Alternativas para

animais de
laboratório
Prof. Hugo Delleon
 Métodos alternativos são procedimentos que podem
substituir o uso de animais em experimentos, reduzir o
número de animais necessários, ou refinar a
metodologia de forma a diminuir a dor ou o
desconforto sofrido pelos animais.
 RESOLUÇÃO NORMATIVA CONCEA Nº 54, DE
10 DE JANEIRO DE 2022
• Método alternativo validado: método que possa ser utilizado para
substituir, reduzir ou refinar o uso de animais em atividades de ensino
e pesquisa e cuja confiabilidade e relevância foram determinadas por
meio de um processo que envolve os estágios de desenvolvimento,
pré-validação, validação e revisão por especialistas, e em
conformidade com os procedimentos realizados por centros para
validação de métodos alternativos ou por estudos colaborativos
internacionais, podendo ter aceitação regulatória internacional, que
visem atingir, sempre que possível, a mesma meta dos procedimentos
substituídos por outras metodologias.

• Método alternativo reconhecido

Algumas denominações...
• Estudo ou Teste in vitro
• Estudo in vivo
• Estudo ex vivo
• Estudos in silico
Ensaios in vitro -
definições
 Edward Jenner, 1798 - primeira
tentativa científica para controlar
uma doença infecciosa (varíola e
varicela)

Histórico da
experimentaçã Pasteur, 1880 – vacina contra a
cólera
o animal

Jacob Henle, 1840 (1809-1885)

organismos vivos, e não miasmas,
eram os causadores de doenças
1842 - Sociedade Britânica para Prevenção da Crueldade com Animais

Com o advento do desenvolvimento de vacinas e dos primeiros antibióticos, teve

início um uso muito mais intenso e sistemático de animais de experimentação

1959 - Russel & Burch - publicaram O Princípio da Técnica Experimental

Humanitária e introduziram o conceito dos 3Rs
Movimento internacional, baseado nos 3Rs, para a validação e
a aplicação de novas técnicas, especialmente in vitro
 Cultivo Celular

• https://www.youtube.com/watc
h?v=wZIpOHheh9M

• https://www.youtube.com/watc
h?v=VLJF8Pf8spw
 A VALIAÇÃO
FARMACOLÓGICA
PRIMÁRIA – E NSAIOS IN
VITRO
• Atividade antiinflamatória,
imunomoduladora

• Antineoplásica

• Contra bactérias e parasitos

protozoários
 Alternativas para
animais de laboratório:
uso de animais não-
convencionais –
roedores silvestres

Os animais silvestres e seus parasitos têm recebido, recentemente, especial

atenção por causa das doenças infecciosas emergentes ou reemergentes
POR QUE UTILIZAR ROEDORES SILVESTRES?

Permite abordar o fenômeno do parasitismo de maneira mais próxima

às condições em que ele ocorre na natureza

Melhores subsídios para o controle de endemias que afetam o homem

Roedores são modelos adequados

São apontados como hospedeiros de diversos patógenos de caráter

zoonótico
Dificuldades
• Identificação
• Obtenção das matrizes a
campo
• Quarentena
• Letalidade de 50%
Figura . Cariotipo macho de Peromyscus maniculatus
(24=48 ).
• Animais mortos e a maravalha são considerados resíduos sólidos de
risco biológico potencialmente contaminados e devem ter como
destino a incineração (ABNT, 1987)

• Antes de serem incinerados, a maravalha deve ser ensacada e

autoclavada, bem como os animais mortos e os materiais de maior
volume.

• As caixas devem ser imersas em água sanitária por pelo menos quatro
horas, lavadas com detergente e banhadas em solução de hipoclorito
de sódio a 1%.
 IMPLANTAÇÃO E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA
• As condições ambientais do biotério devem ser estabilizadas e
monitoradas:
• exaustão
• Refrigeração
• iluminação e desumidificação do ar
• adaptação ao cativeiro e a manutenção do roedor silvestre saudável
• testes sorológicos e parasitológicos

• Portaria IBAMA n1. 6/1994 – todos os animais devem ser

identificados por microchips e, após a morte, taxidermizados, seu
esqueleto preparado, e depositados em uma coleção científica.
 PRODUÇÃO DE A
NIMAIS
• Individualizado para cada espécie

• Animal estressado permanece

inquieto, agressivo

• Pessoal Especializado

• Experiências bem-sucedidas:
Didelphis, Philander e Monodelphis e
os roedores Nectomys, Calomys,
Akodon e Thrichomy
RESOLUÇÃO nº 58, de 24 de
fevereiro de 2023
• Proibido o uso de animais vertebrados, exceto seres humanos, em
pesquisa científica, desenvolvimento e controle de produtos de higiene
pessoal, cosméticos e perfumes que utilizem em suas formulações
ingredientes ou compostos com segurança e eficácia já comprovadas
cientificamente e dá outras providências.
 Alternativas aos Animais de Lab.: do animal ao computador

Estrutura de um Ensaio Biológico

Estímulo (subst. ou prod. a ser administrado)

Substrato (animal ou cultivo celular)

Resposta

MODELOS MATEMÁTICOS OU COMPUTACIONAIS – recurso em que se utiliza um

banco de dados que pode predizer determinadas ações de substâncias no
organismo. O banco é formado por meio de informações obtidas no passado.
• SUBSTITUIÇÃO DIRETA – utiliza um método alternativo para obter
respostas o mais próximo possível dos animais. Ex.: pele in vitro de
animais ou voluntários humanos (ensaio de irritação cutânea em
coelhos).

• SUBSTITUIÇÃO INDIRETA – utiliza um sistema que fornece os

resultados através de dosagem ou reação de algum mediador que
fornece a resposta no modelo animal- Ex.: o teste de LAL (Limulus
Amoebocyte Lysate) substitui o ensaio de pirogênio em coelhos pela
determinação qualitativa ou quantitativa da presença de endotoxinas
numa solução.

• LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) – Dependendo do método, a presença de endotoxina pode ser
constatada por meio da coagulação (método gel-clot) ou da liberação de cor (método cromogênico).
• SUBSTITUIÇÃO TOTAL (ABSOLUTA) – é aquela em que a informação
necessária pode ser obtida sem o uso de animais de experimentação.
- Por exemplo: potência de insulina ou somatotropina por HPLC. Nesse
caso, os animais são substituídos pela determinação da potência por
métodos físico-químicos.

• SUBSTITUIÇÃO PARCIAL (RELATIVA) – é aquela em que se substitui,

parcialmente, a utilização de animais.
- Por exemplo: técnicas que utilizam cultura de células, órgãos isolados
ou uso de preparações subcelulares (receptores isolados).
USO DE ESTÁGIOS INICIAIS DO
DESENVOLVIMENTO
É o caso, por exemplo, do teste da HET-
CAM (membrana cório-alantóide de ovo de
galinha embrionado)

Ovos de 9 dias

Substituto ao teste de irritação ocular em congestão, hemorragia e coagulação.

coelhos
 Citotoxicidade

• Citotoxicidade – compreende diversas

técnicas usando parâmetros de morte
ou alterações fisiológicas de
diferentes linhagens celulares. Entre
os métodos mais utilizados, estão a
difusão em agarose (células L929),
captação de vermelho neutro ou MTT
– (Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-
il)-2,5difeniltetrazolium), ambos
utilizando células 3T3 ou SIRC.
• Pele reconstituída – utilização de fragmentos de pele humana (a partir
de circuncisão ou sobras de cirurgia plástica). Observação de
alterações histológicas e/ou liberação de mediadores inflamatórios.

• RBC (Red Blood Cell Assay) – baseia-se na avaliação da hemólise e na

desnaturação causadas por produtos (cosméticos) e/ou substâncias
(tensoativos) perante um controle conhecido, geralmente, Lauril
Sulfato de Sódio.

• WBC (Whole Blood Assay) – possível substituto para o ensaio de

detecção de pirogênio em coelhos, por meio da liberação de
mediadores inflamatórios quando um produto injetável é colocado
em contato com sangue total humano
 Resolução nº 55, de 5 de outubro de 2022
• Atualiza o texto da Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de
Animais em Atividades de Ensino ou de Pesquisa Científica – DBCA

• FINALIDADE DA DBCA
- apresentar os princípios e as condutas que permitem garantir o cuidado
e o manejo eticamente correto de animais produzidos, mantidos ou
utilizados em atividades de ensino ou de pesquisa científica

- Traz orientações para instituições, Comissões de Ética no Uso de

Animais - CEUAs, professores, pesquisadores e todos os demais
usuários envolvidos no cuidado ou no manejo de animais produzidos,
mantidos ou utilizados em atividades de ensino ou de pesquisa
científica
 Resolução nº 55, de 5 de outubro de 2022
• É Responsabilidade das CEUAs em determinar se a utilização de animais em
atividades de ensino ou de pesquisa científica é devidamente justificada -
adesão aos princípios dos 3Rs

• Abrange os aspectos de manejo e cuidados na criação, na manutenção e na

utilização de animais, especificando princípios éticos

• O uso de métodos alternativos em pesquisa científica reconhecidos pelo

Concea é obrigatório, de acordo com a legislação vigente.

• Todas as atividades de ensino e de pesquisa científica devem prever o

programa de enriquecimento ambiental a ser aplicado. A impossibilidade de
aplicação de enriquecimento ambiental deve ser justificada
 Resolução nº 55, de 5 de outubro de 2022
• RESPONSABILIDADES DOS PROFESSORES, PESQUISADORES E DEMAIS
USUÁRIOS ENVOLVIDOS

• CONTEÚDO DAS PROPOSTAS SUBMETIDAS ÀS CEUS

• RESPONSABILIDADES DOS PROFESSORES E PESQUISADORES

• DETECÇÃO DE DOR E ESTRESSE

• MANEJO, IMOBILIZAÇÃO E CONFINAMENTO DE ANIMAIS

• DESTINAÇÃO DOS ANIMAIS

RESOLUÇÃO Nº 56, DE 5 DE
OUTUBRO DE 2022
• Reconhece métodos
alternativos ao uso de animais
em atividades de pesquisa no
Brasil
 I - SAÚDE HUMANA
1 - Sensibilização dérmica

a) Método OECD TG 442E - Sensibilização cutânea in vitro: ensaios

de sensibilização cutânea in vitro abordando o evento chave na
ativação de células dendríticas no Caminho da Resposta Adversa
(AOP) para sensibilização cutânea

Organisation for Economic Co-operation and Development

(OECD)
 I - SAÚDE HUMANA
2 - Avaliação de efeitos estrogênicos

a) Método OECD TG 455 - Teste baseado na performance para ensaios

in vitro de transativação transfectada estável para detectar agonistas
e antagonistas de receptor estrogênico.

b) Método OECD TG 493 - Teste baseado na performance para ensaios

in vitro de receptor estrogênico humano recombinante (hrER) para
detectar substâncias químicas com afinidade de ligação ER.
 I - SAÚDE HUMANA
3 - Efeitos endócrinos
a) Método OECD TG 456 - Ensaio de Esteroidogênese H295R.

4 - Efeitos androgênicos
a) Método OECD TG 458 - Ensaio de ativação transcripcional de
receptores androgênicos humanos transfectados para detecção de
atividade agonista e antagonista de substâncias químicas.
 I - SAÚDE HUMANA
5 - Mutagenicidade

a) Método OECD TG 471 - Teste de mutação bacteriana reversa.

b) Método OECD TG 473 - Teste in vitro de aberração cromossômica de mamíferos.

c) Método OECD TG 476 - Testes in vitro de mutação gênica de células de mamífero

usando os gens Hprt and xprt.

d) Método OECD TG 490 - Testes in vitro de mutação gênica em células de mamífero

usando gen Timidinaquinase.
 I - SAÚDE HUMANA
6 - Irritação/corrosão ocular

a) Método OECD TG 494 - Vitrigel - Teste de irritação ocular para

identificação de substâncias químicas que não requerem
classificação e rotulagem para irritação ocular ou sério dano ocular.

b) Método OECD TG 496 - Teste macromolecular in vitro para

identificação de substâncias químicas que induzem dano ocular severo e
substâncias químicas que não requerem classificação para irritação
ocular ou dano ocular severo.
 I - SAÚDE HUMANA
7 - Fotorreatividade
a) OECD TG 495 - Ensaio de fotorreatividade por Ros (Espécies oxigênio
reativas).

II - EFEITOS EM SISTEMAS BIÓTICOS

a) Método OECD TG 212 - Peixe, teste de toxicidade a curto prazo em estágios
embrionários e recém nascidos.
b) Método OECD TG 236 - Toxicidade aguda em embrião de peixe (FET).c)
Método OECD TG 319-A - Determinação do "clearance" intrínseco "in vitro"
usando hepatócitos criopreservados de Truta Arco-Íris (RT-HEP).
d) Método OECD TG 319-B - Determinação do "clearance" intrínseco "in
vitro" usando fração sub-celular S-9 de Truta Arco-Íris (RT-S9).