Apostila Aula Prática Microbiologia

UFLA – Universidade Federal de Lavras
DBI – Departamento de Biologia
MICROBIOLOGIA GERAL (GBI 111 e 132)

PRÁTICAS DE LABORATÓRIO
Nome:.........................................................................Matrícula..................Turma..........
Autores em ordem alfabética:
Drª. Cristina F. Silva e Batista

Dr. Dirceu de Sousa Melo
Dr. Eustáquio Souza Dias
Drª. Patrícia Gomes Cardoso
Drª. Rosane Freitas Schwan
Dr. Victor Satler Pylro
Dr. Whasley Ferreira Duarte
MICROBIOLOGIA GERAL (GBI 111 e 132)

PRÁTICAS DE LABORATÓRIO
Universidade Federal de Lavras

Departamento de Biologia
Lavras – Minas Gerais
REGRAS DO LABORATÓRIO
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INSTRUÇÕES DE COMPORTAMENTO NO LABORATÓRIO
1 No caso de acidentes, comunicar imediatamente ao professor.

2 Limpar e desinfetar as bancadas e capelas no início e no final das aulas.
Ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como
3
seringas, pipetas Pasteur, lâminas de aço e vidros em geral.
4 Descartar o material utilizado nos locais apropriados.
5 Todo material utilizado deve ser devidamente identificado.
A alça de platina e agulha utilizadas na manipulação dos microrganismos
6 devem ser esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois de utilizadas.
Colocá-las sempre na posição vertical no suporte e não sobre a bancada.
7 Nunca pipetar com a boca.
8 Não sair com nenhum material das aulas.
Não devolva o reagente ao frasco original, principalmente em se tratando de
9 substância P.A. Nunca retire do frasco mais do que necessário. Nunca use
uma mesma espátula para reagentes diferentes!
10 Cuidado com as espátulas usadas, descarte em local apropriado.
Cuidado com qualquer material quente, especialmente substâncias químicas.
11 Espere que resfriem para o manuseio seguro, usando luvas adequadas ou
garras especiais.
Leia o roteiro de aula prática antes de iniciar qualquer procedimento. Anote
12 os resultados experimentais, discussões e conclusões. Faça todos os
exercícios da apostila, pois, esta será conferida no final de cada aula.
Antes de deixar o laboratório em cada aula, ordenar todo o material usado,
fechar a água, o gás e desligar o interruptor e a tomada do microscópio.
13
Mantenha o laboratório organizado e limpo. Atenção especial com as
bancadas, sua segurança pode estar em jogo.
Estas normas têm como metas:
✓ A segurança de cada um e de todos;

✓ O bom funcionamento do laboratório;
✓ A eficiência e eficácia na condução das práticas.
ÍNDICE
Nº prática Tema aula prática Página
Introdução ao Laboratório de Microbiologia e observação de

1 1
microrganismos no ambiente
2 Meios de cultura: utilização, preparo e esterilização 8
3 Observação microscópica de protistas e algas 16
Isolamento de fungos filamentosos e morfologia de micélios e

4 27
leveduras
5 Esporos fúngicos assexuados e sexuados 35
6 Isolamento e enumeração de microrganismos 55
7 Obtenção de culturas puras: estrias simples e compostas 60
Preparações microscópicas fixadas: coloração de Gram e

8 63
Antibiograma
9 Metabolismo microbiano: fermentação alcoólica 73
10 Alterações genotípicas e fenotípicas em microrganismos 76
Práticas Extras
Métodos de esterilização e controle de crescimentos de

11 79
microrganismos
12 Seleção de microrganismo para aplicação biotecnológica 87
13 Análise microbiológica de água 90
Anexo I. Protocolos para preparo de corantes, reagentes e meios

96
Prática 1 – Introdução ao Laboratório de Microbiologia e observação de
microrganismos no ambiente
Estima-se que nosso planeta hospede uma ordem de 1030 células microbianas –
número esse, maior do que o de estrelas no universo observável – distribuídas em
aproximadamente 1 trilhão de espécies (1012). Apesar da sua importância clínica, sabe-se
que menos de 1 % dessa diversidade microbiana tem reconhecido potencial patogênico
em humanos, e hoje, passa-se a entender que essa enorme diversidade tem papel
fundamental para a manutenção do nosso estado saudável e na estabilidade de todos os
ecossistemas.
Durante as aulas práticas do curso de Microbiologia Geral utilizaremos técnicas
microbiológicas clássicas de isolamento, conservação e caracterização de
microrganismos que são aplicadas em diversas pesquisas, na indústria bioquímica, de
alimentos, na agricultura, na biotecnologia, entre outras áreas. Esses microrganismos
apresentam distribuição ampla, podendo ser encontrados em quaisquer ambientes,
superfícies ou mesmo em suspensão.
Um laboratório de microbiologia apresenta alguns equipamentos e vidrarias
comuns a outros laboratórios, como os de química ou de análises clínicas. No entanto,
algumas vidrarias são exclusivas para uso na área de microbiologia. Basicamente, um
laboratório deve possuir autoclave, microscópio, câmara de segurança biológica (câmara
de fluxo laminar), estufas de secagem e bacteriológica, BOD, refrigeradores e balanças
analíticas.
Nesta primeira aula, conheceremos as normas básicas, materiais e equipamentos
rotineiramente utilizados em um Laboratório de Microbiologia. Também, teremos a
oportunidade de verificar a presença de microrganismos no ambiente, justificando as
normas propostas.
Objetivos
1- Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia.
2- Averiguar a presença de microrganismos no ambiente.
1
Abaixo, a descrição dos principais EQUIPAMENTOS:
Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem
o enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas
temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo. A autoclave é um equipamento
indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água,
suspensões e descarte de material contaminado.
Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco toda vidraria

convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200o C por 1-2 horas.
Refrigerador - utilizado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa

temperatura, diminuindo o metabolismo.
Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na

temperatura adequada.
Câmara de Segurança Biológica (câmara de fluxo laminar) - câmara asséptica, dotada

de exaustor, lâmpada fluorescente e luz ultra violeta (germicida), sendo utilizada para
diversos tipos de operações que requerem assepsia, tais como verter meio em placas de
Petri, isolar e repicar microrganismos.
Microscópio óptico - utilizado em observação de imagem ampliada até mil vezes por
meio de dois conjuntos de lentes: as objetivas, que ficam próximas do objeto e ampliam
a imagem real; e as oculares, próximas do olho do observador, que ampliam a imagem
novamente. É constituído por duas partes – uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada
parte engloba uma série de componentes constituintes do microscópio. A parte mecânica
serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica. É constituída por base ou pé,
parafusos macro e micrométricos, haste ou braço, mesa ou platina, charriot, presilha,
tambor ou revólver das objetivas e canhão. A parte óptica é constituída por fonte de
iluminação, lente condensadora ou condensador, botão do condensador, diafragma e pelas
lentes oculares e objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objeto. A
ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela
ampliação da ocular. Visto que esses componentes são de alta precisão e alto custo, o
microscópio requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção.
2
Balança analítica: usada para se obter massas de sólidos e líquidos com alta exatidão.
Bico de Bunsen: é um bico de gás, alimentado por um tubo de borracha, fixado em uma
base metálica com entrada de ar, cuja chama é utilizada para técnicas de flambagem e
esterilização de materiais contaminados.
3
Os principais MATERIAIS e VIDRARIAS são:
Erlenmeyer (1), proveta (2), béquer (3), placas de Petri (4), tubos de ensaio (cultura) (5),
lâminas e lamínulas (6), alça de Drigaslky (7), pipeta de transferência (8), câmara de
Neubauer (9) alça de inoculação (ou de platina) (10), pipetas automáticas (11), pisseta
(12).
1) 2) 3) 4)
5) 6) 7) 8)
9) 10) 11) 12)
4
Procedimentos
- Averiguação da presença de microrganismos no ambiente:
1- Exponha a placa de Petri, contendo o meio de cultura estéril, a uma condição de

inoculação de sua preferência, por exemplo, exposição à pele, ao ar, cabelo, etc. Incubar
à 25 ℃, por uma semana (até a próxima aula). Mantenha uma placa estéril como Controle.
- Verificação da utilidade do Bico de Bunsen
1- Abrir uma placa de Petri, contendo o meio de cultura estéril, próximo à chama do Bico
de Bunsen, por 60 segundos e posteriormente, incubar à 25 ℃, por uma semana (até a
próxima aula). Mantenha uma placa estéril como Controle.
LEMBRE-SE DE IDENTIFICAR O MATERIAL: as placas devem ser identificadas

na borda da placa, com número da turma, bancada, data e condição de incubação.
5
Resultados
Após o período de incubação, anotar a presença ou ausência de microrganismos nas
diversas condições, identificando os diferentes morfotipos encontrados.
- Averiguação da presença de microrganismos no ambiente:

Número de morfotipos: __________________
Observação:____________________________________________________________
- Verificação da eficácia do Bico de Bunsen:

Número de morfotipos: __________________
Observação:____________________________________________________________
6
Exercícios
1- Qual é a utilidade do Bico de Bunsen no Laboratório de Microbiologia?
2- Explique a finalidade e o princípio do funcionamento da autoclave.
3- Diferencie colônias de bactérias e fungos filamentosos. Dê as principais características

da morfologia das colônias.
4- Com base nos resultados, o que aconteceu com os Controles? Explique os resultados
dos Ensaios.
7
Prática 2 – Meios de cultura: utilização, preparo e esterilização
Todos os organismos vivos necessitam de uma variedade de elementos químicos

que são essenciais para a síntese e funcionamento normal dos componentes celulares.
Estes elementos estão presentes na natureza na forma de compostos orgânicos ou
inorgânicos. O meio de cultura, também denominado meio de cultivo, consiste em um
material nutritivo, preparado em laboratório, que se destina ao cultivo artificial dos
microrganismos, devendo, portanto, fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu
crescimento. As exigências nutricionais dos microrganismos, em relação aos elementos
requeridos, são bastante semelhantes àquelas exigidas pelas plantas ou animais, ou seja,
necessitam de carbono, nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo, cálcio,
potássio, magnésio, além dos micronutrientes e vitaminas. A diferença básica entre os
microrganismos e as plantas e animais é quanto à fonte de cada elemento. As plantas os
utilizam predominantemente na forma inorgânica e os animais, na forma orgânica. Os
microrganismos podem utilizá-los tanto na forma orgânica, inorgânica ou até mesmo
gasosa. Entre os microrganismos, os que são capazes de se desenvolver em meios
inteiramente inorgânicos (minerais) são chamados de autotróficos, enquanto que outros
microrganismos que exigem compostos orgânicos como fonte de carbono e de energia
são chamados de heterotróficos.
Dependendo da finalidade a que se destinam, os meios de cultura podem ser
líquidos, sólidos ou semi-sólidos. Os meios líquidos podem ser usados em estudos de
crescimento, de fermentação e na produção de biomassa, enquanto que os meios sólidos
são úteis para contagem e isolamento de microrganismos. Por fim, os meios semissólidos
são utilizados para fins muito específicos, como, por exemplo, para a detecção de placas
de lise em culturas bacterianas infectadas por vírus. Os meios sólidos e semi-sólidos são
acrescidos de agente solidificante, o ágar, normalmente na concentração de 1,5% para os
meios sólidos e 0,75% para os meios semi-sólidos. O ágar consiste de uma mistura de
dois polissacarídeos: agarose e agaropectina. A agarose é formada por unidades
repetitivas de agarobiose (dissacarídeo formado por D-galactose, 3,6-anidro-L-
galactopiranose e ácido D-glucurônico, extraído de algas vermelhas (Gelidium corneum-
alga marinha japonesa) a 80 oC, com H2SO4 diluído. O ágar tem a propriedade de fundir
em temperatura de 80 a 100 oC e solidificar-se em temperaturas abaixo de 45 oC.
Além disso, com respeito à sua composição, existem os meios de cultivo naturais,
como infusão de batata, sangue e leite, nos quais a composição química exata não é
8
conhecida. Existem, também, os meios sintéticos, contendo componentes químicos puros,
orgânicos e/ou inorgânicos, bem como aqueles que podem ser obtidos pela combinação
de reagentes puros com extratos naturais. A seguir, serão descritos os diferentes tipos de
meios de cultura, os quais são classificados em função da composição química e/ou
função.
1. Meios de cultura complexos ou indefinidos: são meios de cultura nos quais os

componentes possuem todos os nutrientes requeridos pelos microrganismos, mas a
quantidade exata não é especificada. Esses meios de cultura são preparados com base em
produtos naturais, como: Extrato de carne - solução aquosa de carne bovina concentrada
em pasta. Peptona - proteínas que foram parcialmente degradadas por enzimas, como
hidrolisado de caseína do leite, hidrolisado de proteínas da soja, carne, gelatina e outras
fontes de proteínas. Extrato de levedura, sangue, soro, leite, extrato de solo e fluido
de rúmen - todos esses materiais são complexos e contêm açúcares, aminoácidos,
vitaminas e sais.
2. Meios quimicamente definidos: são os meios nos quais a composição exata de cada
nutriente ou elemento químico é conhecido (Ex: Tabela 1). Adicionar ou retirar um
determinado elemento do meio permite conhecer se aquele constituinte em particular é
essencial para o crescimento de determinado microrganismo (fator de crescimento).
Tabela 1- Meio de cultura quimicamente definido para o crescimento de bactérias

heterotróficas.
Ingrediente Função Quantidade

Glicose Fonte de carbono e energia 10 g
NH4H2PO4 Fonte de nitrogênio, tampão e íons essenciais 5g
K2HPO4 Tampão e íons essenciais 1g
NaCl Íons essenciais 5g
Água destilada Solvente 1000 mL
9
3. Meios Especiais: são meios formulados com objetivos específicos, utilizados
principalmente nos trabalhos de isolamento e identificação de microrganismos. Podem
ser:
3.1. Meios seletivos: são designados para o aumento do crescimento de um determinado
microrganismo ou grupo de microrganismos em detrimento de outros. Alguns meios
seletivos possuem corantes na sua composição (ex. verde brilhante), feniletanol e
antibióticos, que inibem determinados grupos de microrganismos. Para o isolamento de
bactérias, pode-se utilizar meio apropriado para o crescimento de bactérias e contendo
também antibiótico contra fungos e vice-versa. Para o isolamento de fungos, pode-se
utilizar também meio cuja composição seja desfavorável para bactérias, em função de pH
e concentração de açúcares, como é o caso do meio Sabouraud para o crescimento de
fungos (Tabela 2).
Tabela2- Composição química do meio Sabouraud.

Ingrediente Função Quant.
Peptona Fonte de carbono, nitrogênio e elementos 10 g
Glicose Fonte de carbono e energia - Alta concentração inibe 40 g

crescimento de bactérias
Ágar Agente gelatinizante - ‘solidificante’ 15 g
Água destilada Solvente 1000 mL
pH Baixo pH inibe bactérias, mas permite crescimento de 4,5

fungos
3.2. Meios Diferenciais: são utilizados para diferenciar microrganismos entre vários tipos
em uma mesma placa. Muito utilizados para determinar qualidade de água e de alimentos
em geral.
Existem meios que são diferenciais/seletivos, porque, além de permitir a
diferenciação entre diferentes grupos ou espécies, permitem a contagem de um grupo em
detrimento de outro. Estes podem distinguir entre grupos de organismos
morfologicamente e bioquimicamente relacionados, pois incorporam componentes
químicos que, seguindo inoculação e incubação, produzem mudança característica na
aparência do crescimento da colônia bacteriana e/ou no meio de cultura ao redor das
10
colônias, o que permite a diferenciação. Os meios de cultura a seguir são representativos
desses dois tipos
I. Ágar Sal Manitol: Este meio de cultura contém alta concentração de sal, 7,5 % NaCl,
que é inibitório ao crescimento da maioria das bactérias, mas não para estafilococos. O
meio de cultura também realiza função diferencial: contém o carboidrato manitol, que
alguns estafilococos são capazes de fermentar e vermelho de fenol (phenolred), que é um
indicador de pH para detectar ácido produzido pela fermentação do manitol. Colônias de
estafilococos exibem um halo amarelo ao redor da colônia; estafilococos que não
fermentam manitol não produzirão mudança na coloração.
II. Ágar Sangue: O sangue que é incorporado neste meio de cultura é um ingrediente de
enriquecimento para o cultivo de organismos exigentes como o Streptococcus spp. O
sangue também permite a demonstração de propriedades hemolíticas de alguns
microrganismos, particularmente estafilococos.
III. Ágar MacConkey: A ação inibitória do cristal violeta no crescimento de organismos

Gram-positivos permite o isolamento de bactérias Gram-negativas. A incorporação de
lactose, sais biliares, e o indicador de pH vermelho neutro, permite a diferenciação de
bactérias entéricas devido à habilidade de fermentar lactose. Neste meio de cultivo,
enterobactérias são separadas em dois grupos:
a- Coliformes: produzem ácido como resultado da fermentação da lactose. A bactéria

exibe coloração vermelha na superfície da colônia. Escherichia coli produz maiores
quantidades de ácido, em função da fermentação da lactose, do que outras espécies
de coliformes. Quando isso ocorre, o meio de cultura que cerca o crescimento
também se torna vermelho, por causa da ação do ácido que precipita sais biliares,
seguindo-se então, a absorção do vermelho neutro.
b- Bacilos da disenteria, tifoide e paratifoide: não são fermentadores de lactose, e,
portando, não produzem ácido. As colônias aparecem sem cor e frequentemente
transparentes.
IV. Ágar EMB (Eosyn Methylene Blue Agar, Levine): a presença de lactose e os corantes
eosina e azul de metileno permitem diferenciação entre fermentadores e não
fermentadores de lactose. As colônias de E. coli apresentam coloração azul-preta com
brilho metálico esverdeado causado pela grande quantidade de ácido. Outra bactéria
coliforme, como a Enterobacter aerogenes, produz colônias espessas, mucoides e rosas
neste meio de cultura. Bactérias entéricas que não fermentam lactose produzem colônias
11
sem cor, que, devido à sua transparência, parecem adquirir a coloração roxa do meio de
cultura. Esse meio de cultura é também parcialmente inibitório ao crescimento de
organismos Gram-positivos e, portanto, o crescimento de gram-negativos é mais
abundante.
V. Ágar PEA (Phenyl ethyl alcohol agar): Esse meio de cultura é usado para o isolamento
da maioria de cocos Gram-positivos. O álcool fenil etílico inibe parcialmente bactérias
Gram-negativas, as quais podem formar colônias visíveis, cujos tamanho e número são
muito menores que em outros meios de cultura.
3.3. Meios de Enriquecimento: Meios convencionais enriquecidos com um ou mais

componentes químicos que favoreçam uma determinada população de microrganismo
numa população mista. Por exemplo, a adição de lactose no meio favorece o crescimento
de bactérias que produzem β-galactosidase, aumentando o seu crescimento
exponencialmente. Além dos meios de enriquecimento, podem-se utilizar outras técnicas
de enriquecimento em função de diferentes condições físicas ou físico-químicas, como
pH, temperatura, atmosfera, etc.
Além dos requerimentos nutricionais, fatores físicos interferem no crescimento
microbiano, como temperatura, presença de oxigênio, de luz, salinidade e o pH. Cada
espécie bacteriana cresce sob faixas de temperatura características: psicrófilos (15-20 oC),
mesófilos (25-40 oC) e termófilos (45-60 oC). Quanto à presença de oxigênio livre,
existem bactérias aeróbias, anaeróbias, anaeróbias facultativas e microaerófilas. Para a
maioria das bactérias, o pH ótimo de crescimento varia entre 6,5 e 7,5.
Esterilização de meios de cultura
A utilização de meios de cultura estéreis é uma condição essencial para se trabalhar

com microbiologia. Nesta aula prática teremos oportunidade de preparar meios de cultura
líquido e sólido e esterilizá-los por calor úmido em autoclave, um dos métodos de
esterilização de meios de cultura mais comuns no laboratório de microbiologia.
✓ A utilização de calor úmido é um dos métodos mais eficazes de destruição
de microrganismos. A morte das células microbianas por ação do calor
úmido resulta da desnaturação das proteínas e da desestabilização da membrana
citoplasmática. A autoclave torna-se uma câmara com vapor de água saturado à
12
pressão de 1 atm acima da pressão atmosférica, atingindo uma temperatura de 121
ºC. No laboratório de microbiologia é usual sujeitar o material a ser esterilizado a
121ºC durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de
vida bacterianas, incluindo dos endósporos bacterianos, que são mais resistentes
ao calor do que as células vegetativas. Contudo, o tempo necessário para se
esterilizar convenientemente os materiais a esta temperatura depende da natureza
do material a esterilizar e/ou do seu volume. O calor úmido sob pressão é utilizado
na esterilização de meios de cultura que não contenham componentes termolábeis,
bem como na esterilização de materiais de laboratório utilizados nos estudos de
microbiologia.
Objetivos
1- Preparar os meios de cultura: caldo nutriente e ágar nutriente ou outro sugerido pelo
professor;
2- Executar esterilização em autoclave (calor úmido) dos meios de cultura;
3- Observação de placas com diferentes meios e culturas crescidas.
Materiais
Reagentes: Na2HPO4, NaCl, extrato de carne, peptona, água destilada.
Equipamentos e utensílios: espátulas, vidrarias (pipetas, provetas, béqueres, bastão de
vidro, frascos Erlenmeyer), tampões de algodão, autoclave.
Procedimento
Preparo de meios de cultura: caldo/ágar nutriente.
1- Pesar isoladamente nos béqueres os componentes do meio de cultura para o volume
final de 100mL de caldo nutriente;
2- Dissolva cada componente em béquer, adicionando um pequeno volume de água
destilada e agitando com bastão de vidro;
3- Transfira cada componente dissolvido para um frasco Erlenmeyer, misturando os
componentes;
4- Complete o volume com água destilada para 100mL, fazendo uso de uma proveta;
5- Para preparar o ágar nutriente adicione a um frasco Erlenmeyer contendo 50 mL do
Caldo Nutriente, 0.75 g de ágar (1,5 %).
13
Importante!
1º) O ágar não dissolve a temperatura ambiente e precisa ser fundido a 80-100 %;
2º) Nunca ocupar mais que 1/3 do volume do frasco; 3º) os meios precisam ser
esterilizados antes do uso.
Tabela 3- Composição do meio de cultura Ágar Nutriente
Composição Quantidade
Na2HPO4 0,2 g
NaCl 0,3 g
Extrato de Carne 0,3 g
Peptona 0,5 g
Ágar 1,5 g
Água destilada 100 mL
Tabela 4- Composição do meio de cultivo BDA
Composição Quantidade
Caldo de Batata 50 mL
Dextrose 2g
Ágar 1,5 g
Água destilada 100 mL
14
Exercícios
1- Cite as funções dos componentes dos meios de cultura Ágar Nutriente que você
preparou.
2- Defina a diferença entre microrganismos autotróficos e heterotróficos. Dos grupos de

microrganismos estudados, classifique-os se são autotróficos ou heterotróficos.
3- Por que, algumas vezes, a esterilização de meios de cultura por calor sob pressão, em
autoclave, não é adequada? Qual seria a alternativa sugerida nesses casos?
15
Prática 3 – Observação microscópica de protistas e algas
Os protistas compreendem os microrganismos eucariotos fototróficos e não

fototróficos, caracterizando-se pela possível capacidade de locomoção por cílios e
flagelos. As algas, por sua vez, possuem uma parede celular rígida, composta
principalmente por celulose, realizam fotossíntese e algumas também possuem flagelo.
As algas e os protistas são facilmente visualizados em preparações a fresco e muitos deles
podem ser visualizados utilizando-se as objetivas de menor aumento (4 e 10 X). O protista
Paramecium, por exemplo, apresenta 200 μm de comprimento.
Os Oomicetos se assemelham morfologicamente aos fungos, porém são
filogeneticamente distintos desse grupo, apresentando várias características bioquímicas
e moleculares diferentes, sendo classificados como Protistas. Microrganismos aquáticos
apresentam esporos flagelados, hifas não septadas e reprodução assexuada por zoósporos.
Na reprodução sexuada, ocorre a formação de um esporo de parede espessa chamado
oósporo. Ao contrário dos fungos, a parede celular dos Oomicetos apresenta pequena
quantidade (< 1%) ou ausência de quitina. Em vez disso, observa-se a presença de
celulose e uma alta proporção de outras β-glucanas, contendo também o aminoácido
hidroxiprolina. Estes organismos atuam na natureza como decompositores de matéria
orgânica e parasitas de plantas e animais.
Nesta aula serão preparadas lâminas a fresco de amostras contendo algas e
protistas. Será observada a dimensão dos microrganismos, a diversidade das células
microbianas quanto ao tamanho e à forma, assim como a ocorrência ou não de motilidade.
Também, serão visualizadas lâminas permanentes de Oomicetos (Estramenópilos).
Objetivos
1- Manusear adequadamente em microscópio óptico;
2- Distinguir, morfologicamente protistas e algas (ATENÇÃO: células clorofiladas
podem ser cianobactérias ou protistas clorofilados);
3- Preparar lâminas a fresco;
4- Observar lâminas permanentes de Oomicetos.
16
Materiais
Microrganismos: Amostras de água estagnada, suspensão de solo ou amostras de líquido
ruminal. Lâminas permanentes de Oomicetos.
Meios e Soluções: Solução de azul de metileno.
Equipamentos e utensílios: Microscópio ótico, lâminas, lamínulas e pipetas Pasteur,
alça de platina.
Procedimento
1- Protistas e algas- Colocar uma gota da suspensão utilizando uma pipeta Pasteur em
uma lâmina.
2- Encostando uma das bordas da lamínula na gota, deixe-a descer suavemente para evitar
a formação de bolhas de ar entre a lâmina e a lamínula.
3- Manuseie corretamente o microscópio ótico.
Atenção: Se você tem dúvida quanto à utilização do equipamento, pergunte ao professor

como usá-lo. Não levante a platina do microscópio (movimentando o macrométrico) com
a objetiva de maior aumento encaixada!
4- Procure campos onde os organismos exibam motilidade, utilizando os parafusos do

“charriot”.
5- Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina.
6- Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e
desinfetante.
17
Resultados
Observe as diferenças entre os microrganismos focalizados e desenhe-os,
considerando tamanho, forma, motilidade e coloração. Use as representações dos campos
abaixo. NAS PÁGINAS SEGUINTES EXISTEM EXEMPLOS DA MORFOLOGIA DE
PROTISTAS E ALGAS.
Oomicetos
18
Exercícios
1- Cite características de protistas e algas que os distinguem.
2- Quais são as vantagens e as desvantagens da observação de lâminas em preparações a

fresco?
3- Por que os Oomicetos eram classificados, anteriormente, como fungos?
19
MORFOLOGIA DE PROTISTAS
(1) Heteronema (7) Mayorella (13) Blepharisma (19) Zoothamnium
(2) Cercomonas (8) Diffugia (14) Coleps (20) Stylonychia
(3) Codosiga (9) Paramecium (15) Condylostoma (21) Onychodromos
(4) Protospongia (10) Lacymaria (16) Stentor (22) Hypotrichidium
(5) Trichamoeba (11) Lionotus (17) Vorticella (23) Euplotes
(6) Amoeba (12) Loxodes (18) Carchesium (24) Didinium
20
MORFOLOGIA DE ALGAS FLAGELADAS
(1) Euglena (700X) (6) Trachelomonas (1000X) (11) Pyrobotrys (1000X) (16) Dinobyron (1000X)
(2) Euglena (700X) (7) Phacotus (1500X) (12) Chrysococcus (3000X) (17) Peridinium (350X)
(3) Phacus (1000X) (8) Chlamydomonas (1000X) (13) Synura (350X) (18) Ceratium (175X)
(4) Phacus (350X) (9) Carteria (1500X) (14) Pandorina (350X) (19) Gonium (350X)
(5) Lepocinclis (350X) (10) Chlorogonium (1000X) (15) Eudorina (175X) (20) Volvox (100X)
21
MORFOLOGIA DE ALGAS FILAMENTOSAS
(1) Rhizoclonium (175X) (7) Chara (3X) (13) Mougeotia (175X)
(2) Cladophora (100X) (8) Batrachospermum (2X) (14) Spirogyra (175X)
(3) Bulbochaete (100X) (9) Microspora (15) Zygnema (175X)
(4) Oedogonium (350X) (10) Ulothrix (175X) (16) Stigeoclonium (300X)
(5) Vaucheria (100X) (11) Ulothrix (175X) (17) Draparnaldia (100X)
(6) Tribonema (300X) (12) Desmidium (175X)
22
MORFOLOGIA DE ALGAS NÃO FILAMENTOSAS E NÃO FLAGELADAS
23
MORFOLOGIA DE DIATOMÁCEAS
(1) Diatoma (1000X) (7) Nitschia (1500X) (13) Synedra (175X) (19) Asterionella (175X)
(2) Gomphonema (175X) (8) Pinnularia (175X) (14) Melosira (750X) (20) Asterionella (750X)
(3) Cymbella (175X) (9) Cyclotella (1000X) (15) Surirella (350X) (21) Navicula (750X)
(4) Cymbella (1000X) (10) Tabellaria (175X) (16) Stauroneis (350X) (22) Stephanodiscus (750X)
(5) Gomphonema (2000X) (11) Tabellaria (1000X) (17) Fragillaria (750X) (23) Meridion (750X)
(6) Cocconeis (750X) (12) Synedra (350X) (18) Fragillaria (750X)
24
MORFOLOGIA DE CIANOBACTÉRIAS
Obs: CIANOBACTÉRIAS SÃO PROCARIOTOS.
(1) Anabaena (350X) (7) Microcoleus (350X) (13) Entophysalis (1000X) (19) Rivularia (175X)
(2) Anabaena (350X) (8) Phormidium (350X) (14) Gomphosphaeria (1000X) (20) Anacystis (700X)
(3) Anabaena (175X) (9) Oscillatoria (175X) (15) Gomphosphaeria (350X) (21) Anacystis (175X)
(4) Nodularia (350X) (10) Aphanizomenon (175X) (16) Agmenellum (700X) (22) Anacystis (700X)
(5) Cylindrospermum (175X) (11) Lyngbya (700X) (17) Agmenellum (175X)
(6) Arthrospira (700X) (12) Tolypothrix (350X) (18) Calothrix (350X)
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STRAMINIPILA – FILO OOMYCOTA
Características gerais
→ “Hifas” não septadas
→ Reprodução assexuada: Zoósporos
→ Reprodução sexuada: Oósporos
26
Prática 4 – Isolamento de fungos filamentosos e morfologia de micélios e leveduras
Parte 1: Isolamento de fungos filamentosos: saprófitas e fitopatogênicos
Os fungos filamentosos encontram-se amplamente distribuídos na natureza,

proliferando como saprófitas, parasitas ou como simbiontes. São heterotróficos,
multicelulares, geralmente aeróbios e apresentam reprodução assexuada e sexuada. Como
saprófitas, degradam a matéria orgânica, transformando-a em formas químicas simples
que retornam ao solo. Se por um lado, os fungos saprófitas são úteis na reciclagem da
matéria orgânica, por outro, podem causar a deterioração de alimentos, tecidos vegetais
e ambientes. Como parasitas, causam doenças em vegetais e animais, inclusive no
homem. Os fungos podem atuar ainda em associações simbióticas de grande importância,
como as associações com outros organismos, tais como as algas, formando os liquens, ou
com raízes das plantas, formando as micorrizas.
Antes de estudarmos o efeito do ataque de fungos em materiais diversos, é
geralmente necessário isolá-los, tanto para sua identificação como para determinar seus
requerimentos nutricionais e seus produtos metabólicos. Os métodos usados para o
isolamento de fungos e seu cultivo dependem muito do seu habitat natural. Geralmente,
empregam-se meios sólidos acidificados, com pH em torno de 4 a 5, com o objetivo de
inibir o crescimento de bactérias. Para o isolamento de fungos saprófitas do solo ou de
alimentos, pode-se utilizar os métodos de diluição ou estrias em superfície de meio sólido.
Para isolamento de fungos parasitas de vegetais, os métodos variam de acordo com o
fungo e com o tipo de lesão. Na maioria das vezes, a inoculação é feita transferindo-se
fragmentos do tecido atacado para meio de cultura próprio, como, por exemplo, o BDA
(batata-dextrose-ágar) ou então, utilizando o substrato natural (sementes, cascas de frutas,
tecidos vegetais, etc). As placas são incubadas e o isolamento é feito com base em placas
que apresentarem um número pequeno de colônias dispersas.
Nessa aula será realizado o isolamento de fungos filamentosos a partir de material
vegetal e corpos de frutificação de fungos filamentosos (cogumelos)
Objetivos
1- Treinar em técnicas para o isolamento de fungos filamentosos;
2- Reconhecer os diferentes modos de vida dos fungos na natureza
27
Materiais
Amostras: Frutas e vegetais em decomposição, folhas com fungos fitopatogênicos.
Meios e Soluções: Tubos com solução salina esterilizada, meio BDA (Batata Dextrose
Ágar), álcool 70 %, Hipoclorito 0,5 %.
Equipamentos e utensílios: incubadora, pinça, tubos de ensaio, Placas de Petri estéreis
e placas com BDA, alça de platina, alça de Drigalsky, pipetas, pipetadores, papel de filtro
e estilete
Procedimento
Isolamento de fungos filamentosos saprófitas
Isolamento de fungo saprófita a partir de material vegetal em decomposição.
1- Recolher com alça de platina esporos ou micélio de alimentos em decomposição.
2- Diluir a amostra em solução salina esterilizada.
3- Transferir 0,1 ml da suspensão para superfície do meio BDA.
4- Espalhar o inóculo com alça de Drigalsky.
5- Identificar as placas colocando o nome da amostra, turma e bancada.
6- Incubar a 25 oC por 7 dias ou até a formação visível de colônias.
Isolamento de fungos fitopatogênicos

1- Escolher material em que as lesões sejam recentes, para evitar que microrganismos
saprófitas dificultem o isolamento do patógeno;
2- Lavar o material em água corrente e secar o mesmo em papel absorvente. Cortar o
material vegetal em quadrados de aproximadamente 0,5 cm, tendo o cuidado de incluir
também as partes saudáveis do tecido;
3- Submergir os fragmentos em álcool 70 % por 30 segundos, para quebrar a tensão
superficial e iniciar a descontaminação da superfície do material vegetal;
4- Com uma pinça ou estilete flambado, transferir os quadrados para solução de
hipoclorito de sódio 1 % por 30 segundos;
5- Transferir os fragmentos para água destilada estéril para remover o excesso de
hipoclorito;
6- Em seguida, remover o excesso de água dos fragmentos em papel absorvente estéril
(em placa de Petri);
7- Transferir os fragmentos (4) com uma pinça flambada (com álcool) para a placa de
Petri com BDA. Incubar a temperatura ambiente por 7 dias.
28
Resultados
Avalie o crescimento dos fungos nos meios utilizados, e esquematize as colônias fúngicas
encontradas de cada isolado obtido.
29
Exercícios
1- Porque no isolamento de fungos fitopatogênicos utiliza-se uma amostra contendo parte
da lesão e parte saudável?
2- Como saber se realmente aquele fungo isolado é realmente o causador da doença na

planta?
3- Discuta as diferenças quanto ao modo de vida dos fungos.
30
Parte 2: Morfologia de fungos filamentosos e leveduras
Os fungos são organismos heterotróficos, geralmente aeróbios, de ampla

distribuição no ambiente e que podem se apresentar na forma de fungos filamentosos e/ou
leveduras.
Os fungos filamentosos são caracterizados por distinta estrutura filamentosa,
multinucleada, conhecida como micélio (podendo apresentar-se cotonoso, ou seja, com
aspecto de algodão). O micélio é formado por um conjunto de filamentos ramificados que
se irradiam sobre ou dentro do substrato utilizado como alimento. Cada um desses
filamentos recebe o nome de hifa. A hifa é constituída por uma parede tubular delgada e
transparente, contendo no seu interior o protoplasma. As hifas podem ser cenocíticas, ou
seja, o protoplasma é contínuo, ou septada, quando o protoplasma é interrompido por
paredes transversais denominadas septos.
As leveduras são fungos unicelulares classificadas como ascomicetos ou
basidiomicetos, que se reproduzem vegetativamente por brotamento ou fissão, não
produzindo corpo de frutificação. O termo levedura sempre foi associado à história do
processo fermentativo. O significado da palavra levedura provém do latim “levere” e
significa suspender, referindo-se à produção de gás carbônico durante a fermentação,
levantando a superfície líquida como uma espuma.
As leveduras podem ser classificadas em anamórficas ou mitóticas (reproduzem-
se assexuadamente por brotamento ou fissão) e teleomórficas ou meióticas (reproduzem-
se sexuadamente). Representam um grupo muito heterogêneo de fungos unicelulares, que
diferem amplamente nas características morfológicas e fisiológicas. Em leveduras, a
reprodução assexuada é a forma primária de aumento do número de indivíduos na
população. Há dois modos básicos de reprodução assexuada em leveduras conforme a
espécie: fissão ou brotamento. No primeiro caso (por exemplo, em Schizosaccharomyces
pombe) ocorre mitose nuclear, seguida de simples divisão celular equitativa. No segundo
(por exemplo, em Saccharomyces cerevisiae), paralelamente à mitose nuclear, forma-se
na superfície da célula-mãe uma pequena projeção - o broto - que, à medida que cresce,
engloba material citoplasmático e um dos núcleos resultantes da mitose. Posteriormente,
o broto libera-se da célula-mãe da qual é geneticamente idêntico. Na reprodução sexuada,
duas células haplóides de tipos sexuais diferentes podem se fundir formando uma célula
com dois núcleos que, eventualmente, se fundem, formando um núcleo diplóide. Esse
31
sofre meiose originando quatro núcleos haplóides e, então, quatro novas células se
formarão, cada uma com um dos quatro núcleos haplóides.
A biologia e a biodiversidade de fungos são importantes para a caracterização e
preservação de espécies, principalmente aquelas com potencial para aplicação
biotecnológica. As preparações microscópicas para a observação de fungos são de grande
importância para sua identificação, uma vez que características morfológicas dos micélios
e células (esta aula), juntamente com características dos esporos (próxima aula) são
rotineiramente utilizadas para tal fim.
Objetivos
1- Observar morfologia de fungos filamentosos (micélios) e de colônias de leveduras
2- Diferenciar leveduras de brotamento e fissão e conhecer as estruturas de formação de
ascos e pseudomicélio.
Materiais
Microrganismos: Lâminas de fungos filamentosos, isolados de leveduras que
apresentem reprodução assexuada e sexuada.
Meios e soluções: azul de metileno, água destilada
Equipamentos e utensílios: Microscópio ótico, lâminas, alça de repicagem, bico de
Bunsen, bandejas e suportes para lâminas.
Procedimento
Lâminas de fungos filamentosos
1- Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto à utilização
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize a lâmina de fungo
filamentoso, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;
2- Observe a organização das hifas e a presença ou ausência de septo;
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina;
Lâminas de leveduras
1- Limpe bem uma lâmina com papel;
2- Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen;
32
3- Quando a levedura estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de
repicagem uma gota da cultura de leveduras para o centro da lâmina. Se a cultura estiver
em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: Coloque uma
gota de água destilada ou azul de metileno sobre a lâmina e colete o material
assepticamente, raspando, levemente a superfície do ágar com a alça de repicagem (com
cuidado para não retirar pedaços do meio de cultura, pois o crescimento do
microrganismo ocorre somente na superfície);
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize o material,
sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina;
desinfetante, colocadas na bancada lateral.
33
Resultados
Desenhe as hifas fúngicas (fungos filamentosos), cenocíticas ou septadas, observadas no
microscópio.
Desenhe as estruturas vegetativas e reprodutivas das leveduras observadas no

microscópio.
Observações
Morfologia da Colônia Morfologia das células Tipo de reprodução
34
Prática 5 – Esporos fúngicos assexuados e sexuados
A reprodução sexuada em fungos pode ocorrer de várias maneiras. Os esporos

sexuados são formados pela fusão de duas células (gametas), pelo processo denominado
plasmogamia, que reúne dois núcleos em um único citoplasma. A etapa seguinte é a
fusão desses dois núcleos, no processo denominado cariogamia, com a formação de um
núcleo diplóide. A terceira etapa, meiose ou divisão redutora separa o núcleo diplóide em
núcleos haplóides, que são posteriormente delimitados por uma membrana e parede
celular, dando origem aos esporos haplóides. Como regra geral, os esporos sexuados são
produzidos menos frequentemente e em menor número do que os esporos assexuados. Há
quatro tipos de esporos sexuados de fungos: Zigósporos, Oósporos, Ascósporos e
Basidiósporos. Quando estes são formados dentro de estruturas em forma de saco,
conhecidas como ascos, os esporos recebem a denominação de ascósporos, e os fungos
são incluídos na divisão Ascomycota. Tais esporos são frequentemente encerrados em
um corpo de frutificação, denominado ascocarpo. Os tipos básicos de ascocarpo são:
Cleistotécio, Peritécio, Apotécio, Ascostroma. Os esporos sexuados dos fungos
pertencentes à divisão Basidiomycota se desenvolvem em estruturas em forma de clava,
os basídios. Esses esporos são denominados basidiósporos e geralmente ocorrem em
número de quatro por basídio. Quando maduros, os basidiósporos localizam-se na parte
externa dos basídios, sobre os esterigmas. Em muitas espécies, os basídios e seus
basidiósporos se organizam em corpos de frutificação altamente complexos,
denominados basidiocarpos, conhecidos popularmente por cogumelos, orelhas-de-pau e
bufos.
As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema
importância, uma vez que a sua identificação depende, em grande parte, da observação
de características morfológicas, como o tipo de micélio e de esporos sexuados e
assexuados. A classificação dos fungos filamentosos baseia-se, principalmente, no tipo
de micélio vegetativo que o fungo apresenta, isto é, cenocítico ou apocítico, e na presença
de estruturas de reprodução sexuada e assexuada.
A seguir são dadas algumas características das divisões que serão abordadas nesta
aula prática.
35
Reino Fungi - Filos
Chytridiomycota - Essa divisão apresenta cerca de 1.000 espécies e são considerados os

fungos mais basais. A parede celular é composta de quitina e glucanas (polímeros de
glicose). Somente os quitrídios, apresentam zoósporos flagelados e móveis. Comuns em
solos úmidos e no rúmen de animais. Esse filo, juntamente com a Zygomycota, tem sido
um dos principais alvos de novas propostas de classificação.
Zygomycota - Os fungos pertencentes a esse filo caracterizam-se por produzir esporos

assexuados endógenos, formados em estruturas chamadas de esporângios. A hifa que
sustenta o esporângio é denominada esporangióforo. Ex: Mucor, Rhizopus
Glomeromycota - São fungos de extrema importância econômica, uma vez que

apresentam associação simbiótica obrigatória com plantas, por meio de estruturas
conhecidas como arbúsculos, sendo, por isso, conhecidos como fungos micorrízicos
arbusculares. Ex: Glomus.
Ascomycota - Apresentam micélio com hifas septadas e a característica que os distingue

dos outros fungos é a presença de estrutura chamada asco, que se apresenta na forma de
saco, contendo número definido de ascósporos (normalmente oito), resultantes dos
processos de plasmogamia, cariogamia e meiose. Em geral, os ascomicetos produzem
seus ascos e ascósporos em corpos de frutificação, denominados ascocarpos. Alguns
fungos classificados anteriormente como deuteromicetos foram re-classificados e
atualmente pertencem ao filo Ascomycota. Além dos fungos filamentosos, encontram-se
nesse grupo muitas espécies de fungos leveduriformes. Ex: A levedura Sacharomyces
cerevisiae, Aspergillus, Penicillium.
Basidiomycota - São popularmente conhecidos como cogumelos, bufos, orelhas-de-pau,

ferrugens, carvões, etc. Os basidiomicetos diferem dos outros fungos por produzirem seus
esporos sexuais (basidiósporos) em estruturas denominadas basídios. Os basidiósporos
também são resultantes de plasmogamia, cariogamia e meiose. O seu corpo de
frutificação é denominado basidiocarpo. Nesse grupo também estão algumas espécies de
fungos classificados anteriormente como deuteromicetos que foram re-classificados na
divisão Basidiomycota. Ex: Pleurotus, Agaricus e algumas leveduras.
36
Objetivos
Observar as estruturas mais importantes para a identificação de alguns fungos, com ênfase
nas estruturas que caracterizam cada divisão, como tipo de esporo e estrutura onde os
esporos são formados. Atente para o tipo de hifa, cenocítica ou septada (como visto na
aula passada), pois também é uma característica importante para a classificação.
Materiais
Amostras: Lâminas prontas (permanentes) de fungos filamentosos e/ou suas estruturas
reprodutivas.
Meios e Soluções: lactofenol ou azul de metileno.
Equipamentos e utensílios: microscópios.
Procedimento
Visualizar lâminas permanentes de fungos filamentosos, da seguinte maneira:
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize a lâmina de fungo
filamentoso, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;
2- Observe a organização das hifas e a presença ou ausência de septo (quando possível);
3- Observe as estruturas reprodutivas;
menor aumento, passando pela objetiva de 10X e abaixe a platina.
37
Resultados
Desenhe as estruturas observadas nas lâminas de fungos filamentosos.
Filo Zygomycota
Filo Glomeromycota
38
Filo Ascomycota - Reprodução sexuada
Filo Ascomycota - Reprodução assexuada
39
Filo Basidiomycota - Reprodução sexuada
40
Exercícios
1- Descreva as etapas da reprodução sexuada em fungos.
2- O que são corpos de frutificação?
3- Complete o quadro abaixo dando as principais características dos filos do reino Fungi.
Filo Micélio Tipo de Exemplo de Importância

esporo Gênero
Chytridiomycota
Zygomycota
Glomeromycota
Ascomycota
Basidiomycota
41
REINO FUNGI
CARACTERÍSTICAS GERAIS DE FUNGOS
Micélio: conjunto ou emaranhado de hifas

Crescimento radial: formação de colônia fúngica
Hifas: filamento tubular microscópico
Tipos de hifas:
-Hifas septadas
-Hifas não septadas
Esporo: unidade reprodutiva.

Tamanho, forma e cores variadas
42
Filo Zigomycota
→ Hifas não septadas
→ Reprodução assexuada: esporangiósporos ou aplanósporos
→ Reprodução sexuada: zigósporo
Ex: Rhizopusstolonifer
Zigósporo
43
Filo Glomeromycota
Fungos endomicorrízicos
Estruturas: arbúsculos, vesículas e esporos

Micorriza: associação simbiótica entre fungos filamentosos e raízes de plantas
Segmento de raiz colonizado por Glomusmosseae.
Raiz clarificada com KOH e corada com azul de tripan para destacar o tecido fúngico.
Esporos: Gigaspora margarita (esporos claros/médios), Dentiscutata heterogama

(esporos marrons/menores) e Gigaspora gigantea (esporos amarelos/maiores).
Azigósporo de Scutellospora gregaria
Hifa de sustentação Azigósporo de Acaulospora morrowae
44
Filo Ascomycota
→ Hifas septadas
→ Reprodução sexuada: ascósporo
→ Reprodução assexuada: conídios
→ Corpos de frutificação: Peritécio, Apotécio, Cleistotécio e Ascostroma
Peritécio
Peritecio Cleistotécio
Cleistotécio
Apotécio tipo taça Apotécio tipo Morel

p (Morchella)
o
t
é
c
i
o
t
i
p
o
t
a
ç
a
45
Alternaria
Conidióforos pigmentados, normalmente curtos ou alongados, produzindo em cadeia
simples ou ramificada de conídios. A forma do conídio é variável, grosseiramente elíptica
a ovalada. Causa a pinta preta do tomateiro e da batata.
Aspergillus
Conidióforos longos terminando em projeção tipo clava, lembrando baquetas. Da
projeção irradiam-se fiálides, dispostas em camada simples ou dupla, das quais se
projetam cadeias de conídios esféricos. Massa de conídios pode apresentar coloração
variada. São saprófitas comuns em produtos armazenados. Alguns podem produzir
toxinas
46
Cladosporium
Conidióforos escuros ramificando-se vigorosamente no topo ou acima da porção
mediana. Forma variável: oval, cilíndrica ou irregular. Causa queima em curcubitáceas.
Colletotrichum
Acérvulos circulares, conidióforo simples. Conídios hialinos, ovais, a oblongos ou
falcados. Massa de conídios com coloração rósea. Podem estar presentes no acérvulo
setas longas, septadas e pigmentadas. Causa antracnose em vários hospedeiros
Curvularia
Conídios escuros geralmente com três septos transversais, curvos em ângulo. Os
segmentos internos são normalmente maiores e mais pigmentados que os dois extremos.
Causa mancha de folha de milho
47
Fusarium
Conidióforos hialinos de forma variável simples ou ramificados, neste caso curtos e
irregulares ou terminando em tufos de fiálides. Conidióforos isolados ou reunidos em
esporodóquio. Macroconídio com vários septos transversais, levemente curvos,
lembrando uma canoa. Microconídios sem septos e hialinos. As diferentes espécies
causam diferentes doenças em plantas.
Nigrospora
Conidióforos curtos, com septos e inter-septos mais ou menos dilatados, normalmente
pigmentados. Conídio esférico e negro localizando-se em uma vesícula situada no ápice
do conidióforo.
Penicillium
Conidióforos longos, ramificando-se na parte terminal. Conídios esféricos e catenulados
produzidos em fiálides dispostas em número variável na ramificação terminal do
conidióforo (conjunto lembra uma vassoura). Massa de conídios com coloração
esverdeada. Causa podridão em frutos cítricos.
Pestalotiopsis
48
Conídios com 4 septos transversais, apresentando três secções intermediárias
pigmentadas e as duas das extremidades, hialinas
49
Filo Basidiomycota
→ Hifas septadas
→ Reprodução sexuada: basidiósporo
→ Reprodução assexuada: conídios
Basidiósporos
50
Agaricus bisporus Lentinula edodes
(Champignon) (Shiitake)
Pleurotus ostreatus Pleurotus pulmonarius

(Shimeji) (Hiratake marrom)
Boletus edulis Rubroboletus satanas

(cogumelo silvestre comestível) (cogumelo silvestre venenoso)
51
MORFOLOGIA DE COLÔNIAS DE LEVEDURAS
Características macroscópicas
Saccharomyces cerevisiae Pichia Arxulaadeninivorans

Pichia
Torulaspora delbrueckii Saccharomyces kluyveri Candida albicans Kluyveromyces lactis
52
Características microscópicas
Reprodução Assexuada: Brotamento
Reprodução assexuada: fissão

e
p
r
o
d
u
ç
ã
o
s
Formação de pseudomicélio: e
x
u
a
d
a
:
a
s
c
ó
53
s
p
(Dias & Schwan, 2010)
Fotomicrografias de células de leveduras (parte inferior): a) células elipsóides de

Kluyveromyces marxianus (microscopia eletrônica de varredura – MEV); b) Ascósporos de
Saccharomyces cerevisiae (microscópio ótico, MO, 400x); c) células globosas de S.
cerevisiae (MEV); d) células globosas de S. cerevisiae em brotamento unipolar (MO,
400x); e) células globosas de S. cerevisiae em brotamento multipolar (MO 400); f) células
cilíndricas de Schizosaccharomyces pombe em fissão (contraste de fase, 100 x). Dias &
Schwan, 2010.
54
Prática 6 – Isolamento e enumeração de microrganismos
Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre, sob

forma de populações mistas. Assim sendo, para que seja possível estudar as características
das espécies que compõem estas misturas, é necessário fazer seu isolamento em cultura
pura. Uma porção representativa da amostra é transferida, com assepsia, para meio de
cultura sólido (ágar) em placas de Petri. Células microbianas contidas na amostra,
suficientemente separadas, são imobilizadas no gel de ágar contendo nutrientes e se
multiplicam, formando um agregado de células idênticas denominado de colônia.
Cultura pura é aquela em que todos os indivíduos se originaram a partir de uma única
célula e são mantidas geneticamente idênticas. Quando uma cultura é formada por células
de uma mesma espécie, porém, não necessariamente geneticamente idênticas, diz-se que
essa cultura é axênica. Na prática, é muito difícil manter uma cultura pura, por causa das
mutações que ocorrem numa população elevada de bactérias. Por isso, normalmente uma
cultura inicialmente pura será, ao final do tempo de crescimento, uma cultura axênica.
Apesar disso, é comum nos referirmos a essas culturas como sendo puras, pelo fato de
terem sido obtidas a partir de uma única célula. Os estudos microbiológicos e suas
aplicações são efetuados com a população dos microrganismos e não com uma única
célula, sendo somente válidos se realizados com culturas puras.
Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura
pura, as mais comumente utilizadas são a técnica de esgotamento e a técnica das diluições
em placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que,
quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter
células individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras.
As técnicas utilizadas são: i- de esgotamento do inóculo (estrias); ii- técnica de semeadura
por espalhamento (alça de Drigalsky – “Spread Plate”) e, iii- técnica de semeadura em
profundidade (“pour-plate”). Normalmente, numa população microbiana mista, a
concentração de microrganismos é bastante elevada, sendo necessário fazer diluições
sucessivas quando se deseja fazer a contagem em placas e determinar a população viável
na amostra. Para isso, realizam-se quantas diluições forem necessárias para que cresça na
placa de Petri um número final de colônias entre 30 e 300, o que facilitará a contagem e
a estimativa da população microbiana presente. Nesse caso, também, o espalhamento não
deve ser feito por meio de estrias, mas aplicando-se uma pequena alíquota conhecida
(normalmente 0,1 mL) sobre a superfície do meio sólido e espalhando-se com alça de
55
Drigalsky (“Spread Plate”). Outra opção é a utilização da técnica “Pour Plate”, na qual
aplica-se primeiro a alíquota (normalmente 1 mL) e, depois verte-se o meio liquefeito e
resfriado a 50 oC, fazendo-se movimentos rotatórios até que a suspensão de células fique
bem distribuída no meio de cultura. O resultado será expresso como UFC (Unidades
Formadoras de Colônias) por mililitro da amostra.
Nesta aula prática será realizado o procedimento de isolamento e enumeração de
microrganismos, por meio do método de diluição em placas.
Objetivos
1- Realizar diluições seriadas de culturas microbianas ou amostras de solo, para
plaqueamento e contagem de colônias, expresso em UFC/mL ou g (Unidades Formadoras
de Colônias por mililitro ou grama) da suspensão ou amostra de solo original;
2- Executar rotina de plaqueamento.
Materiais
Meios e culturas: Ágar nutriente fundido, culturas de bactéria ou amostras de solo,
Equipamentos e utensílios: Placas de Petri estéreis, bico de Bunsen e alças de
repicagem, pipetas para inoculação, tubos de ensaio com 9 mL de solução salina estéril,
agitador do tipo vortex para homogeneizar as diluições.
Procedimento
Contagem de microrganismos pelo método das diluições em placas
1- A partir da suspensão de cultura bacteriana ou obtida de amostras de solo, realizar
diluições sucessivas, de 10-1 até 10-6, da seguinte maneira: transferir 1 mL da suspensão
original para tubo contendo 9 mL de solução salina estéril. Homogeneizar. Essa é a
diluição 10-1. A partir desse tubo repetir o procedimento para obter os tubos com as
diluições 10-2, 10-3, e assim sucessivamente até 10-6;
2- A partir da diluição 10-4, proceder a inoculação de 0,1 mL em placa de Petri contendo
meio Ágar Nutriente, em triplicata;
3- Espalhar o inóculo com o auxílio de uma alça de Drigalsky;
4- Incubar as placas a temperatura ambiente durante 24-48 horas. No caso de se desejar
o isolamento de microrganismos que cresçam em temperaturas específicas, será
necessário fazer a incubação em estufas ou incubadoras que permitam o controle da
temperatura.
56
Esquema do procedimento:
Fonte: Adaptado de Microbiologia de Brock Michael T. Madigan ... [et al.], 2016. ISBN 978-85-8271-298-6
57
Resultados
Faça a contagem das colônias obtidas em cada placa, esquematizando os resultados nos
círculos abaixo, e calcule a população total da amostra expressando a contagem em
UFC/mL ou (g):
População total
Grupo Diluição Número de colônias
na amostra
1
2
3
4
5
6
A ESTIMATIVA DA POPULAÇÃO É DADA PELA FÓRMULA:
𝐌é𝐝𝐢𝐚 𝐝𝐨 𝐧ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐥ô𝐧𝐢𝐚𝐬 𝐩𝐨𝐫 𝐩𝐥𝐚𝐜𝐚 𝐱 𝐅𝐚𝐭𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐝𝐢𝐥𝐮𝐢çã𝐨

𝐔𝐅𝐂/ 𝐦𝐋 𝐨𝐮 𝐠 =
𝐕𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞 𝐝𝐚 𝐚𝐥𝐢𝐪𝐮𝐨𝐭𝐚
Note que:
Diluição = alíquota/volume final. Exemplo: alíquota de 1 mL adicionada a um tubo
contendo 9 mL. Neste caso, o volume final será de 10 mL, portanto, a diluição será 1/10
= 10-1.
Fator de diluição = 1/volume da alíquota. Exemplo: alíquota de 0,1 mL, o fator de diluição
será 1/0,1 = 10. Se a alíquota for de 1 mL, como ocorre, por exemplo na técnica do
derramamento, o resultado será 1 e, portanto, nada mudará no resultado final.
58
Exercícios
1- Por que os meios sólidos são preferidos para o isolamento dos microrganismos?
2- Por que, ao realizarmos contagem em placas, consideramos somente aquelas onde

tenham sido formadas entre 30 e 300 colônias?
3- Qual é a finalidade das diluições seriadas, efetuadas durante o procedimento de

enumeração de microrganismos?
4- Em uma amostra de água contendo 108 cels/mL, qual seria a diluição necessária de
modo que a estimativa de contagem na placa final seja de 100 colônias?
5- Com base no esquema abaixo, responda:
a) Qual a diluição em cada etapa (A-F)?

b) Qual a diluição total em cada uma das etapas (A-F)
59
Prática 7 – Obtenção de culturas puras: estrias simples e compostas
Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura

pura, as mais comumente utilizadas são a técnica do esgotamento e a técnica das diluições
em placas. O isolamento em meio de cultura com ágar baseia-se no princípio de que
quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter
células individuais que crescem em colônias completamente separadas umas das outras.
As técnicas utilizadas são a de esgotamento do inóculo (estrias) e a técnica semeadura por
espalhamento (“Spread Plate”) e semeadura em profundidade (“Pour Plate”).
Nesta aula prática, será realizado o procedimento para obtenção de cultura pura
pelo método do esgotamento do inóculo em superfície de ágar, utilizando estrias simples
ou compostas.
Objetivo:
Realizar a técnica de isolamento/purificação por estrias simples e compostas de isolados
obtidos na aula anterior.
Meios de cultivo e culturas: Ágar Nutriente liquefeito; cultura de bactérias em placa e

meio líquido.
Equipamentos e utensílios: Placas de Petri com Ágar Nutriente, bico de Bunsen e alças
de repicagem.
Procedimento:
1- Esterilize a alça de repicagem e espere esfriar atrás da chama;
2- Transfira assepticamente a suspensão bacteriana contida na alça de repicagem para a
superfície do meio de cultura;
3- Espalhe conforme uma das técnicas: estria simples ou estria composta;
4- Flambe novamente a alça, deixe-a esfriar no suporte;
5- Incube as placas em posição invertida, a temperatura ambiente, por 24 horas. Observe
o crescimento de colônias isoladas.
60
61
Resultados
Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa estriada.
Exercício
1 - Indique uma colônia que você selecionaria para o isolamento. Se você não obteve uma
colônia isolada, sugira as possíveis razões para essa falha e o que faria para corrigi-la.
62
Prática 8 – Preparações microscópicas fixadas (coloração de Gram) e
Antibiograma
Parte 1: Coloração diferencial de Gram
Preparações microscópicas fixadas e coradas são úteis para visualizar os

microrganismos e diferenciá-los em grupos, para fins de diagnóstico ou de estudos de
suas propriedades. Existem várias técnicas de preparação, desde as mais simples, como
as preparações a fresco sem coloração, até as que exigem maiores cuidados na montagem,
como é o caso das preparações fixadas e coradas. Nas preparações a fresco, em geral, são
utilizados corantes que não comprometem a vitalidade das células (não tóxicos). O uso
de compostos orgânicos coloridos ou corantes facilita a observação de células de
microrganismos. Existem corantes que se ligam a elementos químicos específicos da
célula microbiana, corantes que fluorescem, que mudam de cor na presença de reações
químicas e corantes que facilitam a visualização. Em geral, os microbiologistas usam
preparações coradas para mostrar as diferentes estruturas de microrganismos, para
identificar suas estruturas internas e para ajudar a identificar microrganismos similares.
Corante é geralmente um sal, em que um dos íons é um cromóforo. Se o cromóforo é
positivo, o corante é básico ou catiônico, como por exemplo, o azul de metileno, o cristal
violeta e a fucsina. Se o cromóforo é negativo, o corante é ácido ou aniônico, como por
exemplo, o ácido pícrico. Corantes básicos são ideais para corar bactérias, porque os
ácidos nucléicos e alguns componentes da parede celular apresentam carga negativa e
atraem os cromóforos catiônicos. Nas técnicas de coloração simples, células microbianas
são inicialmente espalhadas sobre a lâmina, formando um esfregaço; em seguida, são
fixadas pelo calor e coradas com um único corante. Essa técnica é útil para visualizar a
forma (cocos, bacilo ou espirilo) e o arranjo de células bacterianas. Algumas estruturas
internas das células também podem ser visualizadas, como grânulos metacromáticos
(polifosfato) e de glicogênio.
A técnica de coloração diferencial requer o uso de, pelo menos, três reagentes
químicos, aplicados sequencialmente sobre o esfregaço fixado. O primeiro reagente é um
corante que confere cor a todas as células; o segundo reagente é um descolorante, que
pode ou não remover completamente o primeiro corante da célula ou de algumas de suas
estruturas. As estruturas descoloradas podem adquirir a cor de um segundo corante,
denominado de corante de contraste. Assim, grupos de células ou suas estruturas podem
63
ser diferenciados, com base no corante que é retido. Técnicas de coloração diferencial
permitem não só a visualização de estruturas como flagelo, cápsula, esporo e núcleo, mas
também a separação de microrganismos em grupos. A técnica diferencial mais importante
em bacteriologia é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois grandes grupos,
Gram-positivo e Gram-negativo, sendo importante para o diagnóstico e classificação das
bactérias. A coloração de Gram envolve a aplicação de quatro soluções, conforme
descrito a seguir.
Cristal violeta (CV), primeiro corante que cora as células de roxo escuro.
Lugol ou solução de Iodo (I), é a segunda solução, um mordente que aumenta a
interação entre a célula bacteriana e o primeiro corante, formando um complexo
insolúvel, Cristal violeta-Iodo (CV-I).
Álcool, a terceira solução, é um descolorante. As bactérias Gram positivas, quando
lavadas com descolorante, retêm o complexo CV-I e as bactérias Gram negativas perdem
o complexo CV-I, ficando incolores. A ação do álcool com removedor do complexo CV-
I da célula depende da concentração de lipídeos e da espessura da parede celular
bacteriana.
O último reagente é o corante de contraste, Safranina ou Fucsina, diferente da cor do
cristal-violeta, corando as bactérias Gram-negativas de rosa-avermelhado, mas não altera
a cor roxo-escura (azulada) das bactérias Gram-positivas.
Objetivos
1- Realizar a técnica de coloração diferencial de Gram e porterior visualização em
microscópico;
2- Diferenciar bactérias de acordo com sua a forma e arranjo predominante, além da
resposta a coloração de Gram.
Materiais
Microrganismos: Cultura de bactérias em meio líquido ou sólido.
Meios e Soluções: Fucsina ou safranina, cristal violeta, água destilada.
Equipamentos e utensílios: Microscópio ótico, lâminas, alça de repicagem, bico de
Bunsen, bandejas e suportes para lâminas.
64
Procedimento
1- Limpe bem uma lâmina com papel toalha ou higiênico. Nunca passe sobre a chama.
Deixe-a sobre um papel na bancada.
2- Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen e espere
esfriar;
3- Quando a bactéria estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de
repicagem uma gota da cultura de bactérias para o centro da lâmina. Se a cultura estiver
em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: Coloque uma
gota de água destilada sobre a lâmina e colete o material assepticamente, raspando,
levemente a superfície do ágar com a alça de repicagem (com cuidado para não retirar
pedaços do meio de cultura, pois o crescimento do microrganismo ocorre somente na
superfície);
4- Prepare o esfregaço, espalhando a suspensão com a alça de repicagem;
5- Deixe o esfregaço secar ao ar. Nunca passe a lâmina ainda úmida sobre o fogo do bico
de Bunsen.
6- Fixe o esfregaço três vezes, passando o lado oposto ao esfregaço acima da chama do
bico de Bunsen. Evite o aquecimento excessivo, para não queimar e distorcer as células;
7- Deixe a lâmina esfriar;
8- Inicie a coloração de Gram.
Respeite o tempo indicado para cada reagente!
9- Cubra o esfregaço com Cristal Violeta, deixando em repouso por 1 minuto; em seguida,
utilizando a piseta, lave com água destilada, gotejando sempre acima do esfregaço e não
diretamente sobre o mesmo;
10- Cubra com solução de Lugol, por um minuto. Lave a preparação, utilizando a piseta
com água destilada (evite jato de água sobre o esfregaço, para não o desprender);
11- Lave a lâmina com etanol 95 %, rapidamente, até que não se desprenda mais corante
da preparação;
12- Lave o excesso de álcool com água;
13- Cubra o esfregaço com solução de Fucsina, durante 30 segundos;
14- Lave a lâmina com água. Em seguida deixe secar ao ar.
15- Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto a utilização
do equipamento, pergunte ao professor como usá-lo).
Focalize o material corado, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;
65
16- Trave o microscópio; adicione uma gota de imersão sobre o esfregaço e visualize com
a objetiva de 100X, usando o micrométrico.
17- Terminada a observação, desligue a luz, gire o revólver para encaixar a objetiva de
menor aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina.
desinfetante, colocadas na bancada lateral.
Preparo de lâminas (esfregaço)
66
Coloração diferencial de Gram
67
Resultados
Desenhe os campos observados, fazendo distinção entre a forma e o arranjo das bactérias.
Bactéria Gram Forma Arranjo

predominante
1
2
3
68
Exercícios
1- Qual é o propósito da fixação do esfregaço pelo calor?
2- Cite vantagens e desvantagens da preparação microscópica fixadas e coradas.
3- Por que os corantes básicos são ideais para corar bactérias?
4- Por que a coloração de Gram é importante em microbiologia?
5- Qual é a importância da solução de Lugol (iodo) na coloração de Gram?
6- Qual a função do álcool na técnica de coloração de Gram?
69
Parte 2: Antibiograma
Os antibióticos são metabólitos produzidos por microrganismos, que mesmo em

baixas concentrações, exibem capacidade de ocasionar morte ou inibição do crescimento
de outros microrganismos. De modo geral, fungos e actinobactérias (além de outras
bactérias) são considerados os principais produtores de antibióticos, porém, ampla faixa
desses compostos pode também ser sintetizados quimicamente e alterados em
laboratórios farmacêuticos a fim de se evitar resistências e/ou diminuir efeitos colaterais.
O primeiro antibiótico identificado foi a penicilina. Alexander Fleming, médico

microbiologista conduzia pesquisas sobre substâncias capazes de matar ou impedir o
crescimento de bactérias nas feridas infectadas de combatentes da Primeira Guerra
Mundial (1914 – 1918), que morriam em consequência dessas infecções. Em 1928
Fleming descobriu a penicilina ao observar halos de inibição de crescimento em culturas
de estafilococos contaminadas por fungos, o que parecia indicar que aquele fungo
produzia uma substância bactericida. O fungo foi posteriormente identificado como
Penicillium, dando origem ao nome penicilina, para a substância por ele produzida. A
aplicação da penicilina em larga escala ocorreu apenas na década de 1940, principalmente
em decorrência da Segunda Guerra Mundial, onde acredita-se ter salvo milhares de vidas.
Para utilização clínica dos antibióticos é preciso considerar algumas variáveis,

como seletividade, dosagem, efeitos na microbiota intestinal, entre outros. A
determinação laboratorial da seletividade ou resistência de uma dada bactéria a um ou
vários antibióticos é realizada por meio do ensaio chamado antibiograma. O
antibiograma pode ser realizado de duas maneiras: por diluição seriada do antibiótico
em tubos ou placas ou pelo método de difusão em meio sólido, também conhecido como
método de Kirby-Bauer. Por conta da praticidade, este último método é o mais utilizado.
Utiliza-se discos de papel de filtro impregnados com doses conhecidas do antibiótico a
ser testado, que são colocados em contato com a cultura bacteriana de interesse, na
superfície do meio. A placa é incubada nas condições específicas de crescimento da
bactéria e a susceptibilidade ou resistência ao antibiótico é avaliada por meio da aferição
do diâmetro de halos de inibição em torno dos discos.
70
Objetivos
1- Demonstrar a atividade antimicrobiana de alguns antibióticos;
2- Realizar o teste de antibiograma pelo método de difusão em meio sólido (método de
Kirby-Bauer), para determinar a sensibilidade de bactérias a alguns antibióticos.
Materiais
Meios e culturas: Placas de Petri contendo ágar nutriente; culturas de bactérias obtidas
na aula anterior.
Reagentes: discos de papel de filtro contendo diferentes antibióticos.
Procedimento
1- Transfira, assepticamente, 0,1 mL da suspensão de células para as placas contendo
meio sólido. Espalhe a alíquota uniformemente sobre o meio de cultura, com o auxílio da
alça de Drigalsky, previamente flambada com álcool.
2- Transfira, de forma asséptica, os discos de papel contendo os antibióticos para a
superfície do meio de cultura previamente inoculado com a bactéria. Utilize uma pinça
previamente flambada para realizar esse procedimento.
3- Incube as placas a 37 oC, por 16 a 18 h.
4- Observe o crescimento da bactéria nas placas, identificando os halos de inibição em
torno do disco de papel. Com o auxílio de uma régua, registre o diâmetro (mm) dos halos
no quadro disponível nos Resultados.
5- Compare os resultados obtidos com o quadro de referência abaixo (Quadro 1), e avalie
se a bactéria é sensível ou resistente a cada um dos antibióticos testados.
Quadro 1 – Avaliação do diâmetro de halo de inibição de diferentes antibióticos

Diâmetro do halo de inibição (mm)
Concentração
Antibiótico Resistente Faixa Sensível
no disco (µg)
< ou = intermediária > ou =
Ampicilina 10 11 12-13 14
Canamicina 30 13 14-17 18
Cloranfenicol 30 12 13-17 18
Estreptomicina 10 11 12-14 15
Gentamicina 10 12 13-14 15
Ácido
30 13 14-18 19
Nalidíxico
71
Resultados
Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa. Indique os discos de
antibióticos e as zonas de inibição se foram observadas.
Exercício
1- Existem diferenças do modo de ação dos antibióticos contra bactérias Gram positivas
e Gram negativas?
2- Quais os principais mecanismos de ação dos antibióticos sobre as células microbianas

e como isso influencia no espectro de ação?
3- Cite os principais microrganismos produtores de antibióticos. Dê exemplos de alguns

gêneros.
72
Prática 9 – Metabolismo microbiano: fermentação alcoólica
Metabolismo pode ser definido como o conjunto de todas as reações químicas

que ocorrem dentro de um organismo vivo e pode ser dividido em duas classes: reações
que liberam energia – catabólicas – e reações que requerem energia – anabólicas. Na
célula microbiana o metabolismo energético pode ocorrer por meio da respiração aeróbia,
respiração anaeróbia ou por fermentação. Na etapa da glicólise, a glicose é parcialmente
oxidada à ácido pirúvico. Na respiração, o piruvato é completamente oxidado durante o
ciclo de Krebs e os elétrons liberados durante o processo são transferidos até um aceptor
final (oxigênio, no caso da aeróbica), por meio de uma cadeia transportadora de elétrons.
Já na fermentação, apenas a via glicolítica está presente e os elétrons gerados reduzem o
piruvato ou outros intermediários metabólicos, formando ácidos orgânicos e álcoois, com
possível liberação de CO2. Esta etapa é essencial para a reoxidação do NAD que foi
reduzido (NADH) durante a glicólise. Na fermentação o ATP é produzido apenas na
glicólise (2 mols de ATP por mol de glicose).
O processo de fermentação alcoólica pode ser avaliado, in vitro, por meio da

detecção indireta da produção de CO2, medindo-se a variação de pH na reação CO2 +
H2O → H+ + HCO3-. A acidificação pode ser demonstrada pelo uso de um indicador de
pH no meio de fermentação.
Nesta prática, demonstraremos uma importante via metabólica dos

microrganismos, a fermentação alcoólica.
Objetivos
1 – Demonstrar a fermentação realizada por leveduras;
2 – Observar o efeito de diferentes variáveis, físicas e químicas, no processo fermentativo.
Materiais
Microrganismo: Saccharomyces cerevisiae (fermento biológico comercial)
Soluções: solução vermelho de congo a 0,02 % (m/v), solução de sacarose a 16 % (m/v)
e álcool absoluto.
Equipamentos e utensílios: Banho-maria a 35 oC, tubos de ensaio, pipetas, ponteiras e
balões de látex.
73
Procedimento
1- Enumere os tubos disponíveis na bancada, de 1 a 4.
2- Faça as adições indicadas no quadro abaixo, na sequência indicada e agitando o tubo
em cada etapa.
Reagente Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Água 4 mL 1 mL - 1 mL
Alcool absoluto - - 1 mL -
Solução de vermelho congo (0,02 %) 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL
Solução de sacarose (16 %) - 3 mL 3 mL 3 mL
Fermento 3 mL 3 mL 3 mL -
Fermento fervido - - - 3 mL
3- Cubra a boca do tubo de ensaio com o balão para verificação da produção de gás.
4- Anote a cor inicial do material em cada tubo.
5- Coloque os 4 tubos no banho-maria a 35 oC.
6- Após 30 min., observe e registre os resultados.
Observação do fermento fresco e fervido

1- Com o auxílio de uma pipeta de transferência, coloque uma gota da solução de
fermento fresco sobre uma lâmina, adicione mais uma gota do corante azul de metileno e
cubra com uma lamínula;
2- Repita o procedimento acima utilizando a solução de fermento fervido;
3- Focalize o material corado, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X e 40X;
4- Observe a coloração predominante das células de leveduras e registre os resultados;
4- Terminada a observação, desligue a luz, gire o revólver para encaixar a objetiva de
menor aumento, passando pela objetiva de 10X, abaixe a platina e retire a lâmina;
desinfetante, disponíveis na bancada.
74
Resultados
Tubo Cor inicial Cor final Formação de gás*
1
2
3
4
*indique a presença (+, ++ ou +++) ou ausência (-) de gás.
Cor predominante das células na solução de fermento fresco:______________________

Cor predominante das células na solução de fermento fervido:_____________________
Exercícios
1- Explique a cor final observada no Tubo 2.
2- Explique a diferença de coloração final entre os tratamentos.

a) 1 e 2
b) 2 e 3
c) 2 e 4
3- Explique o que ocorreu no Tubo 4.
4- Explique a diferença na coloração do fermento fresco e fervido.
75
Pratica 10 – Alterações genotípicas e fenotípicas em microrganismos
Ao conjunto de informações genéticas em uma célula damos o nome de genoma.

O genótipo de um organismo é sua coleção de genes: a informação que codifica todas as
características particulares do organismo. O fenótipo refere-se às propriedades expressas.
Podemos dizer que o fenótipo é a manifestação do genótipo.
Uma mutação corresponde à alteração de natureza herdável na sequência de bases

do genoma, que é passada da célula-mãe para sua progênie. As mutações podem ser
espontâneas ou induzidas. Mutações espontâneas são aquelas que ocorrem ao acaso,
que ocorrem sem uma causa aparente. A maior parte dessas mutações é decorrente de
erros durante a replicação do DNA. Mutações induzidas são resultado da exposição do
organismo a algum agente físico, químico ou biológico. O agente causador da mutação é
chamado de mutagênico. Várias formas de radiação são altamente mutagênicas. As
radiações eletromagnéticas mutagênicas podem ser divididas em duas categorias
principais, ionizante e não ionizante. As radiações não ionizantes, como a radiação
ultravioleta (UV), são mais amplamente utilizadas.
Mutantes morfológicos podem ser obtidos por meio do tratamento de esporos

(conídios) do fungo Penicillium griseoroseum com luz UV. Mutantes originários desses
esporos tratados com UV podem apresentar modificação na coloração dos conídios ou
mesmo na organização dos conidióforos.
Modificações nas condições ambientais podem gerar alterações fenotípicas

(reversíveis) em microrganismos. Um exemplo é o efeito da temperatura de incubação
sobre a produção do pigmento prodigiosina, por culturas da bactéria Serratia marcescens.
Outra variável interferindo na produção desse pigmento inclui o tipo de meio de cultura
(disponibilidade de nutrientes) utilizado para o cultivo.
Objetivos
1 – Demonstrar a obtenção de mutantes morfológicos de Penicillium griseoroseum
induzidos por luz UV;
2 – Observar o efeito da temperatura na produção do pigmento prodigiosina por Serratia
marcescens.
76
Materiais
Microrganismos: Penicillium griseoroseum e Serratia marcescens.
Soluções: Ágar nutriente, solução de Tween 80 (0,1 %, v/v) e solução salina (0,85 %,
m/v).
Equipamentos e utensílios: Placas de Petri, alça de Drigalsky, alça de platina, tubos de
ensaio, pipetas, ponteiras, vortex, fonte de luz UV e estufas de incubação.
Procedimento
- Isolamento de mutantes morfológicos de P. griseoroseum
1- Ligar a lâmpada de luz UV 15 min. antes do procedimento;
2- Preparar uma suspensão de conídios de P. griseoroseum em solução de Tween 80 (3
mL) e agitar no vortex;
3- Determinar o número de conídios por mL, utilizando a câmara de Neubauer;
4- Diluir a suspensão até a obtenção de aproximadamente 1.000-2.000 conídios/mL;
5- Plaquear 0,1 mL dessa solução em placa contendo meio de cultura e espalhar
uniformemente com a alça de Drigalsky;
6- Utilize a suspensão inicial para obter uma diluição de 10.000 – 20.000 conídios/mL,
transfira para uma placa de Petri vazia e estéril e exponha (aberta) à luz UV por 5 min.
7- Plaquear uma alíquota de 0,1 mL da suspensão irradiada em placa contendo meio de
cultura e espalhar uniformemente com a alça de Drigalsky;
8- Incube as placas a 28 oC, durante 5 dias;
9- Após o tempo de incubação, registe o número de colônias que cresceram nas placas e
calcule a porcentagem de sobrevivência após o tratamento com luz UV e o número de
mutantes morfológicos.
- Produção de pigmento por S. marcescens

1- Utilizando uma caneta permanente, faça uma divisão nas 2 placas de Petri contento
ágar nutriente;
2- Nas 2 placas, em uma das metades faça uma estria simples com a cultura pigmentada
de S. marcescens e na outra metade, uma estria simples com a cultura de S. marcescens
não pigmentada.
3- Incube uma das placas à temperatura ambiente e a outra a 40 oC, por 48 h.
4- Após o período de incubação, registre os resultados.
77
Resultados
Complete a tabela abaixo, com o número de colônias de P. griseoroseum em cada placa,
calcule a porcentagem de sobrevivência e registre o número de mutantes morfológicos.
Número de Porcentagem de Número de mutantes
Tratamento
colônias sobrevivência morfológicos
Sem UV 100 %
Com UV
Esquematize os resultados obtidos com S. marcescens. Utilize caneta vermelha quando

necessário.
Exercícios
1- Por que o tratamento com a luz UV levou a diminuição no número de colônias de P.
griseoroseum?
2- Por que os mutantes morfológicos aparecem em maior número na placa com conídio
tratados com luz UV?
3-Por que as colônias não pigmentatas de S. marcescens não são consideradas mutantes?
78
PRÁTICAS EXTRAS
Prática 11 – Métodos de esterilização e controle de crescimento microbiano
Os microrganismos podem ter seu crescimento controlado por agentes químicos

e físicos, os quais podem atuar eliminando ou impedindo o seu crescimento, criando
condições nas quais eles não podem se reproduzir. Uma grande variedade de métodos
pode ser utilizada, como, por exemplo, calor, radiações ionizantes, etc. A esterilização e
desinfecção ou desinfestação de materiais são etapas básicas quando se trabalha num
laboratório de microbiologia. Alguns conceitos importantes:
Esterilização: é o processo pelo qual eliminam-se todas as formas vivas presentes em um

material ou ambiente. Trata-se, portanto, de um processo fundamental em todos os
procedimentos microbiológicos. A esterilização pode ser realizada pelo calor, pela
radiação, pela filtração e por agentes químicos. Esses processos destroem células
microbianas numa progressão geométrica; portanto, quanto menor a população inicial,
mais rápida será a esterilização. Os materiais, a água, os vasilhames utilizados na
preparação de meios de cultura e soluções nutritivas a serem utilizados para o crescimento
de microrganismos, devem estar isentos de qualquer forma de vida. As relações
tempo/temperatura e volume/área do material ou meio a ser esterilizado, bem como a
eficiência de penetração ou difusão do agente letal, devem ser considerados na definição
do processo de esterilização.
Desinfecção: é a eliminação parcial (ou redução) do número de microrganismos
(principalmente patogênicos) presentes em um material inanimado (utensílios,
equipamentos, paredes, chão, mesas, etc). A desinfecção é feita por agentes químicos,
denominados desinfetantes.
Assepsia: conjunto de processos (técnicas) utilizados para impedir a entrada de
microrganismos em local que não os contenha.
Sanitização: é o tratamento que leva a diminuição da vida microbiana nos utensílios
alimentares e equipamentos de manipulação de alimentos até os níveis seguros de saúde
pública. Processo realizado com agentes químicos que podem ser sabão ou detergente e
desinfetantes do tipo sanitizantes.
79
Antissepsia: Semelhante a desinfecção, porém relacionada a tecidos vivos. É feita,
também, por meio de agentes químicos, denominados antissépticos, em concentrações
adequadas para estes tecidos.
Métodos de esterilização/desinfecção/assepsia.
Agentes Físicos: calor, radiações, filtração.

Calor: é um dos mais importantes métodos usados para o controle do crescimento de
microrganismos. Acima da temperatura ideal de crescimento, o calor vai promover a
desnaturação de proteínas estruturais e enzimas, levando à perda da integridade celular e
morte. Calor úmido, na forma de vapor, tem maior poder de penetração e elimina formas
vegetativas dos microrganismos. A morte pelo calor é uma função exponencial que ocorre
à medida que a temperatura se eleva. O tempo de redução decimal (valor D) é o tempo de
exposição necessário a uma determinada temperatura para reduzir a um décimo o número
original de microrganismos viáveis (matar 90 %). Quanto maior a temperatura, menor
será o valor D. É utilizado principalmente para esterilização de meios de cultura, onde os
microrganismos são eliminados pela combinação de temperatura, umidade e pressão em
autoclave. A autoclave pode ser cilíndrica ou cúbica, horizontal ou vertical, dotada com
um dispositivo elétrico ou a gás, que permite o aumento simultâneo da temperatura e
pressão. O calor úmido, inativa os microrganismos pela coagulação das proteínas e é um
processo muito mais eficiente que o calor seco, porque a água tem maior condutibilidade
térmica que o ar.
80
Tempo e temperatura para esterilização de artigos e substâncias segundo recomendações
do Ministério da Saúde.
Materiais Temperatura (oC) Tempo (minutos)
Vidrarias 170 120
Aço inoxidável e outros metais 160 120
170 60
Vaselina líquida e outros óleos 160 120
Pós (100 gramas) 160 120
Tipos de tratamento por calor úmido
Autoclave- 121oC/15 min. Este é um tempo mínimo, considerando meios de cultura ou

soluções em pequenos volumes. Ex: frascos Erlenmeyer contendo 50 a 100 mL.
Fervura- 100oC/15min, contar o tempo após a fervura.
Vapor Fluente- 100oC – Contínuo ou Fracionado (Tindalização): 30 min/ 3 dias
Pausterização: Método muito usado na indústria de alimentos. Ocorre uma redução no

número dos microrganismos pela exposição breve a uma temperatura relativamente alta.
Não esteriliza, mas tem como objetivo evitar problemas com microrganismos
patogênicos. Existem basicamente três tipos: Ultra-alta temperatura (ultra-high
temperature, UHT) (141oC/2 s); Alta temperatura (high temperature, short time, HTST
(72oC/15 s); Baixa temperatura (low temperature, LTH) (63oC/30 min).
Calor seco: é o processo de esterilização por elevação da temperatura em ambiente com

umidade extremamente baixa. É utilizada para vidrarias e utensílios resistentes a altas
temperaturas (Tabela 3). O equipamento utilizado é a estufa esterilizadora. Neste
processo, os microrganismos são inativados pela oxidação dos componentes celulares,
sendo as células vegetativas mais sensíveis ao calor do que as formas esporuladas. Para
evitar contaminação das placas e pipetas após a esterilização, estas são previamente
embaladas em sacos de papel, garrafas inox ou simplesmente em papel jornal. As pipetas
podem, ainda, ser esterilizadas dentro de suportes metálicos próprios para esta finalidade
e podem ser armazenadas por vários meses em ambiente seco.
81
Baixas temperaturas: Métodos de controle dos microrganismos porque causa
diminuição na taxa de crescimento e na atividade enzimática. Exemplos: refrigeração e
congelamento.
Radiações: constituem num método eficaz para reduzir ou eliminar os microrganismos.

O material a ser esterilizado é submetido à ação de radiação ionizante (Raios X, γ) e
ultravioleta (UV). Possuem energia para retirada dos elétrons das moléculas, ionizando-
as (formando íons). A principal molécula ionizada é a água, com a formação de radicais
tóxicos que levam à perda de elétrons por várias moléculas e formação de radicais livres.
A ação mais prejudicial é no DNA, mas atinge outras moléculas como proteínas, levando
à morte celular. As principais fontes de radiação γ-ionizante comercial são o cobalto 60
e o césio 137. A radiação gama é mais usada para esterilização de materiais plásticos,
suprimentos médicos, materiais descartáveis e alimentos termolábeis (não permanecem
resíduos de radiação) como hambúrgueres e frangos. A radiação ionizante é
extremamente perigosa, com alto poder de penetração, exigindo normas técnicas que
regulamentam seu uso, o qual requer supervisão da Comissão Nacional de Energia
Nuclear (CNEM).
A radiação UV (não ionizante) compreende comprimentos de onda entre 240-
280nm, sendo utilizada para desinfetar ambientes e superfícies, por causa do seu baixo
poder de penetração. A radiação UV é absorvida por muitas substâncias celulares, mas de
modo mais significativo pelos ácidos nucléicos. Tem ação mutagênica, levando à
formação de dímeros de timina, que impedem a ação da DNA polimerase. Muito usada
em laboratórios nas câmaras de fluxo laminar ou superfícies em geral, laboratórios
clínicos e salas de cirurgia.
Filtração: normalmente utilizada para esterilização de meios líquidos e gases que são
sensíveis ao calor (proteínas, aminoácidos, antibióticos, vitaminas). Os filtros mais
usados são: acetato, policarbonato, porcelana, cerâmica, papel-celulose e filtros de
membrana (éster de celulose) com poros de diâmetro conhecidos.
82
Outros métodos físicos de controle do crescimento microbiano: Dessecação,
Liofilização, Defumação, Remoção de Oxigênio, Vibração Ultrassônica.
Agentes Químicos: são substâncias químicas de origem natural ou sintética usadas para
eliminar ou inibir o crescimento dos microrganismos. Visam esterilização,
descontaminação, desinfecção, antissepsia de materiais ou ambientes (salas cirúrgicas,
câmaras assépticas, bancadas de laboratório). Sua ação depende de vários fatores como
concentração, tempo de contato, pH, temperatura, tipo de microrganismos, etc. Podem
variar quanto ao efeito sobre os microrganismos:
Efeito estático: inibição do crescimento. Restabelecendo-se as condições normais os

microrganismos voltam a crescer.
Efeito microbicida: morte dos microrganismos.

Exemplos de agentes químicos: Desinfetantes, agentes aquilantes, oxido de etileno, fenol,
clorofórmio, álcool, metais pesados, compostos halogenados, etc.
Objetivo
1- Verificar a eficácia de um método químico no controle do crescimento microbiano:
Avaliar o efeito do iodo como antisséptico.
83
Materiais
Microrganismos: Culturas de bactérias e leveduras padronizadas a 0.5 a 600 nm,
esfregaço de pele.
Meios e soluções: Ágar nutriente, solução de iodo, solução salina, pipetas de 10 mL,
micropipetas de 0,1 a 1 mL, barra magnética, tubos de ensaios com 9 mL de solução
salina (diluição).
Equipamentos e utensílios: Autoclave, câmara de fluxo laminar, bico de Bunsen, alça
de repicagem, swabs, alça de Drigalsky.
Procedimento
Efeito de solução de iodo sobre o crescimento microbiano
1. Dividir o fundo da parte externa de uma placa de Petri contendo Ágar Nutriente em
duas partes. Escrever “controle” em um parte e “iodo” na outra metade.
2. Utilizar swab e molhar de forma asséptica na solução salina e esfregá-lo no dorso de
uma das mãos, em uma área de aproximadamente 4 cm2.
3. Inocular com o auxílio do swab, sobre a superfície do meio de cultura, metade da
placa identificada como “controle”.
4. Utilizar outro swab e proceder de modo semelhante ao item 2, utilizando a solução
de iodo, esfregando o swab na pele e aguardar 5 minutos.
5. Pegar outro swab mergulhar na solução salina e esfregá-lo na pele na área onde foi
esfregado o swab com solução de iodo. Utilizar este swab para inocular a outra
metade da placa identificada como “iodo”.
6. Incubar em temperatura ambiente/ 24h.
7. Anotar os resultados obtidos considerando o número de colônias formadas e
morfotipos.
84
Resultados
Controle Solução Iodo
85
Exercício
1- Explique como agem o iodo, calor e a radiação UV para ser efetivos no controle do
crescimento microbiano.
2- Conceitue assepsia, desinfecção e esterilização.
86
Prática 12 – Seleção de microrganismos para aplicação em biotecnologia
Os microrganismos apresentam alto potencial para aplicação biotecnológica nas

diversas áreas. Através de processos de fermentação e biotransformação é possível
aproveitar de forma econômica produtos ou sub-produtos microbianos de interesse ao
homem. Enzimas, álcool, antibióticos, polissacarídeos e ácidos orgânicos são exemplos
de produtos de origem microbiana. Diversos são os segmentos da economia que utilizam
processos de fermentação e/ou biotransformação como as indústrias de alimentos, álcool
combustível, bebidas fermentadas e fermento-destiladas, farmacêutica, cosméticos,
aproveitamento e tratamento de resíduos, dentre outros. O Brasil oferece um grande
potencial para descoberta de microrganismos que podem ser usados em escala industrial,
uma vez que é responsável por uma grande biodiversidade incluída nos biomas Cerrado,
Floresta Amazônica e Mata Atlântica. A avaliação do potencial de um microrganismo a
ser utilizado em escala industrial inicia-se nos laboratórios de pesquisa através de testes
específicos dependendo da finalidade. Deste modo, testes como produção de esporos,
produção de biomassa microbiana, controle biológico de pragas, produção de enzimas,
etc. Outras podem ser direcionadas para aplicação em indústrias de alimentos, como na
produção de alimentos fermentados. Estes são alguns exemplos de uso de biomassa ou
produtos do metabolismo microbiano que apresentam aplicação biotecnológica.
Objetivos
Realizar testes de seleção de microrganismos com potencial aplicação biotecnológica
bem como estabelecer critérios de seleção.
Materiais
Cultura de bactérias e leveduras em meio líquido crescidas por 24 horas, Ágar Nutriente,
solução de glicose, meio para teste de produção enzimática, meio de fermentação,
reagentes para coloração de Gram, óleo de imersão, tubos de ensaio, tubos de Duhran.
87
Procedimentos
Teste de fermentação
1- Inocular 1 mL da suspensão microbiana nos tubos de ensaio contendo a solução
contendo glicose e o tubo de Duhran
1- Incubar a temperatura ambiente
2- Observar a mudança de coloração no meio e a formação de bolhas no interior dos

tubos de Duhran
Teste de produção de enzimas
1- Inocular 10 uL de uma suspensão de células, previamente padronizada, em placas

contendo meio de cultura para produção enzimática;
2- Incubar a temperatura ambiente;
3- Proceder a leitura de produção enzimática de acordo com a enzima a ser detectada.
Medir o diâmetro do halo formado ao redor da colônia e subtrair do diâmetro da colônia.
Pode ser necessário a adição de soluções reveladoras.
Resultados
e e
s s
t t
e e
f p 88
e r
r o
m d
e u
Exercícios
1- Cite aplicações do uso de microrganismos nas áreas ambiental e industrial (alimentos,
farmacêutica, etc).
2- Explique a rota metabólica realizada por Saccharomyces cerevisiae em um processo

fermentativo para produção de álcool.
3- Qual o princípio da técnica realizada no teste de produção enzimática executado na

aula prática?
89
Prática 13 – Análise bacteriológica de água
A água para consumo deve ser isenta de microrganismos causadores de doenças e

de substâncias químicas prejudiciais à saúde. Microrganismos patogênicos não crescem
em águas relativamente puras, mas podem sobreviver por vários dias.
Para o controle bacteriológico de água seria necessário detectar a presença de
microrganismos patogênicos. Pareceria a princípio, mais natural que se procurasse isolar
diretamente da água os agentes responsáveis pelas doenças de origem hídrica.
Infelizmente, os procedimentos analíticos para bactérias patogênicos não são
satisfatórios, pois uma vez que os patógenos são muito mais fastidiosos que bactérias
comuns, eles não são detectados por técnicas microbiológicas normais. Assim, ao invés
de testar a qualidade da água pela presença de patógenos específicos, usa-se comumente
verificar a presença de um grupo de bactérias, cuja origem é de material fecal e que serve
como indicador da presença de contaminação fecal: as bactérias coliformes.
As bactérias coliformes são membros da família Enterobacteriaceae e incluem os
gêneros Escherichia, Aerobacter e Klebsiella. São bacilos aeróbios ou anaeróbios
facultativos, Gram negativos, não esporulados e fermentam a lactose com produção de
gás. São habitantes naturais do trato intestinal do homem e de animais vertebrados
superiores. Uma vez que as doenças de maior importância epidemiológica transmitida
pela água resultam da ingestão de água contaminada por material fecal, a detecção das
bactérias do grupo coliforme na água constitui um método relativamente seguro, fácil e
rápido de determinar a poluição fecal, pois onde há bactérias intestinais, há contaminação
com material fecal, o que representa um perigo potencial.
A pesquisa do grupo coliforme se faz através dos testes presuntivo, confirmativo
e completo. Nas análises de rotina, normalmente se faz apenas o teste presuntivo.
Cuidados especiais devem ser tomados em relação à coleta de amostras, a fim de
se evitar alteração da biota microbiana presente na água.
Materiais
Frascos esterilizados para coleta de amostras; Pipeta de 10 mL, 1 mL e 0,1 mL
esterilizadas; Tubos com caldo lactose para fermentação; ágar nutriente; Placas de Petri
estéreis vazias; Tubos de Durhan.
90
Procedimento
1- Colher as amostras de água, observando os cuidados requeridos para cada caso em
particular;
2- Agitar a amostra por 25 vezes;
3- Transferir com assepsia, 10 mL; 1 mL e 0,1 mL da amostra para os tubos com caldo
lactose formando 3 séries de 5 tubos (ver esquema).
4- Incubar os tubos a 37 °C por 24 e 48 horas.
5- Transferir 1 mL e 0,1 para as placas de Petri e adicionar ágar nutriente fundido e
resfriado a 45°C. Incubar, uma placa com 1 mL e uma com 0,1 mL a 22 °C e as duas
restantes a 37 °C por 24 a 48 horas.
Resultados
Examinar os tubos com caldo lactose quanto a produção de gás. Anotar o número de tubos
positivos para cada diluição e determinar o número mais provável pela tabela.
Classificar a água.
Fazer a contagem de colônias das placas de Petri.
Exercícios
1- Enumerar algumas doenças que podem ser transmitidas pela água bem como seu agente
etiológico.
2- Por que a análise bacteriológica não pesquisa diretamente os germes causadores da

doença?
91
Análise de água - Ficha
Procedência: Local da coleta: ( ) Caixa d’água

Remetente: ( ) Cisterna
Data da coleta: ( ) Córrego/rio:
Data do exame: ( ) Lagoa
Natureza da amostra: ( ) In natura ( ) Torneira
( ) Tratada:
( ) Filtrada:
Observações:
TESTE PRESUNTIVO
10 10 10 10 10 1 1 1 1 1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Caldo
lactosado
24 h.
Caldo
lactosado
48 h.
(+) positivo: presença de bolhas de ar

(-) negativo: ausência de bolhas de ar
TESTE CONFIRMATIVO
Bile verde
brilhante
NMP (Número Mais Provável de E. coli) por 100 mL:
NMP= 2- Água boa - NMP= de 2 a 11- Água suspeita - NMP= 11- Água ruim
92
Conclusão do Exame Bacteriológico:
Tabela do NMP de coliformes por 100 ml da amostra e os limites de confiança de 95%,
quando são usados 5 tubos para cada volume de 10; 1 e 0,1 ml.
93
REFERENCIAS
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Wiley & Sons, 1979. 632 p.
BROCK, T.D. & MADIGAN, M.T. Biology of microorganisms. New Jersey:

Prentice Hall International, 1988. 835 p.
BUCHANAN, R.F.; GIBBONS, N.E. Bergy’s Manual of Determinative

Bacteriology. 8 th. Ed. Baltimore, Wllians&wilkins Co. 1974.
CARLILE, M.J.; WATKINSON, S.C. The Fungi. San Diego: Academic, 1994. 482 p.
CASSINI, S. T. A. Exercícios Práticos de Microbiologia do Solo Viçosa, Imprensa

Universitária, U. F. V. 1983
Dias, Disney R.; Schwan, Rosane Freitas. Leveduras. In: Moreira, F.M.S.; Cares, J. E.;
Zanetti, R.; Stürmer, S. L. (Org.). O ecossistema solo: componentes, relações ecológicas
e efeitos na produção vegetal. Lavras: UFLA, 2013, p. 311-324.
Dias, Disney R.; Schwan, Rosane Freitas. Isolamento e identificação de leveduras. In:
Fatima M. S. Moreira; E. JeroenHuising; David E. Bignell. (Org.). (Org.). Manual de
Biologia dos Solos Tropicais - Amostragem e Caracterização da Biodiversidade. Lavras:
UFLA, 2010, p. 227-277.
GIRARD, H. & ROUGIEUX, R. Técnicas de Microbiología Agrícola. Zaragoza:

Acribia, 1964. 267 p.
HUNGRIA, M., ARAÚJO, R.S., ARAÚJO, F.F. & JAMES, E. Princípios básicos em
um laboratório de Microbiologia. In: Hungria, M.; Araújo, R. (eds) Manual de
métodos empregados em estudos de Microbiologia Agrícola. Brasília: EMBRAPA.
1994. 542p.
LARPENT, J. P. & LARPENT-GOURGAUD, M. Microbiologia Prática. São Paulo:

Edgard BlucherLtda-USP, 1975. 162p.
94
LOURES, E. G. & GUIMARÃES, W. V. Microbiologia. Técnicas de laboratório.
Principais provas Empregadas para Identificação de Bactérias. Viçosa, Imprensa
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KRUGNER, T.L. & BACCHI, L.M.A. Fungos. In: BERGAMIN FILHO, A., KIMATI,
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96.
MALIK, K.A. Some Universal media for the isolation, growth and purity checking of a
broad spectrum of microorganisms. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, v. 8, p. 453-456, 1992.
NEDER, R.N. Microbiologia: Manual de Laboratório. São Paulo: Nobel, 1992.

138p.
PRESCOTT, L.M.; HARLEY, J.P. & KLEIN, D.A. Microbiology. Dubuque:

Wm.C.Brown, 1990. 868 p.
RIBEIRO, M.C.; SOARES, M.M.S.R. Microbiologia Prática: roteiro e manual:

bactérias e fungos. São Paulo: Editora Atheneu, 2000. 112p.
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R. & CASE, C.L. Microbiologia. Artes Médicas Sul,
Porto Alegre, 2000
95
ANEXO I – PREPARO DE CORANTES, REAGENTES E MEIOS
1.Azul de metileno (Loeffler)
Solução A:
Azul de metileno 0,3 g
Álcool etílico 30,0 mL
Solução B:
Hidróxido de potássio 0,01 g
H2O destilada 1.000 mL
Misturar Solução A e B
2. Cristal Violeta
Solução A:
Cristal de Violeta (85%) 2,0 g
Solução B:
Oxalato de Amônia 0,8 g
H2O destilada 80,0 mL
3. Fucsina de Ziehl
Solução A:
Fucsina básica (90%) 0,3 g
Álcool etílico (95%) 10,0 mL
Solução B:
Fenol 5,0 g
H2O destilada 95,0 mL
4.Lugol
Iodo 1,0 g
Iodeto de potássio 2,0 g
H2O destilada 300 mL
96
Dissolver o iodeto de potássio em água e acrescentar o iodo.
5. Eritrosina Fenicada
Eritrosina 1,0 g
Fenol (5% solução aquosa) 100 mL
6.Barrit - reativo (teste de VP)
Solução A:
Alfa-naftol 6,0 g
Solução B
Hidróxido de potássio 16 g
H2O destilada 1000 mLq.s.p.
Conservar as soluções em frascos separados
7. Vermelho de Metila
Vermelho de metila 0,1 g
Hidróxido de sódio (0,1N) 3,7 mL
H2O destilada q.s.p. 500 mL
8. Caldo Glucose
Extrato de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Glucose 10,0 g
9. Caldo Sacarose
Extrato de Carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Sacarose 10,0 g
97
10. Ágar amido
Amido solúvel 200,0 g
Ágar nutritivo 1000 mL
11. Ágar extrato de solo

Glucose 15,0 g
K2HPO4 0,5 g
*Extrato de solo 100,0 mL
Água da torneira 900 mL
Ágar 15,0 g
*Extrato de solo esterilizado para uso no meio: juntar 1L de água de torneira a 1 Kg de
solo rico. Agitar e autoclavar por 30 minutos. Acrescentar um pouco de CaCO3 e filtrar a
suspensão. Esta suspensão deve ser filtrada novamente até tornar-se mais claro.
Acondicionar em frascos de 100 mL e autoclavar por 15 minutos.
12. Meio “79” (Rhizobium)

Sacarose (açúcar cristal) 5,0 g
Glutamado de Na (Aji-no-moto®) 1,0 g
K2HPO4 0,4 g
KH2PO4 0,1 g
MgSO4.7 H2O 0,2 g
NaCL 0,1 g
Extrato de Levedura 0,5 g
Ágar 15,0 g
Vermelho Congo: adicionar 30,0 mL.L-1 de uma solução alcóolica a 1/200.
13. MB - (meio básico)

Amido solúvel 10,0 g
Caseína ácida hidrolisada 10,0 g
Glucose 1,0 g
Na2HPO 3,0 g
Mg SO4 7H2O 0,1 g
Ágar 15,0 g
98
14. MB - 2 (Catalase)
Sacarose 10,0 g
Caseína Ácida hidrol. 8,0 g
Extrato de levedura 4,0 g
K2HPO 2,0 g
Mg SO4 7H2O 0,3 g
15. Azul de metileno (MB - 4):

Distribuir 1 mL de solução de azul de metileno 1:20000 em cada tubo contendo
MB - 2.
16. Gelatina
Caseína ácida hidrolisada 8,0 g
Extrato de levedura 4,0 g
Gelatina 150,0 g
17. V.M. e V.P.

Glucose 5,0 g
Peptona 5,0 g
K2HPO4 5,0 g
18.BDA (Batata-Dextrose-Ágar)
Batata 200 g
Dextrose 15 g
Ágar 15 g
Água destilada (q.s.p.) 1.000 mL
19. Caldo Nutriente

99
Peptona 5,0 g
Água destilada (q.s.p.) 1.000 mL
20. Ágar Nutriente

Caldo nutriente 1.000 mL
Ágar 15,0 g
21.Solução Sulfo-Crômica
Ácido Sulfúrico Conc. 460 mL
Dicromato de potássio 60,0 g
22. Meio para Actinomicetos

K2HPO 1,0 g
Asparagina de sódio 10,0 g
Glicerol 10,0 g
Solução de oligoelementos 1,0 mL
Ágar 15,0 g
pH final 7,0
Para isolamento de Streptomyces pode-se utilizar 1,0 mL de uma solução padrão de 100
mg/mL de estreptomicina para inibição de bactérias.
23. Caldo lactose

Peptona 5,0 g
Lactose 10,0 g
pH 6,8 - 7,0
24. Eosina Azul de Metileno (Ágar)

Peptona 10,0 g
Lactose 10,0 g
100
Fosfato dipot. (K2HPO4) 2,0 g
Ágar 15,0 g
Eosina Y 0,4 g
Azul de metileno 0,065 g
Esterilizar 115 °C por 15 a 20 minutos.
25. Solução Sacarose

- Para preparação de esporos de fungos endomicorrízicos e nematóides
Sacarose 454 g
H2O destilada 1.000 ml
26. Caldo Lactosado verde Bile Brilhante 2%

Peptona 10,0 g
Lactose 10,0 g
Bile de boi desidratada 20,0 g
Verde Brilhante 0,0133 g
27. Caldo Indol

Triptona 5,0 g
NaCl 2,5 g
28. Indicador de Andrade

Fucsina ácida 1,0 g
29. Ágar acetato para esporulação de leveduras

Extrato de levedura 2.5 g/l
Dextrose 1.0 g/l
Acetato de potássio 10 g/l
Ágar 20g/l
pH (25 °C) 6,4±0.2
101

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UFLA – Universidade Federal de Lavras

DBI – Departamento de Biologia

MICROBIOLOGIA GERAL (GBI 111 e 132)

Drª. Cristina F. Silva e Batista

MICROBIOLOGIA GERAL (GBI 111 e 132)

Universidade Federal de Lavras

1 No caso de acidentes, comunicar imediatamente ao professor.

Estas normas têm como metas:

✓ A segurança de cada um e de todos;

Nº prática Tema aula prática Página

Introdução ao Laboratório de Microbiologia e observação de

2 Meios de cultura: utilização, preparo e esterilização 8

3 Observação microscópica de protistas e algas 16

Isolamento de fungos filamentosos e morfologia de micélios e

5 Esporos fúngicos assexuados e sexuados 35

6 Isolamento e enumeração de microrganismos 55

7 Obtenção de culturas puras: estrias simples e compostas 60

Preparações microscópicas fixadas: coloração de Gram e

9 Metabolismo microbiano: fermentação alcoólica 73

10 Alterações genotípicas e fenotípicas em microrganismos 76

Métodos de esterilização e controle de crescimentos de

12 Seleção de microrganismo para aplicação biotecnológica 87

13 Análise microbiológica de água 90

Anexo I. Protocolos para preparo de corantes, reagentes e meios

Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco toda vidraria

Refrigerador - utilizado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa

Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na

Câmara de Segurança Biológica (câmara de fluxo laminar) - câmara asséptica, dotada

9) 10) 11) 12)

1- Exponha a placa de Petri, contendo o meio de cultura estéril, a uma condição de

- Verificação da utilidade do Bico de Bunsen

LEMBRE-SE DE IDENTIFICAR O MATERIAL: as placas devem ser identificadas

- Averiguação da presença de microrganismos no ambiente:

- Verificação da eficácia do Bico de Bunsen:

2- Explique a finalidade e o princípio do funcionamento da autoclave.

3- Diferencie colônias de bactérias e fungos filamentosos. Dê as principais características

Todos os organismos vivos necessitam de uma variedade de elementos químicos

1. Meios de cultura complexos ou indefinidos: são meios de cultura nos quais os

Tabela 1- Meio de cultura quimicamente definido para o crescimento de bactérias

Ingrediente Função Quantidade

Tabela2- Composição química do meio Sabouraud.

Peptona Fonte de carbono, nitrogênio e elementos 10 g

Glicose Fonte de carbono e energia - Alta concentração inibe 40 g

Água destilada Solvente 1000 mL

pH Baixo pH inibe bactérias, mas permite crescimento de 4,5

III. Ágar MacConkey: A ação inibitória do cristal violeta no crescimento de organismos

a- Coliformes: produzem ácido como resultado da fermentação da lactose. A bactéria

3.3. Meios de Enriquecimento: Meios convencionais enriquecidos com um ou mais

Esterilização de meios de cultura

A utilização de meios de cultura estéreis é uma condição essencial para se trabalhar

Tabela 3- Composição do meio de cultura Ágar Nutriente

Tabela 4- Composição do meio de cultivo BDA

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Os protistas compreendem os microrganismos eucariotos fototróficos e não

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4- Procure campos onde os organismos exibam motilidade, utilizando os parafusos do

2- Quais são as vantagens e as desvantagens da observação de lâminas em preparações a

3- Por que os Oomicetos eram classificados, anteriormente, como fungos?

(1) Heteronema (7) Mayorella (13) Blepharisma (19) Zoothamnium

(2) Cercomonas (8) Diffugia (14) Coleps (20) Stylonychia

(3) Codosiga (9) Paramecium (15) Condylostoma (21) Onychodromos

(4) Protospongia (10) Lacymaria (16) Stentor (22) Hypotrichidium

(5) Trichamoeba (11) Lionotus (17) Vorticella (23) Euplotes