Citotoxicidade e rastreio de produtos farmacêuticos, cosméticos, etc.

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• Desvantagens:
 Conhecimento necessário
→ Perícia necessária
→ Manuseamento esterilizado
→ Prevenção de contaminação química
→ Deteção de contaminação microbiana
→ Sensibilização e deteção de erros de identificação
 Controlo ambiental
→ Isolamento e limpeza do local de trabalho
→ Incubação, controlo de pH
→ Confinamento e eliminação de riscos biológicos
 Quantidade e custo
→ Equipamento de capital para expansão
→ Meio, soro
→ Plásticos descartáveis
 Instabilidade genética e fenotípica; Identificação do tipo de célula
→ Heterogeneidade, variabilidade
→ Desdiferenciação
→ Adaptação
→ Sobrecrescimento seletivo
→ Marcadores nem sempre expressos
→ Histologia difícil de recriar e atípica
→ Geometria e alterações microambientais
→ Citologia de alterações geométricas
 Tipos de cultura de tecidos:

1. Cultura de órgãos
2. Cultura explant
3. CULTURA CELULAR DISSOCIADA
4. CULTURA ORGANOTÍPICA
 Propriedades de Diferentes Tipos de Cultura
Cultura de órgãos Explant Cultura de células Cultura organotípica

Desagregado
Órgãos embrionários, tecido Órgãos tecido, cultura Cultura primária ou
Fonte
adulto fragmentos embrionários primária, célula linhas celulares
propagada linha
Bioquímica, Histologia, confocal
Cultura primária ou linhas Citologia e molecular, microscopia, ou imagens
Caracterização
celulares marcadores imunológicos, e de ressonância
citológicos ensaios magnética
Possível a
Procedimento
Propagação Não é possível partir de Só depois de dissociação
normal
ultrapassagem
Alta Baixa interamostra
Reprodutibilida Baixa interamostra
Alta interamostra interamostra Variação / Fácil;
de Variação / Maio exigir
Variação / Difícil Variação / disponível em
Quantificação imagem análise
Difícil muitas técnicas

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 O que é a Cultura Célula Primária?

• A cultura de células primárias é a dissociação das células de um tecido animal parental através
de enzimas ou mecânicas medidas e mantendo o crescimento de células num substrato
adequado em recipientes de vidro ou plástico sob condições ambientais controladas.
• As células na cultura primária têm o mesmo cariótipo (número e aparecimento de
cromossomas no núcleo de uma eucariose células) como as células do tecido original.
• As células derivadas de culturas primárias têm um tempo de vida limitado.
 O aumento do número de células na cultura primária conduzirá ao esgotamento de
substrato e nutrientes.
 A atividade celular aumentará gradualmente o nível de metabolitos tóxicos em a cultura
que inibe o crescimento de células.
• Nesta fase, é necessário realizar uma cultura secundária ou uma subcultura para assegurar o
crescimento contínuo das células.
 INÍCIO DE UMA CULTURA CELULAR
 Recursos comuns de desagregação
1. Tecidos necróticos e gordurosos são melhor removidos durante a dissecção.

2. O tecido deve ser picado finamente com bisturis afiados para causar danos mínimos.
3. As enzimas usadas para desagregação devem ser removidas posteriormente por
centrifugação suave.
4. A concentração de células na cultura primária deve ser muito maior do que a normalmente
usada subcultura, porque a proporção de células do tecido que sobrevive na primária a cultura
pode ser bastante baixa.
5. Um meio rico é preferível a um meio simples e, se for necessário soro, o bovino fetal
geralmente oferece uma melhor sobrevivência do que o bezerro ou o cavalo. O isolamento de
tipos específicos de células provavelmente exigirá meios seletivos livres de soro.
6. O tecido embrionário se desagrega mais rapidamente, produz mais células viável e prolifera
mais rapidamente na cultura primária do que faz tecido adulto.

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 TIPOS DE CULTURA PRIMÁRIA

• Várias técnicas foram desenvolvidas para a desagregação de tecido isolado para cultura
primária.
• Explantes primários são adequados para quantidades muito pequenas de tecido
A. Técnicas puramente mecânicas, envolvendo dissecção com ou sem alguma forma de
maceração: a desagregação mecânica funciona bem com tecidos moles e alguns tecidos
mais firmes quando o tamanho do rendimento viável não é importante ou quando células
fracamente aderentes são removidas de um estroma mais fibroso.
B. Técnicas utilizando desagregação enzimática: a desagregação enzimática fornece um
rendimento melhor quando há mais tecido disponível

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 CULTURA PRIMÁRIA DE EXPLANTES
 Desagregação enzimática:
1. A adesão célula-célula nos tecidos é mediada por um variedade de homotípicos glicopéptidos
que interagem (moléculas de adesão celular ou CAMs), alguns dos quais são dependentes de
cálcio (caderinas) e, portanto, são sensíveis aos agentes quelantes (EDTA ou EGTA).
2. As integrinas, que se ligam ao motivo arginina-glicina-aspártico (RGD) na matriz extracelular,
também apresentam Ca 2 + - domínios de ligação e são afetados por Ca 2+ esgotamento.
3. A matriz intercelular e as membranas basais contêm outras glicoproteínas, como fibronectina
e laminina, que são sensíveis à protease, e proteoglicanos, que são menos, mas às vezes
podem ser degradados por glicanases como hialuronidase ou heparinase.

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 Enzimas usadas na desagregação
• A escolha de qual grau de tripsina sempre foi difícil usar, pois existem duas tendências
opostas:
1. Mais pura a tripsina, menos tóxico se torna e mais previsível é sua ação
2. O cruder a tripsina, quanto mais eficaz, devido à presença de outras proteases.
NOTA: Na prática, pode ser necessário um experimento de teste preliminar para determinar o grau
ideal para o rendimento celular viável, pois pode ser difícil prever o equilíbrio entre a sensibilidade a
efeitos tóxicos e a capacidade de desagregação.
NOTA: A tripsina bruta é de longe a enzima mais comum usada na desagregação tecidual
Desagregação a quente da tripsina Desagregação a frio por tripsina
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AULA 7
 Linha celular
• Linha celular é a progênie de uma cultura primária quando é subcultivada.
• Linha cellular:
 Finito: senescência após 30-50 ciclos de divisão, dependendo sobre a origem das células
(Limite de Hayflick - telómero Encurtando)
 Contínuo: pode ser propagado indefinidamente
 Limite de Hayflick - Papel dos telómeros na senescência celular
 Telómeros - são estruturas especiais nas extremidades dos cromossomos de mamíferos que
'cobrem' os cromossomos e fornecem uma função protetora, como impedir fusões
cromossômicas de ponta a ponta.
 Linhas celulares
• As linhas celulares podem tornar-se espontaneamente imortais (células tumorais) ou podem
ser transformadas quimicamente ou viralmente.
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 O que é transformação?
• - Em microbiologia, transformação implica uma mudança no fenótipo que depende da
captação de novo material genético.
• - Nas células de mamíferos, é chamado transfeção ou transferência de DNA neste caso, para
distingui-lo de transformação.
• Transformação está associada a instabilidade genética e três grandes classes de mudanças
fenotípicas:
 Imortalização
 Controlo de crescimento aberrante
 Tumorigenicidade
NOTA: um ou todos os quais podem ser expressos em uma linha celular
• A aquisição de uma vida infinita sozinho é referido como imortalização porque isso pode ser
alcançado sem controlo de crescimento e malignidade totalmente aberrante, que geralmente
estão ligados.
 Imortalização - Transfeção do gene da telomerase com um promotor regulável é suficiente para

imortalizar as células.
• Ciclo de crescimento de células cultivadas é representado por três fases:

 A fase de atraso: Estágio preparatório das células para proliferação após subcultura e
nova semeadura
→ A célula forma a superfície celular e a matriz extracelular (perdida durante a
tripsinização); anexa ao substrato e se espalha.
→ Aumento da síntese de certas enzimas (por exemplo, DNA polimerase) e proteínas
estruturais, preparando as células para a proliferação.
 A fase do log: é caracterizada por um crescimento exponencial de células
→ A duração da fase do log depende de densidade de semeadura e taxa de crescimento.
→ As células cultivadas estão em o estado mais uniforme e reproduzível com alta
viabilidade.
→ Este é um momento ideal para amostragem.
→ A fase do log termina após confluência é atingido.
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 Projeto de Laboratório, e equipamento

• Projeto, Layout e Equipamento de Laboratório - O que distingue um laboratório de cultura de
células de todos os outros?
• Exigências:
 Número de usuários
 Espaço
 Despesas
 Armazenamento
 Acesso
 Contenção e esterilidade
• Serviços:
 Água quente e fria
 Poder
 Gás combustível (metano doméstico, propano, etc)
 Dióxido de carbon
 Ar comprimido
• Layout:
 Manuseio estéril
 Incubação
 Preparação
 Lavagem
 Armazenamento
 Esterilização
• Instalações de cultura de tecidos
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• Ventilação:
 Pressão positiva (para evitar qualquer influxo de ar contaminado do lado de fora)
 Dutos de fluxo laminar para o exterior para melhorar a circulação de ar e remover o
excesso de calor da sala
 Exaustores de fluxo laminar deixados para funcionar continuamente
• Fluxo laminar:
 A introdução de coifas de fluxo laminar com ar estéril soprado na superfície de trabalho
proporciona maior controle da esterilidade a um custo menor do que fornecer uma sala
estéril separada.
 Capuzes independentes são preferíveis
 Selecione capuzes que atendam às suas acomodações
• Banco de serviço Posicione a banco de serviço para:

 Contador de células, microscópio e outros instrumentos críticos, perto da área de
manipulação estéril
 Armazenamento de artigos de vidro estéreis, plásticos, pipetas, tampas de rosca e
seringas
 Outro equipamento acessório (por exemplo, centrífuga)
 Deve ser facilmente acessível
• Armazenamento:
 Estéril e não estéril são mantidos separados e claramente rotulados
 Nitrogénio líquido para reabastecer congeladores; o nitrogénio líquido deve ser
armazenado de duas maneiras: (1) em Dewars (25-50 L) sob o banco (2) em um grande
recipiente de armazenamento (100-150 L) em um carrinho ou em tanques de
armazenamento (500-1000 L) permanentemente situados em uma sala própria com
ventilação adequada ou, preferencialmente, ao ar livre em um compartimento seguro e à
prova de intempéries.
 Armazenamento de cilindros para dióxido de carbono, em cilindros separados para
transferência para o laboratório, conforme necessário. Os cilindros devem estar presos à
parede ou bancada em um rack.
• Equipamentos e Materiais:
 ESSENCIAL: você não pode realizar a cultura de tecidos de maneira confiável sem este
equipamento
 BENÉFICO: cultura seria melhor, mais eficientemente, mais rápido ou com mais menos
trabalho
 ÚTIL: itens que melhoram as condições de trabalho, reduzem a fadiga, permitem análises
mais sofisticadas ou geralmente Torne seu ambiente de trabalho mais atraente
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• Equipamento essencial:
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• Equipamento:
 Armários de segurança biológica

 Fluxo laminar Gabinete
 Segurança Biológica Armários
• Princípio de um fluxo laminar Gabinete - Esterilize o ar através do filtro e sopre-o pela superfície
de trabalho como um fluxo de ar laminar livre de partículas
• Objetivo de um laminar Gabinete de fluxo - Proteção do produto contra contaminantes do
ambiente (não protege o operador)
• Princípio da segurança biológica Armários - Crie entradas para proteger o operador através da
exaustão do ar do gabinete através do HEPA filtro
• Objetivo da segurança biológica Armários - Proteção do operador contra microrganismos. A
maioria dos BSC também oferece proteção ao produto contra contaminantes da sala
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• Capela de fluxo horizontal:

 Mais barato
 Proteção para culturas (se o ar estiver fluindo em direção ao usuário) ou para o usuário (se
o ar for aspirado pela parte frontal do gabinete pela pressão negativa do ar no interior).
 Adequado para a preparação de meio (sem antibióticos) e outros reagentes estéreis não
tóxicos
 Adequado para dissecar material não-primitivo para culturas primárias
• Capelas de fluxo verticais:

 Forneça proteção significativa ao usuário e à cultura de células
• Classe II BSC - Básico:

 Proteção do operador e do produto
 Nível de biossegurança 1, 2, 3
 Afluxo do operador
 Escape filtrado HEPA para o ambiente
 Downflow laminar filtrado HEPA
 Se você usar produtos químicos tóxicos voláteis (vaporizadores) na cultura de células,
precisará de CO2 húmido Incubadora
• A cultura celular requer uma atmosfera controlada com alta umidade e CO2 elevado tensão.
Incubadoras (fornecem condições de crescimento corretas e estáveis)
 Temperatura:
→ 15 ° - 26 ° C para animais de sangue frio (por exemplo, anfíbios, linhas de
células de peixes de água fria)
→ 27 - 30ºC para linhas celulares de insetos;
→ 36 - 37ºC para linhas celulares de mamíferos.
→ % Humidade relativa (RH) alta
→ CO 2 níveis: 5% (geralmente) - 10%
NOTA: Algumas incubadoras também têm a facilidade de controlar o O2 níveis
 Microscópio invertido
• Um simples microscópio invertido é essencial
• É vital observar as culturas regularmente para detetar alterações morfológicas e a
possibilidade de contaminação microbiológica
• Lâmina de hemocitómetro:
 A opção mais barata para contagem de células e tem o benefício adicional de permitir
que a viabilidade celular seja determinada por exclusão de corante
 O contador de células automatizado é uma grande vantagem...
• Esterilizador a vapor (autoclave): É necessária a autoclave de todos os materiais e reagentes
que entram em contato com as células
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• Centrífugas:
 Centrífugas são usadas rotineiramente na cultura de tecidos como parte da rotina de
subcultura para a maioria das linhas celulares e para a preparação de células para
criopreservação.
 Uma pequena centrífuga de bancada com frenagem controlada é suficiente para a
maioria dos propósitos.
 As células sedimentam satisfatoriamente a 80-150 xg.
 Forças gravitacionais mais altas podem causar danos e promover aglutinação do
sedimento celular.
 Consumíveis
• Itens:
 Pipetas
 Frascos de cultura
 Placas de Petri
 Placas Multiwell (4, 6, 12, 24, 96 poços)
 Recipientes estéreis (vasos de amostra, universais, bijuteria, tubos de centrifugação, bidão
de vidro ou plástico, frascos criogênicos)
 Seringas
 Filtros (ponta da seringa, topo de garrafa ou frascos)
 Desinfetantes: álcool isopropílico ou etanol a 70%, hipoclorito de Na
 Mídia e suplementos
 Embarcações de cultura e substratos

• Substratos:
 Vidro
 Plástico (descartável)
 Cloreto de polivinil (PVC)
 Policarbonato
 Politetrafluoretileno (PTFE; Teflon)
 Melinex
 Thermanox (TPX)
 Poli (metacrilato de metilo) (PMMA; acrílico, acrílico, lucite)
 Poliestireno (PS):
→ Mais barato
→ Excelente clareza ótica
→ Fácil de moldar
→ Pode ser esterilizado por irradiação
→ Polímero muito hidrofóbico para quais células têm dificuldade em anexar
(desvantagem)
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 Substratos
• A ligação e o crescimento das células podem ser melhorados pré-tratamento do substrato
 A superfície de poliestireno recém-moldada é tratada usando-se descarga de coroa em
condições atmosféricas ou plasma de gás sob vácuo.
 Esses processos geram iões de oxigênio altamente energéticos que oxidam e enxertam
nas cadeias superficiais de poliestireno para que a superfície se torna hidrofílica e
carregada negativamente quando o meio é adicionado
• Revestimento de substrato com:

 Materiais biológicos, incluindo:
 Matriz extracelular
 Proteínas de fixação e adesão (colagénio, laminina e fibronectina)
 Mucopolissacarídeos (sulfato de heparina, hialuronidato e sulfato de condroitina)
individualmente e como misturas.
 Matrizes disponíveis comercialmente
• Revestimento de substrato com:

 Polímeros sintéticos:
 Ambos os polímeros de D- e L-lisina são utilizados para revestir lâminas para promover
a fixação das células.
 A poli-lisina melhora a interação eletrostática entre os iões de carga negativa da
membrana celular e os iões de superfície carregados positivamente dos fatores de
fixação na superfície da cultura. Quando adsorvido à superfície da cultura, aumenta o
número de locais com carga positiva disponíveis para ligação celular
 Embarcações de cultura e substratos

• Vários fatores governam a escolha dos vasos de cultura:
1. Se as células crescem em suspensão ou em monocamada
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 Embarcações de cultura:
→ Garrafas
→ Placas multiwelll
→ Placas de Petri
→ Multi frascos
→ Garrafas de agitador
 Cultura de suspensão
→ Pode ser cultivada em qualquer tipo de frasco, prato ou placa de Petri que, apesar de
estéril, não precise ser tratada para fixação das células.
→ Garrafas agitadoras são usadas quando é necessária agitação para manter as células
em suspensão. - A agitação geralmente é feita por um remo suspenso acionado pelo
topo ou por um pêndulo contendo um ímã, cuja rotação é acionada por um agitador
magnético.
→ A velocidade de rotação deve ser mantida baixa, em torno de 60 rpm, para evitar
danos causados por tensão de cisalhamento.
 Cultura aderente:
→ Placas Multiwell
→ Placas de Petri
→ Garrafas
2. Massa celular necessária

3. Frequência de amostragem
4. Tipo de análise necessário
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• O rendimento celular (para culturas de monocamada) é proporcional à área de superfície

disponível - Placas Multiwell: pequenos volumes e várias repetições são melhores
realizadas em grande número de poços pequenos (por exemplo, 96 ou 144 poços, 0,1-0,2
mL ou 24 poços, 1-2 mL ou 4 poços, 5 cm de diâmetro)
 Placas de Petri: por diâmetro (por exemplo, 3,5 cm ou 9 cm); por área (8 a 49 cm 2)
 Frascos: por área de superfície (por exemplo, 10 ou 225 cm 2)
• Amostragem:
 As placas Multiwell são ideais para culturas replicadas
 Todas as amostras devem ser removidas simultaneamente
 Processado da mesma maneira
 Vasos separados
 Para amostras precisam ser retiradas em momentos diferentes Análise (observação
microscópica de baixa potência)
 Microscópio invertido
 Bom com frascos, placas de Petri ou placas com vários poços
5. Se a cultura é ventilada para a atmosfera ou selada

• Ventilação:
 Multi-poços e placas de Petri não totalmente selado (tampas largas)
 Requer atmosfera húmida
 Com CO2 controlado concentrações
 Precisa estar ciente do acúmulo de humidade na parte superior
 Tampas de frascos com filtros permeáveis que permitem o equilíbrio com a fase
gasosa, pois permitem o CO 2 difusão sem risco de contaminação
6. Custo
• Sempre tem que ser equilibrado contra conveniência;
• Por exemplo:
 Placas de Petri são mais baratos que frascos com uma superfície equivalente, mas
requerem umidade, CO2 condições controladas e são mais propensas a infeções.
 Eles são, no entanto, mais fáceis de examinar e processo.
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AULA 8
 Técnica asséptica
• A essência da boa técnica asséptica incorpora muitos dos princípios do padrão de boa prática
laboratorial.
• Técnica asséptica, projetada para fornecer uma barreira entre os microrganismos no meio
ambiente e os de cultura celular estéril, depende de um conjunto de procedimentos para
reduzir a probabilidade de contaminação por esses fontes.
• Elementos da técnica asséptica

1. Área de trabalho estéril
2. Reagentes e meios estéreis
3. Boa higiene pessoal
4. Tratamento estéril
1. Área de trabalho estéril

 O exaustor de cultura celular deve ser configurado corretamente e deve estar
localizado numa área restrita à cultura celular livre de correntes de ar, janelas e outros
equipamentos e sem tráfego.
 A superfície de trabalho deve estar organizada e conter apenas os objetos necessários
para um procedimento específico; não deve ser usado como uma área de
armazenamento.
 Antes e após o uso, a superfície de trabalho deve ser desinfetada cuidadosamente, e
as áreas e equipamentos ao redor devem ser limpos rotineiramente.
 Para limpeza de rotina, limpe a superfície de trabalho com etanol a 70% antes e
durante o trabalho, especialmente após qualquer derramamento.
 Usar luz ultravioleta para esterilizar o ar e as superfícies de trabalho expostas na hotte
celular entre usos.
 Usar um bico de Bunsen para queimar não é necessário nem é recomendado numa
hotte.
 Deixar o exaustor de cultura de células sempre a funcionar, desligando-o apenas
quando ele for usado por longos períodos de tempo.
2. Reagentes e meios estéreis

 Reagentes e meios estéreis sofrem um controle restrito de qualidade para garantir a
sua esterilidade, mas eles podem tornar-se contaminados durante o manuseio.
 Esterilizar sempre todos os reagentes, meios ou soluções preparados em laboratório
usando as procedimento de esterilização (por exemplo, autoclave, filtro estéril).
3. Boa higiene pessoal

 Lavar as mãos antes e depois de trabalhar com culturas de células.
 Além de proteger-te contra riscos materiais, ao usar equipamento de proteção
individual também reduz a probabilidade de contaminação da pele, assim como a
sujidade e a poeira das tuas roupas.
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4. Tratamento estéril
 Sempre limpe suas mãos e sua área de trabalho com etanol a 70%.
 Limpe a parte externa dos recipientes, frascos, pratos e pratos com etanol a 70% antes
de colocá-los no exaustor de cultura de células.
 Evite derramar mídia e reagentes diretamente de garrafas ou frascos.
 Use vidro estéril ou pipetas descartáveis de plástico e um pipetador para trabalhar
com líquidos e use cada pipeta apenas uma vez para evitar contaminação cruzada.
Não desembrulhe as pipetas estéreis até que elas sejam usadas. Mantenha as suas
pipetas na sua área de trabalho.
 Sempre tampe os frascos e frascos após o uso e sele as placas de vários poços com
fita adesiva ou coloque-as em sacos que podem ser fechados novamente para evitar
que microorganismos e contaminantes transportados pelo ar entrem.
 Nunca descubra um balão estéril, garrafa, placa de Petri etc. até que instante em que
você estiver pronto para usá-lo e nunca o deixe aberto para o meio ambiente. Retorne
a tampa assim que terminar.
 Se você remover uma tampa ou tampa e precisar colocá-la sobre a superfície de
trabalho, coloque a tampa com a abertura voltada para baixo.
 Use apenas material de vidro estéril e outros equipamentos.
 Cuidado para não falar, cantar ou assobiar ao executar procedimentos estéreis.
 Realize seus experimentos o mais rápido possível para minimizar a contaminação.
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 Suportes e suplementos definidos

 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
 pH
→ A maioria das linhas celulares cresce bem em pH 7,4
→ Vermelho de fenol é comumente usado como um indicador:
→ HCO 3− tem uma constante de dissociação razoavelmente baixa com a maioria dos
catiões disponíveis, portanto tende a reassociar, deixando o ácido médio.
→ O resultado líquido do aumento do CO atmosférico 2 é diminuir o pH
→ O efeito do CO elevado 2 a tensão pode ser neutralizada aumentando a concentração
de bicarbonato.
 Propriedades fisico-quimicas – relação
→ Gases dissolvidos e se 5% de CO 2 aumentar para 10%?

o pH cai de 7,4 para 7,2
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 CO2 e bicarbonatos
→ Num sistema tampão natural, o CO gasoso 2 saldos com o CO 3 / HCO 3 conteúdo do meio
de cultura.
→ As culturas com um sistema de proteção natural precisam ser mantidas em uma
atmosfera de ar com 5-10% de CO2
→ O sistema de tamponamento natural é de baixo custo e não é tóxico
 Carregando
→ Os meios de cultura devem ser armazenados em buffer sob dois conjuntos de condições:
1. Pratos abertos, onde a evolução do CO 2 causa o aumento do pH;
2. Superprodução de CO2 e ácido lático em linhas celulares transformadas em altas
concentrações celulares, quando o pH cairá.
→ Tampão de bicarbonato
o Baixa toxicidade
o Baixo custo
o Benefício nutricional para a cultura
o Baixa capacidade de buffer
→ HEPES ( 10 a 20 mM)
o Tampão forte na faixa de pH 7,2 a 7,6
o Não requer uma atmosfera gasosa controlada (regula o pH independente do CO2
concentração)
o Relativamente caro
o Tóxico em uma concentração mais alta para alguns tipos de células.
 Temperatura
→ Efeito direto no crescimento cellular
o 37 ºC para células de mamíferos
o 38,5 ºC para crescimento máximo de células de aves
o 15 ºC a 26 ºC para animais de sangue frio (não regulam o calor do sangue dentro de
limites estreitos) toleram uma ampla faixa de temperatura
→ Influenciar o pH devido ao aumento da solubilidade do CO 2 a temperaturas mais baixas
e, possivelmente, devido a alterações na ionização e no pKa do buffer.
 Viscosidade
→ É influenciado principalmente pelo conteúdo sérico
→ Tem pouco efeito no crescimento cellular
→ É importante sempre que uma suspensão celular é agitada
→ quando as células são dissociadas após tripsinização
→ em culturas agitadas de biorreatores
→ Particularmente importante em concentrações séricas baixas ou na ausência de soro.
 SOLUÇÕES DE SAL EQUILÍBRIO (BSS)

• Composto por sais inorgânicos (Na, K, Ca, Mg) e pode incluir Bicarbonato de Sódio e glicose.
• Fornece integridade estrutural e fisiológica, mantém pH fisiológico e pressão osmótica
• O tampão HEPES (5–20 mM) pode ser adicionado a essas soluções se necessário e a quantidade
equivalente de NaCl omitida para manter a osmolaridade correta.
• Usado:
 Como diluente para concentrados de aminoácidos e vitaminas para fazer o meio completo.
 Como um meio de lavagem ou dissecção isotónico.
 Para incubações curtas até cerca de 4h (geralmente com glicose presente).
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• BSS mais comum:

 Solução salina equilibrada de Earle (EBSS)
 Solução de sal equilibrada de Hanks (HBSS)
 Solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS)
 Solução de sal equilibrada da Ringer (RBSS)
 Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
• Como o BSS funciona:

 Na e K regular a tonicidade e a permeabilidade.
 Ca e Mg manter a integridade das membranas celulares e estruturas internas.
 Fosfato (HPO 4- H 3 PO 4) e/ou bicarbonato (HCO3) controlar a concentração de íons
hidrogênio através de seu efeito tampão.
 Glicose (se presente) fornece uma energia prontamente disponível fonte para células.
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 MEIOS
• Meio Essencial Mínimo da Eagle (MEM)

 Contém apenas 12 tipos de animoácidos não essenciais, glutamina, 8 vitaminas e alguns sais
inorgânicos básicos.
• Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)
 Uma variação do MEM contém aproximadamente 4x mais vitaminas e aminoácidos e 2x a
4x mais glicose que MEM.
 Além disso, contém ferro e vermelho de fenol.
 Tipo de alta glicose (4500g / L de glicose) e tipo de baixa glicose (1000 g / L de glicose).
 O DMEM com alta glicose é adequado para algumas células tumorais com maior velocidade
de crescimento e fixação difícil, pois é benéfico reter e crescer num só lugar.
 IMDM; RPMI1640; HamF10 / HamF12; McCoy's 5A
 MEIOS COMPLETOS
• Aminoácidos
 Todas as formulações médias contêm 10 Aminoácidos essenciais, bem como a cisteína,
glutamina e tirosina.
 A inclusão do outros aminoácidos não essenciais ( alanina, asparagina, ácido aspártico,
glicina, ácido glutâmico, prolina e serina) em algumas formulações do meio reduz a carga
metabólica nas células, permitindo um aumento na proliferação celular.
 L-Glutamina é um aminoácido essencial requerido por virtualmente todas as células de
mamíferos e insetos cultivadas em cultura.
 É usado para produção de proteínas, como fonte de energia e no metabolismo de ácidos
nucleicos.
 Como a L-glutamina é tão lábil, é frequentemente omitido de preparações comerciais
médicas líquidas para prolongar a vida útil do produto.
 Nestes casos, deve ser adicionado assepticamente antes do uso.
• Vitaminas
 As vitaminas atuam principalmente como coenzimas ou grupos protéticos nos processos de
metabolismo celular.
 Componentes comuns no meio de cultura:
→ Biotina
→ Folato
→ Nicotinamida
→ Ácido pantoténico
→ Piridoxina
→ Riboflavina
→ Tiamina
→ Vitamina b12
• Sais
 Elementos básicos, incluindo:
→ Sódio, potássio, cálcio, magnésio, nitrogênio e fósforo
 Crescimento celular precisa de alguns oligoelementos, como:
→ Molibdênio, vanádio, ferro, zinco, selênio, cobre, manganês
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• Glicose
 Ele está incluído na maioria dos meios como uma fonte de energia.
 É metabolizado principalmente por glicolise para formar piruvato, que pode ser convertido
em lactato ou acetoacetato e pode entrar no ciclo do ácido cítrico e ser oxidado para formar
CO2 e água.
 A acumulação de ácido láctico no meio, particularmente evidente em células embrionárias
e transformadas, implica que o ciclo do ácido cítrico pode não funcionar inteiramente como
funciona in vivo.
• Suplementos orgânicos
 Em meios complexos, aparece uma variedade de outros compostos, incluindo:
→ Proteínas
→ Péptido
→ Nucleosídeo
→ Intermediários do ciclo do ácido cítrico
→ Piruvato
→ Lipídos
 Estes constituintes são necessários quando a concentração sérica é reduzida
 Eles podem ajudar na clonagem e na manutenção de certas células especializadas,
mesmo na presença de soro.
• Hormonas e fatores de crescimento

 Hormonas e fatores de crescimento não são especificados nas fórmulas de meios
comuns, embora sejam frequentemente adicionados a meios sem soro.
 Células cultivadas in vivo são regulados por hormônios.
 São importantes para manter a função e o status da célula (diferenciados ou
indiferenciado).
 Algumas hormonas promovem efeitos de crescimento em diferentes tipos de células.
Para instância, insulina pode promover o uso de glicose e aminoácidos na célula.
 Algumas hormonas são específicas para o tipo celular, como hidrocortisona que pode
promover o crescimento de células epidérmicas e prolação que induz a proliferação de
células epiteliais mamárias.
• Antibióticos
 Antibióticos e/ou agentes antimicóticos são adicionados à cultura de meio celular.
→ Como profilático para evitar contaminação,
→ Como uma cura quando a contaminação é encontrada,
→ Induzir a expressão de proteínas recombinantes
→ Para manter a pressão seletiva nas células transfectadas
 Os antimicóticos podem ser tóxicos para muitas linhas celulares.
 Desvantagens dos antibióticos:
→ Eles incentivam o desenvolvimento de organismos resistentes a antibióticos.
→ Eles ocultam a presença de contaminantes crípticos de baixo nível que podem tornar-
se totalmente operacionais se os antibióticos forem removidos, as condições de
cultura mudarem ou se desenvolverem cepas resistentes.
→ Eles podem ocultar infecções por micoplasma.
→ Eles têm efeitos antimetabólicos que podem reagir cruzadamente com células de
mamíferos.
→ Eles incentivam a má técnica asséptica.
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 SÉRUM
• Tipos de soros animais

 Soro Fetal Bovino (FBS)
 Soro fetal bovino qualificado para células-tronco embrionárias
 Soro de vitelo recém-nascido (NCS)
 Soro de bovino suplementado com ferro
 Soro de cavalo
 ....
• Fornece nutrientes essenciais

 Soro contém vários aminoácidos, vitaminas, minerais inorgânicos, gordura, e derivados
de ácido nucleico, que são nutrientes essenciais para o crescimento celular.
• Fornece aderência e fator de extensão

 Muitas células cultivadas in vitro tem que prender o vaso de cultura para crescer, que
depende da matriz extracelular.
 As células podem secretar matriz extracelular in vitro, mas essa habilidade vai diminuir
ou até desaparecer de acordo com o incremento de passagens.
 O soro contém alguns componentes (fibronection, laminin, etc), que pode promover a
adesão celular.
• Fornece hormônio e vários fatores de crescimento

 Soro contém vários hormônios, como insulina, hormônio adrenocortical (hidrocortisona,
dexametasona), hormônio esteróide (estradiol, testosterona e progesterona), etc.
 Os fatores de crescimento incluem fator de crescimento de fibroblastos (FGF),
crescimento epidérmico fator de crescimento (PDGF), entre outros.
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• Fornece proteínas de ligação

 As proteínas de ligação transportam material de baixo peso molecular.
 Por exemplo:
→ Albumina transporta vitaminas, gorduras (ácidos graxos, colesterol) e hormônios.
→ Transferrina carrega ferro.
• Fornece proteção para algumas células específicas

 Algumas células (como células epiteliais, células mielóides) podem liberar protease, que
pode ser neutralizado pelo ingrediente anti-protease no soro.
 Sérum é amplamente utilizado para interromper o efeito da tripsina.
 A albumina sérica facilita a viscosidade sérica e protege a célula contra danos mecânicos,
especialmente na cultura de células em suspensão.
 Os oligoelementos e os iões, como SeO3 e selênio, têm um papel muito importante na
desintoxicação metabólica.
• Desvantagens do uso de soro na cultura de tecidos

 Para a maioria das células, o soro não é fluido fisiológico in vivo.
→ As células apenas entram em contato com o soro durante a cicatrização ou a
coagulação do sangue.
→ Assim, a utilização do soro pode alterar a condição normal de algumas células.
→ O soro pode promover o crescimento de algumas células (como fibroblastos) e inibir
a proliferação de outras células (como querotinócitos epidérmicos).
 Alguns componentes podem ser tóxicos para as células.
→ Veja a poliamina oxidase, por exemplo, ela pode reagir com a poliamina (como
espermina e espermidina) para formar a polispermina tóxica em células altamente
proliferadas.
→ Além disso, complementos, anticorpos e bacteriotoxina podem afetar a célula
crescimento ou até levar à morte celular.
 Cada lote de soro varia de outros e o componente pode não manter a uniformidade.
 O processo produtivo pode infetar com micoplasma ou vírus, que potencialmente
afetam as células e levam ao experimento fracassado e a resultados experimentais não
confiáveis.
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AULA 9
 Viabilidade celular
• Teste de exclusão de azul de tripano
• Métodos para estimar o número de células viáveis em placas de vários poços:
 redução de tetrazólio,
 redução de resazurina,
 marcadores de protease,
 Deteção de ATP.
 Teste de exclusão de azul de tripano

 Azul de tripano é tóxico: a exposição prolongada induz a morte celular.
 células coradas não são viáveis
 células não coradas são viáveis
 Concentração celular
 Ensaios baseados em células

• São frequentemente usados para rastrear coleções de compostos para determinar
se as moléculas de teste têm efeitos sobre proliferação celular ou mostram efeitos
citotóxicos diretos que eventualmente levam à morte celular.
• São amplamente utilizados para medir uma variedade de transdução de sinal,
tráfego de componentes celulares ou monitoramento da função dos organelos, etc.
• Quantas células viáveis restam no final da experiência?
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 Métodos usados em formatos multi-well
 Ensaios de redução de tetrazólio

• Os compostos mais usados incluem:
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 MTT
• Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio

• O primeiro ensaio de viabilidade celular desenvolvido para um formato de 96 poços.
• Foi amplamente adotado e continua popular nos laboratórios académicos.
 Ensaio de MTT Tetrazólio
• Células viáveis com metabolismo ativo converter MTT (amarelo) num produto formazan de
cor roxa (570 nm)
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 Ensaio de Resazurin
• Os dados podem ser recolhidos usando fluorescência ou baseado em absorvância

instrumentação.
• Fluorescência é monitorado no • Absorvância é monitorado a

comprimento de onda de excitação de 530-
570nm e 600nm
560nm e comprimento de onda de emissão
de 590nm
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 Ensaio Resazurin – vantagens
• Ensaio de redução de resazurina é ligeiramente mais sensível que os ensaios de redução de

tetrazólio.
 Ensaio de Resazurin – protocol

1. Remova o meio de cultura de todos os poços;
2. Adicione 50 μl do meio de cultura suplementado com 10% de resazurina;
3. Incubar ~ 4h (37ºC, 5% CO2);
4. Leia a absorvância a 570 e 600nm.
 Ensaio Resazurin - análise de dados
• Controle positive – células não tratadas

• Controle negativo – poços vazios
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 Ensaio de Resazurin – resultados
 Marcador de viabilidade de protease

 Ensaio mede sequencialmente duas atividades de protease; um é um marcador de viabilidade
e o outro é um marcador de citotoxicidade.
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 Ensaio luminogénico de ATP
 Contaminação microbiana
 Evitar a contaminação microbiana
 Fontes potenciais:
→ stocks de células | produtos de cultura;
→ condições de laboratório;
→ funcionários mal treinados (técnicas assépticas ...)
 Tipos de contaminantes microbianos

 Contaminação bacteriana e fúngica
→ É geralmente visível a olho nu (aumento repentino de turbidez; mudança de cor do
meio de cultura).
 Dicas:
→ Exame microscópico diário.
→ Triagem regular de controle de qualidade.
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 Mycoplasma contaminação
• Tamanho pequeno e deformável - passe através de filtros (poros de 220 nm) usados
para esterilizar o meio de cultura de células.
• Não responde a antibióticos que visam a síntese da parede celular.
• Pode ser difícil de detetar no trabalho rotineiro da cultura de linhas celulares.
NOTA: Mycoplasma pode modificar muitos aspetos da fisiologia celular, comprometendo

resultados experimentais
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 Métodos para a deteção de Mycoplasma

• A recomendação é usar duas das três opções:
A. Cultura de ágar e caldo (para Mycoplasma testes, a provisão de um controle positivo

pode ser excluído).
B. Coloração indireta
 Mycoplasma pode ser detetado em culturas de células coradas com um corante
fluorescente (Hoechst 33258 ou DAPI), que se liga ao DNA.
 Como Mycoplasma contêm DNA, podem ser vistos pequenos pontos de
fluorescência, concentrados na superfície celular e no meio circundante e no prato
de cultura (os núcleos celulares aparecerão como grandes áreas ovais fluorescentes).
C. PCR direto
 Alta sensibilidade; rápido, mas requer otimização
 Os iniciadores utilizados são derivados de uma região conservada dentro do gene 16S
rRNA e não detetam DNA eucariótico
 PCR Mycoplasma Deteção

• Pipetar 100 μL de sobrenadante da cultura de células.
• Ferva por 10 minutos e centrifugue brevemente.
• PCR pode dar falsos positivos ou falsos negativos

 Inclua reações de PCR de controle positivo e negativo:
→ Controle negativo: uma amostra de água estéril ou meio de crescimento, que deve
produzir um resultado negativo.
→ Controle positivo: uma amostra de um Mycoplasma linha celular contaminada, que
deve produzir uma banda clara visível no gel de agarose.
• Use 2 μL como modelo em uma reação de PCR da seguinte maneira:
• Analise 5 μL do produto de PCR em um gel de agarose a 1-1,5%.

• Inclua um DNA para estimativa precisa de tamanho e massa dos fragmentos de DNA NZYDNA
Ladder III (200-10000 bp), NZYTech.
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 Fácil terceirização de Mycoplasma teste

• Em 5 etapas fáceis:
1. Ativar códigos de barras de teste;
2. Prepare a amostra (adicione 100 μl de célula inativada pelo calor sobrenadante da cultura
para um tubo de 1,5 mL);
3. Tubos de etiquetas;
4. Enviar amostras;
5. Baixar resultados (dentro de 48h após o recebimento da amostra).
 Relatório de dados de MYCOPLASMACHECK
40

Resumos de Cultura de Células e Tecidos - Parte Animal

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Bárbara Campos e Patrícia Vigário

 Linha do tempo: marcos nas culturas celulares

Descarregado por Rita Esteves (ryta.2403@gmail.com)

Bárbara Campos e Patrícia Vigário

 O que são os 3Rs?

Descarregado por Rita Esteves (ryta.2403@gmail.com)

Bárbara Campos e Patrícia Vigário

• As provas sugerem que a dor e o sofrimento podem alterar o comportamento de um animal,

 Os "Três Rs" na EU - quadro legislativo

Descarregado por Rita Esteves (ryta.2403@gmail.com)

Bárbara Campos e Patrícia Vigário

 Quais são as alternativas aproxima-se?

 Legislação aplicável em Portugal

Descarregado por Rita Esteves (ryta.2403@gmail.com)

Bárbara Campos e Patrícia Vigário

 Aplicações das culturas celulares:

Descarregado por Rita Esteves (ryta.2403@gmail.com)

Bárbara Campos e Patrícia Vigário

 Tipos de cultura de tecidos:

 Propriedades de Diferentes Tipos de Cultura

Cultura de órgãos Explant Cultura de células Cultura organotípica

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Bárbara Campos e Patrícia Vigário

 O que é a Cultura Célula Primária?

 INÍCIO DE UMA CULTURA CELULAR

 Recursos comuns de desagregação

1. Tecidos necróticos e gordurosos são melhor removidos durante a dissecção.

Descarregado por Rita Esteves (ryta.2403@gmail.com)

Bárbara Campos e Patrícia Vigário

 TIPOS DE CULTURA PRIMÁRIA

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 CULTURA PRIMÁRIA DE EXPLANTES

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 Enzimas usadas na desagregação

Desagregação a quente da tripsina Desagregação a frio por tripsina

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 Limite de Hayflick - Papel dos telómeros na senescência celular

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NOTA: um ou todos os quais podem ser expressos em uma linha celular

 Imortalização - Transfeção do gene da telomerase com um promotor regulável é suficiente para

• Ciclo de crescimento de células cultivadas é representado por três fases:

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 Projeto de Laboratório, e equipamento

• Instalações de cultura de tecidos

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• Banco de serviço Posicione a banco de serviço para:

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 Armários de segurança biológica

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• Capela de fluxo horizontal:

• Capelas de fluxo verticais:

• Classe II BSC - Básico: