Guia de Aulas Prticas de Microbiologia

Copyright © 2020 autores.
Edição Gráfica:
Juliana Dias (julianadiasdesigngrafico@gmail.com)
Capa:
Juliana Dias
Revisão Gramatical e Ortográfica:

Prof. José Guedes de Lima Filho (joseguedes_8@hotmail.com)
Imagem da capa:
Colônias de Saccharomyces cerevisiae em meio Sabouraud - imagem dos autores.
Imagens:
Figura 1.1 símbolos de risco biológico e substância tóxica – imagens de Studio Souldesign.eu por
FreeImages.
Figura 1.1 símbolo de substância corrosiva - imagem de Clker-Free-Vector-Images por Pixabay.
Figura 2.1 imagem gentilmente cedida pela Olympus Corporation.
Figura 3.1 imagem gentilmente cedida pela Prismatec Indústria e Comércio.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE
Biblioteca Central, Recife-PE, Brasil
G943 Guia de aulas práticas de microbiologia / José Vitor Moreira Lima

Filho ... [et al.]. – 1. ed. -- Recife: [s.n.], 2020.
67 p.: il.
Inclui referências.
ISBN: 978-65-00-06812-2
1. Microbiologia – Manuais, guias, etc. I. Lima Filho, José Vitor

Moreira, et al.
CDD 576
Todos os direitos reservados.

Esta obra é de finalidade educativa, sem fins lucrativos, sendo, portanto, proibida a sua venda.
É permitida a reprodução do conteúdo desta obra sem autorização prévia por escrito dos autores
para fins educacionais desde que citada a fonte.
APRESENTAÇÃO
A aula prática é considerada uma importante ferramenta metodológica no

processo de ensino-aprendizagem, uma vez que propicia o desenvolvi-
mento de habilidades fundamentais aos discentes como a reflexão, obser-
vação, obtenção e organização de dados e discussão. Cientes disso e com
o objetivo de melhorar o desempenho das aulas práticas já ministradas
para diversos cursos da UFRPE, os autores organizaram o “Guia de Aulas
Práticas de Microbiologia”.
O guia aborda as técnicas de manipulação assépticas de microrganismos,

o funcionamento de equipamentos em um laboratório de microbiologia,
bem como a conduta que o profissional deve seguir nesse tipo de am-
biente; reforçando as aulas teóricas e aprofundando os conteúdos mi-
nistrados. Assim sendo, esperamos que seja uma importante ferramenta
facilitadora da aprendizagem em Microbiologia.
Este guia é destinado aos estudantes que cursam a disciplina de micro-

biologia da UFRPE e de outras instituições de ensino superior, os quais de-
verão consultá-lo antes e durante as aulas práticas, principalmente visan-
do solucionar dúvidas acerca dos procedimentos ou para que possíveis
omissões sejam esclarecidas. Todavia, ressaltamos que este trabalho não
tem a pretensão de ser um “Manual de Técnicas Microbiológicas”, deven-
do ser complementado necessariamente com os conteúdos ministrados
nas aulas teóricas e com a bibliografia recomendada.
Os autores.
GUIA DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

4
SOBRE OS AUTORES
José Vitor Moreira Lima Filho é bacharel em Ciências Biológicas pela

Universidade Federal do Ceará (1996), mestre (1999) e doutor (2004) em
Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais, com pós-douto-
rado pela Universidade de Cambridge, Reino Unido. Atualmente é profes-
sor Titular na Universidade Federal Rural de Pernambuco onde leciona as
disciplinas Microbiologia Geral e Microbiologia e Imunologia. É orientador
nos níveis de mestrado e doutorado nos Programas de Pós-graduação
em Biociência Animal e Ciência Animal Tropical e na Rede Nordeste de
Biotecnologia.
Norma Suely Sobral da Silveira é bacharel em Ciências Biológicas (1983)

pela Universidade Federal da Paraíba, mestra em Biologia de Fungos (1990)
pela Universidade Federal de Pernambuco e doutora em Botânica (1999)
pela Universidade Federal Rural de Pernambuco. É professora Adjunta I
aposentada da Universidade Federal Rural de Pernambuco onde lecionava
as disciplinas Microbiologia e Micologia Clínica.
Elineide Barbosa de Souza é engenheira Agrônoma (1991), mestra em

Fitossanidade (1995) e doutora em Fitopatologia (2002) pela Universidade
Federal Rural de Pernambuco. Atualmente é professora Titular na
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde leciona as disciplinas
Microbiologia Geral A e Microbiologia. É orientadora nos níveis de mestra-
do e doutorado no Programa de Pós-graduação em Fitopatologia.
Marcos Antônio Barbosa de Lima é bacharel em Ciências Biomédicas

(2000), mestre (2003) e doutor (2007) em Biologia de Fungos pela
Universidade Federal de Pernambuco, com pós-doutorado em Microbiologia
Aplicada (2012) pela Universidade do Porto, Portugal. Atualmente é profes-
sor Associado III na Universidade Federal Rural de Pernambuco onde lecio-
na as disciplinas Microbiologia e Microbiologia Ambiental. É orientador no
nível de mestrado no Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento de
Processos Ambientais.

5
Luciana de Oliveira Franco é médica veterinária (1997) pela Universidade
Federal Rural de Pernambuco, mestra em Bioquímica e Fisiologia (2000)
e doutora em Biologia de Fungos (2005) pela Universidade Federal de
Pernambuco. Atualmente é professora Associada II na Universidade
Federal Rural de Pernambuco onde leciona as disciplinas Microbiologia
Geral e Microbiologia Zootécnica.
Éder Galinari Ferreira é licenciado em Ciências Biológicas (2004) pelo

Centro Universitário do Leste de Minas Gerais, mestre em Ciência e
Tecnologia de Alimentos (2011) e doutor em Microbiologia Agrícola (2016)
pela Universidade Federal de Viçosa, com pós-doutorado em Ciências
Farmacêuticas (2018) e Bioquímica (2019) pela Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. Atualmente é professor Adjunto I na Universidade
Federal Rural de Pernambuco onde leciona as disciplinas Microbiologia
Geral e Microbiologia Ambiental.
Yone Vila Nova Cavalcanti é bacharel em Ciências Biológicas (1995) pela

Universidade Federal Rural de Pernambuco, mestra em Biofísica (1998)
e doutora em Inovação Terapêutica (2012) pela Universidade Federal de
Pernambuco. Atualmente é professora Adjunta IV na Universidade Federal
Rural de Pernambuco onde leciona as disciplinas Imunologia Veterinária,
Microbiologia e Imunologia, Epidemiologia e Saúde Pública.
Rosa Maria Nunes Galdino é bacharel em Ciências Biológicas (1980) e

especialista em Microbiologia do Solo (1986) pela Universidade Federal
Rural de Pernambuco. Atualmente é bióloga lotada no Departamento de
Biologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco onde colabora
com as aulas práticas na área de Microbiologia. Além disso, desenvolve
atividades de Extensão.

6
SUMÁRIO
1. Normas de biossegurança e estruturação do laboratório de microbiologia 8
2. Microscopia e observação de microrganismos 15
3. Princípios gerais de esterilização 18
4. Meios de cultura 22
5. Técnicas de cultivo e isolamento de bactérias 27
6. Coloração diferencial de Gram – observação de formas e arranjos de

bactérias 31
7. Antibiograma 35
8. Técnicas de cultivo de fungos 40
9. Observação de estruturas somáticas e reprodutivas dos fungos 46
10. Quantificação de microrganismos 53
11. Controle do crescimento de microrganismos 62
12. Bibliografia recomendada 66

7
1
NORMAS DE
BIOSSEGURANÇA E
ESTRUTURAÇÃO DO
LABORATÓRIO DE
MICROBIOLOGIA
Conhecer a estrutura do laboratório de microbiologia, os equipamentos

OBJETIVOS e materiais mais utilizados, bem como os riscos biológicos existentes e
as normas de segurança necessárias para a realização de procedimentos
durante as aulas.
CONCEITO DE BIOSSEGURANÇA
Biossegurança é o conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, re-
duzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer
a saúde humana, de outros animais, vegetais e o ambiente.
Na figura abaixo estão listados alguns símbolos relativos à biossegurança

comumente encontrados em laboratórios de microbiologia.
Símbolo indicativo de risco Símbolo indicativo de Símbolo indicativo de

biológico em um ambiente. substância tóxica. substância corrosiva.
Figura 1.1. Alguns símbolos de biossegurança mais presentes em laboratórios de microbiologia.

8
PRINCIPAIS VIAS DE TRANSMISSÃO NO MANUSEIO COM
MICRORGANISMOS
Via digestiva:
Esta acontece por ingestão de microrganismos patogênicos decorrente do uso direto da pipeta com
a boca, falta de lavagem das mãos após manuseio de amostras clínicas ou culturas e pela remoção
inadequada de luvas contaminadas.
Via respiratória (qualquer estrutura com potencial infeccioso):

Acontece através da inalação de aerossóis devido à quebra de vidraria durante centrifugação ou
pela flambagem de alças de semeio contendo grande quantidade de massa biológica (biomassa
microbiana).
Via cutânea:
Tal transmissão acorre pela inoculação direta na pele; ocasionada por acidentes com agulhas,
bisturis ou vidrarias quebradas, bem como durante o manuseio de amostras clínicas e culturas,
estando o manipulador com ferimentos ou arranhões na pele.
BOAS PRÁTICAS LABORATORIAIS (BPL)
Os procedimentos listados abaixo visam garantir a segurança dos alunos, professores, monitores e
funcionários, além de evitar danos ao meio ambiente.
1. Lavar as mãos com detergente e secá-las com papel toalha antes e depois das aulas práticas
(ver Figura 1.2);
2. Utilizar sempre bata ou jaleco, calças compridas e sapatos fechados para diminuir a possibilidade
de riscos, evitar acidentes e, principalmente, reduzir a possibilidade de transportar bactérias e
fungos para o ambiente externo. É importante destacar que não é permitida a permanência no
laboratório do aluno que descumprir essa norma de biossegurança;
3. Não comer, beber, fumar, guardar alimentos, usar o telefone ou manusear lentes de contato e
cosméticos nas áreas do laboratório;
4. Não colocar materiais contaminados como alças de semeio, pipetas e lâminas com células vivas
sobre as bancadas ou superfície da cabine de fluxo laminar. Estes materiais devem ser colocados
em recipientes específicos para posterior descontaminação; as alças devem ser imediatamente
flambadas antes e após o uso;

9
1. Abra a torneira e lave 2. Aplique na palma da mão 3. Ensaboe as palmas das
as mãos, evitando a quantidade suficiente de mãos, friccionando-as
encostar na pia. sabonete líquido para cobrir entre si.
todas as superfícies das mãos.
4. Esfregue a palma da mão direita 5. Entrelace os dedos e friccione

contra o dorso da mão esquerda (e os espaços interdigitais.
vice-versa) entrelaçando os dedos.
6. Esfregue o dorso dos dedos de uma 7. Esfregue o polegar direito,

mão com a palma da mão oposta com o auxílio da palma da
(e vice-versa), segurando os dedos, mão esquerda (e vice-versa)
com movimento de vai e vem. utilizando movimento circular.
8. Friccione as polpas digitais e unhas 9. Esfregue o punho esquerdo,

da mão esquerda contra a palma mão com o auxílio da palma da mão
direita fechada em concha (e vice- direita (e vice-versa), utilizando
versa), fazendo movimento circular. movimento circular.
10. Enxague as mãos, retirando os resíduos 11. Seque as mãos com papel toalha
de sabonete. Evite contato direto das descartável, iniciando pelas mão e
mãos ensaboadas com a torneira. seguindo para os punhos.
Figura 1.2. Etapas da técnica de lavagem das mãos de acordo com o cartaz e o manual Segurança do Paciente -
Higienização das Mãos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária/ Ministério da Saúde (ANVISA/MS).

10
5. Toda a manipulação deve ser realizada evitando a formação de aerossóis (gotículas de líquido
contendo células de microrganismos em suspensão no ar);
6. Todas as vidrarias contaminadas e culturas devem ser descontaminadas por 30 minutos em
autoclave a 121 ºC, antes de serem descartados e lavados;
7. Culturas, recipientes e frascos devem estar rotulados com lápis (uso de canetas pode resultar
na perda de identificação do material). As etiquetas devem conter as seguintes especificações:
nome da espécie microbiana, número de referência (se houver), nome do aluno, turma e data de
semeio;
8. Pessoas com cabelos longos devem mantê-los presos a fim de evitar acidentes com as chamas
do bico de Bunsen ou lamparina;
9. As superfícies de trabalho precisam ser descontaminadas com etanol a 70% e/ou hipoclorito de
sódio, antes e após a realização de cada aula prática.
EQUIPAMENTOS DE SEGURANÇA
Em laboratório, o uso adequado de equipamentos de proteção individual (EPI) e coletiva (EPC) con-
tribui para assegurar a realização das aulas práticas sem colocar em risco a saúde dos alunos,
professores, monitores, técnicos e profissionais da limpeza.
Equipamentos de Proteção Individual (EPI)
Proteção contra gotículas, aerossóis ou queda de

Toucas
cabelo sobre a superfície de trabalho.
Proteção contra respingos, impacto de objetos ou

Óculos de segurança e protetor facial
de partículas.
Máscara PPF-N95 PPF= Peça de Proteção Fil- Proteção respiratória que contém filtro para reten-
trante ção de contaminantes atmosféricos.
Descartáveis: utilizadas para manuseio de micror-

ganismos, podendo ser de procedimento ou este-
rilizada (protege o operador e a amostra).
Luvas (subtipos e modos de proteção) Proteção térmica: usada para retirada de material
da autoclave, estufa e micro-ondas.
Borracha: lavagem de material previamente des-
contaminado por autoclavagem.
Jaleco, bata ou avental Proteção contra respingos em geral.

11
Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC)
Extintores de incêndio (água, pó químico, espuma

Evitam a propagação de chamas.
mecânica)
Limpeza após acidente com culturas ou reagentes

Chuveiro de emergência e lava-olhos
químicos.
Dispositivos utilizados para sucção e dispensação

Pipetador ou pera de borracha
de soluções e reagentes
Materiais utilizados, principalmente, para cobrir

Kit de primeiros socorros ferimentos. No mínimo um antisséptico, gaze e
esparadrapo.
Garantem um ambiente para manipulação assép-

Cabine de segurança biológica tica. Manuseio de microrganismos patogênicos ou
oportunistas.
Manuseio de reagentes químicos voláteis e produ-

Cabine de segurança química/ Cabine de exaustão
tos particulados.
NÍVEIS DE BIOSSEGURANÇA DE LABORATÓRIOS

Para classificação do nível de biossegurança (NB) de um laboratório é importante levar em consi-
deração certas características específicas dos microrganismos como: virulência, modo de trans-
missão e estabilidade no ambiente, disponibilidade de medidas profiláticas e de tratamento para as
doenças causadas.
• Laboratório NB 1: manipulam-se microrganismos que possuem baixo ou nenhum risco indivi-

dual e ao meio ambiente, como os laboratórios que manuseiam microrganismos patógenos de
vegetais e microrganismos probióticos.
Exemplos: bactérias Pseudomonas syringae pv. tomato e Bacillus clausii (Enterogermina®); le-
vedura Saccharomyces boulardii (Floratil®).
Exigências: uso do jaleco, luvas e máscaras.
• Laboratório NB 2: manipulam-se microrganismos que possuem risco individual moderado e

baixo risco ao meio ambiente, ou seja, manipulam-se amostras com agentes infecciosos a hu-
manos e outros animais, no entanto, é pouco frequente a mortalidade em decorrência da infec-
ção por estes microrganismos.
Exemplos: vírus da hepatite B e a bactéria Salmonella typhi.
Exigências: utilização de barreiras de proteção individual (luvas, jaleco, óculos) e equipamentos
de contenção como câmara de fluxo laminar.

12
• Laboratório NB 3: manipulam-se microrganismos que possuem risco individual elevado e risco
moderado ao meio ambiente; por manipular agentes infecciosos que podem causar doenças
sistêmicas sérias e que podem ser letais.
Exemplos: bactéria Mycobacterium tuberculosis; espécies de fungos do gênero Sporothrix e ví-
rus da febre amarela.
Exigências: barreiras de proteção individual, equipamentos de contenção, cabine de segurança
biológica com acesso controlado e sistema de ventilação especial com filtros microbiológicos.
• Laboratório NB 4: manipulam-se microrganismos que possuem risco individual e ao meio am-

biente elevados, sendo o acesso restrito a pessoas autorizadas para manipular agentes infec-
ciosos altamente perigosos e que são transmitidos pelo ar.
Exemplos: bactérias multirresistentes; vírus da varíola e Ebola.
Exigências: sistema especial de ventilação (pressão negativa e filtros), descarte de resíduos,
equipamentos de segurança individual e o manuseio dos microrganismos é realizado em cabine
de segurança biológica classe IV.
PROCEDIMENTOS EM CASO DE ACIDENTES NO LABORATÓRIO

As principais recomendações a serem observadas quando da ocorrência de acidentes envolvendo
placas ou tubos com cultivo de bactérias e fungos são:
• Avisar imediatamente ao professor, monitor ou técnico do laboratório;
• Espalhar água sanitária ao redor do sítio do acidente, nunca sobre o material biológico devido à
possibilidade de formação de aerossóis;
• Utilizar luvas de procedimento e com papel absorvente recolher a mistura de cultura que der-
ramou juntamente com o antimicrobiano utilizado para desinfecção. Acondicionar em um reci-
piente autoclavável e esterilizar o material antes de descartá-lo no lixo comum.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

O laboratório deve possuir espaço amplo e bem iluminado, com paredes e bancadas lisas, fáceis
de limpar e impermeáveis. Além disso, o laboratório deve ter piso antiderrapante e sem saliências,
bem como possuir instalações de água, luz e gás identificadas. Anexo ao laboratório devem existir
espaços próprios para armazenamento de reagentes e descontaminação de material.

13
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS COM FREQUÊNCIA NO
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
Material Finalidade
Placas de Petri e tubos de ensaio Cultivo e armazenamento de microrganismos
Proveta, pipeta Medição de líquidos
Alça de semeio, agulha de semeio e Swab Manipulação de bactérias e fungos
Reagentes utilizados na preparação de meios de

Ágar, peptona, dextrose
cultura
Flambagem de instrumentos metálicos e garantia

Bico de Bunsen, lamparina de uma área mínima para manipulação asséptica
de amostras
Pinça Transferência de discos de antimicrobianos
Espalhamento de microrganismos na superfície do

Alça de Drigalski
meio de cultura sólido em placa de Petri
Equipamento Finalidade
Esterilização de vidrarias volumétricas, meios de

Autoclave
cultura, descontaminação de material
Esterilização de vidrarias não volumétricas (placas

Estufa
de Petri, bastão de vidro)
Cultivo de microrganismos em condições contro-

Estufa incubadora de CO2, Jarra de anaerobiose
ladas de temperatura e aeração
Balança, micro-ondas, pHmetro Preparação de meios de cultura
Visualização de células bacterianas e estruturas

Microscópio ótico
fúngicas
Visualização de características macroscópicas de

Lupa
culturas microbianas

14
2
OBJETIVO
MICROSCOPIA E
OBSERVAÇÃO DE
MICRORGANISMOS
Conhecer as partes mecânicas e ópticas do microscópio óptico, além de

treinar o aluno para realizar o manuseio deste equipamento para visuali-
zação de bactérias e fungos.
A invenção do microscópio nos permitiu visualizar um mundo repleto de

INTRODUÇÃO organismos microscópicos, antes inacessível, bem como a observação de
células animais e vegetais. O tamanho dos microrganismos pode variar de
0,2 a 4 µm (micrômetros) entre os procariotos (bactérias e arqueias), de 10
a 100 µm entre os eucariotos (fungos, algas e protozoários) e de 24 a 970
nm (nanômetros) nas partículas virais.
O olho humano, por sua vez, é capaz de enxergar estruturas com diâmetro
mínimo de 0,2 mm ou 200 μm. Dessa forma, para a observação de células
microbianas, é necessário o uso de microscópio óptico ou de luz (para vi-
sualizar bactérias, fungos, algas e protozoários) e de microscópios eletrô-
nicos (para observar partículas virais e detalhes das estruturas celulares
de bactérias, fungos, algas e protozoários).
O microscópio óptico (Figura 2.1) é constituído de uma parte mecânica

MICROSCÓPIO (braço, charriot [lê-se charriô], parafusos macrométrico e micrométrico,
ÓPTICO base, revólver e platina ou mesa) e de uma parte óptica (lentes oculares
e objetivas, sistema de iluminação constituído por uma fonte de luz, con-
densador e diafragma). Os microscópios ópticos utilizam um sistema de
lentes e prismas para direcionar o caminho que um feixe de luz percorre
entre o objeto a ser estudado e o olho humano.

15
Lentes oculáres
Revólver Braço
Lentes objetivas
lâmina com espécime

Chave On/Off
Platina
Condensador Charriot
Fonte de luz
Ajuste de intensidade de luz
Base
Parafuso macrométrico Parafuso micrométrico
Figura 2.1. Microscópio óptico e seus componentes.
A ampliação total da imagem obtida através do microscópio óptico é calculada multiplicando-se os

aumentos produzidos pelas objetivas e pelas oculares. Veja a tabela abaixo.
Designação da Ampliação Ampliação Ampliação Microrganismos

objetiva objetiva ocular total observados
Baixo poder 4X 10 ou 20X 40 ou 80X Protozoários
Baixo poder 10X 10 ou 20X 100 ou 200X Fungos
Alto poder 40X 10 ou 20X 400 ou 800X Fungos
Imersão 100X 10 ou 20X 1000 ou 2000X Bactérias
TREINANDO O MANUSEIO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO
Observação de lâmina com fungo:

a. Ligar sistema de iluminação;
b. Colocar a lâmina sobre a platina, centralizando-a no feixe de luz com auxílio do Charriot;
c. Ajustar a distância entre as oculares para que somente uma imagem seja visualizada;
d. Com a objetiva de 10X posicionada, elevar a platina usando o parafuso macrométrico até obter
um foco inicial;

16
e. Ajustar a nitidez do foco com o parafuso micrométrico (ajuste fino);
f. Girar o revólver, posicionar a objetiva de 40X e ajustar a nitidez do foco com o parafuso
micrométrico;
g. Para mudar o campo microscópico, mover o Charriot em um ou outro sentido.
Observação de lâmina com bactéria:

a. Seguir as etapas a, b, c, d, e, f realizadas na observação de fungo;
b. Obtido o foco na objetiva de 40X, fazer meio giro com o revólver sem encaixar a objetiva de 100X.
Adicionar uma gota de óleo de imersão sob o esfregaço no centro da lâmina e encaixar a objetiva
de 100X;
c. Ajustar a nitidez do foco com o botão micrométrico.
ATENÇÃO! Nunca retorne para a objetiva de 40X estando a amostra com óleo de imersão, para
evitar a contaminação dessa objetiva.
Por que usar o óleo de imersão?

O óleo de imersão corrige a refração que a luz sofre ao atravessar a lâmina contendo a amostra
(Figura 2.2), assim, ele direciona uma maior quantidade de luz para dentro da objetiva, contribuindo
para a nitidez da imagem.
Objetiva Objetiva
Lentes
Óleo de
imersão
Lamínula Lamínula
Lâmina Lâmina
Amostra Amostra
Fonte de luz Fonte de luz
(A) Sem óleo de imersão (B) Com óleo de imersão
Figura 2.2. Correção da refração da luz pelo uso do óleo de imersão na objetiva de 100X.
Antes e após a utilização do microscópio deverá ser realizada a limpeza das lentes objetivas uti-
lizando papel macio umedecido com uma solução de álcool etílico absoluto e éter na proporção
70:30 (v/v). Não utilizar solventes orgânicos (ex. xilol e acetona), pois estas substâncias podem
promover o descolamento das lentes. Para a limpeza das lentes deve-se utilizar um papel macio
“tipo lenço”; não usar papel toalha, pois pode arranhá-las.

17
3
OBJETIVO
PRINCÍPIOS GERAIS
DE ESTERILIZAÇÃO
Diferenciar os métodos de esterilização por calor seco e calor úmido e

demonstrar os procedimentos envolvidos no preparo de material de labo-
ratório a ser esterilizado.
A esterilização é um processo de destruição de todos os microrganismos

INTRODUÇÃO presentes em um material, incluindo os endósporos e outras estruturas de
resistência, mas não significa, necessariamente, a destruição de enzimas
termoestáveis, produtos metabólicos e toxinas. A realização desse pro-
cedimento em materiais e meios de cultura é imprescindível quando se
deseja o isolamento e obtenção de uma cultura pura.
A esterilização pelo calor seco ou úmido é o método mais empregado,

indicado para a maioria dos materiais, exceto para aqueles que sejam
termossensíveis ou que consistam em substâncias químicas voláteis ou
tóxicas. A temperatura e o tempo de exposição variam de acordo com o
tipo de material e o volume da amostra.
No processo de calor seco, o ar quente em altas temperaturas mata os

microrganismos pela oxidação de moléculas celulares. Contudo, para que
o método seja efetivo são necessários uma temperatura e um tempo de
exposição maiores do que aqueles utilizados na esterilização por calor
úmido, uma vez que a propagação do calor no ar é mais lenta do que na
água. A esterilização, através de calor seco, pode ser realizada em estufa
e através dos processos de flambagem e incineração.
Em contrapartida, a esterilização por calor úmido mata os microrganis-

mos por ocasionar a desnaturação de proteínas. Nesse método, o vapor
pode ser utilizado sob pressão em autoclave. Conforme mencionado ante-
riormente, o calor úmido é mais eficiente que o calor seco, por possuir boa
penetrabilidade e, desse modo, o tempo gasto para esterilizar é menor.

18
Em ambos os métodos de esterilização (estufa e autoclave) o material
limpo e que será utilizado posteriormente deve estar embalado a fim de
evitar sua contaminação com os microrganismos do ar, quando da retira-
da do material de dentro dos equipamentos.
LIMPEZA DE MATERIAL
Material NÃO CONTAMINADO pelo manuseio no laboratório:
• Lavar com água corrente e detergente neutro (nunca usar detergentes perfumados);
• Secar em estufa a 50–70 ºC.
Material CONTAMINADO
• Esterilizar em autoclave a 121 ºC durante 30 minutos;
• Esperar esfriar e lavar com água corrente e detergente neutro;
• Secar em estufa a 50–70 ºC.
MONTAGEM E EMBALAGEM DE MATERIAL LIMPO PARA ESTERILIZAÇÃO
Placas de Petri: empilhar 3 a 6 placas e embrulhar com papel madeira.
Pipetas: adicionar algodão hidrófobo na extremidade das pipetas e embrulhar individualmente com
papel madeira em forma de espiral, identificando o volume de cada pipeta. No caso de utilização de
estojos inoxidáveis para pipetas, não há necessidade de empacotá-las individualmente; no entanto,
deve-se deixar o orifício do estojo aberto para que ocorra a entrada de vapor.
Tubos de ensaio: tamponar com algodão hidrófobo. Organizar os tubos em latas próprias cobertas
na parte superior por papel e identificá-las.
Vidrarias: frascos Erlenmeyer, balões, recipientes para cultivo: tamponar com algodão hidrófobo e
revestir o tampão com papel. Evitar o uso de papel alumínio, em vista da interferência no processo
de esterilização, como também não usar gaze (material hidrofílico).
Pinça, bisturi, alça de Drigalski: devem ser envolvidos também com papel.
ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAL POR ALTAS TEMPERATURAS

• Esterilização em estufa (calor seco): submeter placas de Petri, béqueres, frascos Erlenmeyer,
pinças e cabo de bisturi, a temperatura de 170 ºC por 2 horas.

19
• Esterilização em autoclave (calor úmido): submeter vidrarias calibradas (pipetas, provetas e ba-
lões volumétricos), placas para microcultivo, água, soluções, meios de cultura, a temperatura de
121 ºC (pressão de 1 atmosfera) por 15 minutos. Após a esterilização, placas para microcultivo
e outros materiais envolvidos completamente em papel, devem ser secos em estufa de seca-
gem a 60 ºC, visando evitar contaminação externa.
Ao preparar um meio de cultura devemos observar a indicação do fabricante. Pois a maioria deles
é esterilizado à 121 ºC por 15 minutos. Entretanto, alguns devem ser esterilizados por filtração por
conterem componentes termossensíveis (ex. vitaminas). No caso de grandes volumes de líquidos
(a partir de 3 L) e em caso de descontaminação de material, o tempo de esterilização deve ser
estendido para 30 minutos.
Para solos é indicada a esterilização fracionada, que consiste em submeter o solo à esterilização
em autoclave durante três dias consecutivos a temperatura de 121ºC durante 30 minutos, ou por 1
hora em dois dias alternados. O solo poderá ser utilizado após 24 horas de repouso, tempo neces-
sário para que ocorra remoção de gases tóxicos.
ETAPAS PARA UTILIZAÇÃO DA AUTOCLAVE

1. Verificar a qualidade da água na autoclave (Figura 3.1) e, caso necessário, a mesma deverá ser
drenada e substituída por água potável limpa. O volume de água deverá tocar o suporte do cesto
de inox. Para a autoclave digital, devemos utilizar água destilada e seguir as recomendações do
fabricante;
2. Abastecer a autoclave com o material a ser esterilizado (importante manter um espaço de 1 cm
entre os pacotes para permitir a passagem de vapor);
3. Fechar o equipamento, tendo o cuidado para mover os manípulos de forma simétrica (rosquear
os manípulos que estão em lados opostos);
4. Abrir a válvula para saída do ar interno do equipamento, evitando assim, a formação de bolsões
de ar frio, e promovendo a substituição por vapor quente;
5. Ligar a autoclave girando a chave comutadora na potência máxima e aguardar a saída de vapor
aquecido;
6. Fechar a válvula de saída de vapor (observação: somente fechar a válvula quando não conseguir
manter a mão no vapor por mais de 5 segundos);
7. Acompanhar a elevação da temperatura no manômetro e quando chegar na temperatura de 121
ºC girar a chave comutadora para a potência média, visando manter a temperatura constante.
Marcar o tempo de esterilização;
8. Ao término do tempo de esterilização, desligar a autoclave e aguardar a pressão chegar a zero;
9. Abrir a válvula para a saída de vapor residual. Em seguida, com cuidado, pois ainda será liberado
vapor aquecido, que pode provocar queimaduras, abrir a autoclave e retirar o material.

20
121 0C
Válvula de segurança
Manômetro
Saída de vapor
Manípulos Válvula da saída

de vapor
Led indicativo de
equipamento ligado
Dreno para
Chave comutadora troca de água
Figura 3.1. Autoclave e seus componentes. Na parte superior está o manômetro, indicando pela seta vermelha, a marcação
que corresponde à temperatura de 121 ºC.

21
4
OBJETIVO
MEIOS DE CULTURA
Preparar meios de cultura sólidos, semissólidos e líquidos para cultivo de

bactérias e fungos.
Meios de cultura são substratos adequados ao desenvolvimento e mul-

INTRODUÇÃO tiplicação (crescimento) de microrganismos fora de seu hábitat natural
(in vitro). Eles fornecem os principais nutrientes (fontes de carbono, ni-
trogênio, fósforo, enxofre e sais minerais) indispensáveis ao metabolismo
microbiano.
Os ingredientes dos meios de cultura, geralmente, são fornecidos na forma

desidratada, sendo dissolvidos em água destilada ou deionizada durante
seu preparo. A maioria é higroscópico (absorve umidade do ar rapidamen-
te) e, por isso, os frascos devem ser cuidadosamente fechados.
Quanto ao seu estado físico, os meios de cultura podem ser líquidos,

sólidos ou semissólidos. Os meios líquidos, por sua vez, permitem um
crescimento mais rápido dos microrganismos quando comparados aos
meios sólidos; podem ser acondicionados em tubos de ensaio, em frascos
Erlenmeyer ou em balões de fundo chato.
Os meios sólidos possuem a composição do meio líquido adicionado de

um agente solidificante, o ágar, geralmente na concentração entre 1,5 e
2%. O ágar é uma mistura heterogênea de dois polissacarídeos (agarose
e agaropectina), sendo extraído de algas marinhas e possuindo tempe-
ratura de fusão de 100 ºC e de gelificação (solidificação) abaixo de 40
ºC. Além disso, o ágar é um material inerte, não sendo consumido pelos
microrganismos. Os meios sólidos, após esterilização e ainda no estado
líquido, são transferidos para placas de Petri ou para tubos de ensaio (os
tubos são posicionados de forma inclinada até a solidificação). Os meios

22
sólidos permitem o crescimento de células imobilizadas, que produzem
aglomerados macroscópicos de células, denominados colônias.
Os meios semissólidos contêm ágar em concentrações menores (de 0,7 a

1%), e são distribuídos em tubos de ensaio que são mantidos na posição
vertical. Os meios semissólidos normalmente são empregados para ava-
liar a capacidade ou não de motilidade pelos microrganismos.
PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO DO MEIO DE CULTURA

• Observar a proporção peso/volume no rótulo do meio desidratado para 1000 mL;
• Calcular a quantidade de meio (pó) para o volume que se deseja preparar. Para isso, utiliza-se a
regra de três. Conforme exemplo abaixo.
Exemplo:
Se 65 g* g 1000 mL de solução
X g** g 50 mL
Então, X = 65 x 50 / 1000
X = 3,25 g para 50 mL de água destilada
*65 g = Quantidade de meio necessário para 1000 mL de solução (indicado

no rótulo do produto)
**X g = Quantidade necessária, em gramas, para o volume desejado (50 mL)
ATENÇÃO! Quando o meio desidratado não possui ágar (caldo, ou no inglês Broth) para o preparo do
meio sólido, a quantidade de ágar deve ser calculada separadamente. No caso de meio semissólido,
a quantidade de ágar deverá ser de 1%.
• Pesar o meio de cultura em um béquer, devemos adicionar o volume de água determinado, que
deverá ser medido com a proveta e misturar com bastão de vidro;
• Meios de cultura com ágar deverão ser aquecidos no micro-ondas até a fervura do meio e dis-
solução do ágar;
• Meios de cultura líquidos não precisam ser fervidos, apenas homogeneizar e distribuir nos reci-
pientes apropriados;
• Medir o pH com papel indicador de pH e verificar se está de acordo com o descrito na embala-
gem do produto. Ajustar, se necessário, pela adição da base NaOH (promove aumento do pH) ou
ácido HCl 1N (diminui o pH). Distribuir nos recipientes desejados e tamponar. No caso de tubo

23
de ensaio distribuir o volume usando uma pipeta (esse procedimento deve ser realizado rapida-
mente, evitando-se o resfriamento e solidificação do meio);
• Identificar os recipientes com o nome do meio, data de preparo e turma. Os tubos de ensaio
devem ser dispostos em uma lata e coberta com papel pardo;
• Esterilizar os meios de cultura em autoclave a 121 ºC por 15 minutos;
• Após a esterilização os tubos de ensaio contendo meio sólido devem ser colocados na posição
inclinada até a solidificação do ágar. Os tubos de ensaio com meio semissólido devem per-
manecer na posição vertical para formar camada alta. Meios líquidos permanecem na vertical,
enquanto os meios sólidos contidos em frascos Erlenmeyer podem ser vertidos em placas de
Petri, enquanto ainda estiverem no estado líquido.
ATIVIDADES DA AULA
Equipe Meio Especificação Volume a preparar
10 tubos de ensaio com 3 mL cada. Os

Ágar nutriente tubos serão inclinados após a autoclava-
1e2 36 mL*
sólido gem, visando a obtenção de meio sólido
inclinado.
Ágar 10 tubos de ensaio com 3 mL cada. Os

Sabouraud tubos serão inclinados após a autoclava-
3e4 36 mL*
[lê-se Saborô] gem, visando a obtenção de meio sólido
sólido inclinado.
10 tubos de ensaio com 2 mL cada. Os tu-

Ágar nutriente bos serão mantidos na vertical após a au-
5e6 24 mL*
semissólido toclavagem, visando a obtenção de meio
sólido em camada alta
20 tubos de ensaio com 2 mL cada. Os

Caldo nutriente
7 tubos serão mantidos na vertical após a 44 mL*
Líquido
autoclavagem.
1 Erlenmeyer ou balão de fundo chato

com 210 mL de meio. Esse volume poderá
Ágar nutriente
8e9 ser dividido em mais de um recipiente. O 210 mL
sólido
meio de cultura será distribuído em pla-
cas de Petri após autoclavagem.
1 Erlenmeyer ou balão de fundo chato

Ágar com 210 mL de meio. Esse volume poderá
10 Sabouraud ser dividido em mais de um recipiente. O 210 mL
Sólido meio de cultura será distribuído em pla-
cas de Petri após autoclavagem.
* Volume adicionado de 20% a mais do que seria necessário, devido as perdas de meio aderido ao recipiente.

24
COMPOSIÇÃO DE ALGUNS MEIOS UTILIZADOS NA MICROBIOLOGIA
Meios de cultura para Bactérias
Caldo Nutriente (Nutrient Broth) – Meio líquido

Extrato de carne .............................. 1,0 g
Extrato de levedura ......................... 2,0 g
Peptona ........................................... 5,0 g
Cloreto de sódio .............................. 5,0 g
Água destilada ................................. 1.000 mL
pH 6,8 ± 0,2
Ágar Nutriente – Meio sólido

Extrato de carne .............................. 1,0 g
Extrato de levedura ......................... 2,0 g
Peptona ........................................... 5,0 g
Cloreto de sódio .............................. 5,0 g
Ágar ................................................. 20,0 g
Água destilada ................................. 1.000 mL
pH 7,4 ± 0,2
Ágar Nutriente – Meio semissólido

Extrato de carne ............................... 1,0 g
Extrato de levedura .......................... 2,0 g
Peptona ............................................ 5,0 g
Cloreto de sódio ............................... 5,0 g
Ágar .................................................. 10,0 g
Água destilada .................................. 1.000 mL
pH 7,4 ± 0,2
Ágar Mueller Hinton

Extrato de carne............................... 2,0 g
Hidrolisado ácido de casaína........... 17,5 g
Amido .............................................. 1,5 g
Ágar.................................................. 15,0 g
Água destilada.................................. 1.000 mL
pH 7,3 ± 0,2

25
Meio de cultura para Fungos
Ágar Sabouraud – Meio sólido para cultivo da maioria dos fungos

Dextrose ........................................... 20,0 g
Peptona de carne ............................. 5,0 g
Peptona de caseína .......................... 5,0 g
Ágar .................................................. 15,0 g
Água destilada .................................. 1.000 mL
pH 5,6 ± 0,2

26
5
OBJETIVO
TÉCNICAS DE
CULTIVO E
ISOLAMENTO DE
BACTÉRIAS
Demonstrar as técnicas de manipulação assépticas empregadas no culti-

vo de bactérias em meios líquido, sólido e semissólido.
Para a identificação e avaliação de populações de microrganismos obti-

INTRODUÇÃO dos de diferentes fontes e ambientes é imprescindível que se trabalhe com
uma cultura pura em condições de laboratório. Uma cultura pura é aquela
que contém apenas uma espécie microbiana e que, consequentemente,
produzirá colônias com características semelhantes quando cultivadas
em meio sólido em placas de Petri.
Para o crescimento controlado dos microrganismos em ambiente labora-

torial diversos fatores físico-químicos devem ser fornecidos, dentre eles
destacam-se os nutrientes essenciais, o pH do meio de cultura, a tempe-
ratura, a osmolaridade, a disponibilidade de água e a tensão de oxigênio.
O cultivo de bactérias em meio de cultura que possua todos os requisi-

tos nutritivos e fatores ambientais favoráveis, inicia-se o metabolismo,
passando pelas diversas fases da Curva de Crescimento em sistema fe-
chado (fase de adaptação ou lag, fase logarítmica ou exponencial, fase
estacionária e fase de morte ou de declínio). Para diversas bactérias o
crescimento é observado no período de apenas 16 horas; outras, entretan-
to, precisam de 24 a 48 horas de incubação para exibirem seu crescimento
(turvação em meio líquido ou aparecimento de colônias em meio sólido).
CUIDADOS IMPORTANTES A SEREM OBSERVADOS ANTES E DURANTE

O MANUSEIO DOS MICRORGANISMOS
• Retirar relógio, pulseira, anel e outros acessórios que possam interferir no manuseio dos mi-
crorganismos;

27
• Verificar se todo o material necessário ao trabalho está próximo de você (alça de semeio, eti-
quetas, lápis, placas e tubos de ensaio contendo meios de cultura);
• Trabalhar sempre dentro da zona de manipulação asséptica do bico de Bunsen ou lamparina,

que compreende uma área com cerca de 10 cm de raio (20 cm de diâmetro), ao redor da chama
(Figura 5.1);
Figura 5.1. Zona de manipulação asséptica no bico de Bunsen ou lamparina.
• A alça de semeio deverá ser flambada antes e depois de qualquer semeadura, ou seja, deverá
ser aquecida ao rubro na chama do bico de Bunsen ou lamparina. Também deve ser feita uma
passagem rápida de 5 cm do cabo de Kolle pela chama;
• Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri) com meio de cultura deverão ser abertos pró-
ximos a fonte de calor, e as bocas dos tubos deverão ser aquecidas antes e após a semeadura.
Nunca colocar o tampão de algodão e as tampas das placas de Petri sobre a bancada;
• O semeio dos microrganismos deverá ser realizado individualmente. Dessa forma, cada aluno
realizará sua atividade sem a ajuda do colega.
TÉCNICAS DE CULTIVO DE BACTÉRIAS
a. Cultivo em meio líquido
• Etapa 1: Segurar a alça de semeio, que possui extremidade arredondada, com a mão direita,
flambar até o rubro, deixar a alça esfriar perto da chama e, em seguida, pegar o tubo contendo
a cultura com a mão esquerda, retirar o tampão com os dedos mínimos e anelar da mão direi-
ta, flambar a boca do tubo, introduzir a alça de semeio até tocar o meio e retirar um pouco do
crescimento bacteriano (inóculo), flambar novamente a boca do tubo, recolocar o tampão de

28
algodão, colocar o tubo na estante. A alça contendo o inóculo microbiano deve permanecer na
área de manipulação asséptica da chama até ser transferida para o novo meio de cultura;
• Etapa 2: Pegar o tubo com o meio líquido Caldo Nutriente com a mão es-
querda, retirar o tampão de algodão como indicado acima, flambar a boca
do tubo, colocar a alça com inóculo no interior do tubo até atingir o meio
e agitar delicadamente (Figura ao lado). Retirar a alça, flambar novamente
a boca do tubo, recolocar o tampão de algodão, colocar o tubo na estante,
flambar a alça de semeio, etiquetar o tubo semeado.
b. Cultivo em meio sólido (ágar inclinado)
• Etapa 1: Retirar o inóculo bacteriano, procedendo como na Etapa 1 do cul-

tivo em meio líquido;
• Etapa 2: Pegar o tubo com o meio sólido inclinado com a mão esquerda,
retirar o tampão de algodão como mencionado anteriormente, flambar a
boca do tubo, introduzir a alça com inóculo o mais interno do tubo sem
tocar o meio ágar Nutriente (Figura ao lado, 1). Em seguida, encostar deli-
cadamente a ponta da alça na superfície do meio e proceder a semeadura
fazendo estrias (Figura ao lado, 2), retirar a alça, flambar novamente a boca
do tubo, recolocar o tampão de algodão, colocar o tubo na estante, flambar
a alça de semeio, etiquetar o tubo semeado.
c. Cultivo em meio semissólido por picada (ágar em camada alta)
• Etapa 1: Retirar o inóculo bacteriano com a agulha de semeio, procedendo

como na Etapa 1 do cultivo em meio líquido;
• Etapa 2: Pegar o tubo com o meio semissólido com a mão esquerda, retirar
o tampão de algodão como mencionado acima, flambar a boca do tubo, in-
troduzir a agulha com inóculo no meio de cultura ágar Nutriente até próxi-
mo ao fundo do tubo de forma linear (Figura ao lado), retirar a agulha, flam-
bar novamente a boca do tubo, recolocar o tampão de algodão, colocar o
tubo na estante, flambar a agulha de semeio, etiquetar o tubo semeado.
d. Cultivo em meio sólido em placa de Petri pela técnica de esgotamento (estria

composta)
• Etapa 1: Retirar o inóculo bacteriano, procedendo como na Etapa 1 do cultivo em meio líquido;
• Etapa 2: Segurar a placa de Petri com a mão esquerda e flambar as bordas, apoiar a placa na
palma da mão e abrir com os dedos polegar e indicador, encostar a alça contendo inóculo na
borda superior do meio de cultura. A seguir, iniciar a semeadura em estrias, mais próximo ini-
cialmente e, a seguir, distanciar as estrias (como na Figura abaixo, 1). Fechar a placa e girá-la
em 90º e iniciar uma segunda estria passando a alça uma única vez pelo setor 1 já estriado
(como na Figura abaixo, 2), repetir esse procedimento como mostrado em 3 e 4. Tente apro-

29
veitar toda a superfície do meio ágar Nutriente, não pressionando demais para evitar perfurar o
meio. Fechar a placa e flambar a alça de semeio, etiquetar o verso da placa.
e. Cultivo em meio sólido em placa de Petri pela técnica de esgotamento estrias

em T
• Etapa 1: Dividir a placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta de retroprojetor na
parte de baixo da placa, como nas Figuras abaixo;
• Etapa 2: Proceder com o método de estria composta como descrito em “d”, porém, preenchendo
apenas os 3 quadrantes delimitados na placa com a caneta de retroprojetor.
BACTÉRIAS A SEREM UTILIZADAS NA AULA PRÁTICA
Bactéria Gram/Forma Importância
Possui efeito benéfico na restauração da microbiota in-

Bacillus cereus Positivo/Bacilo testinal e também promove a síntese de vitaminas do
complexo B como probióticos (fármaco Biovicerin®).
Em humanos causa infecções cutâneas piogênicas, into-

Positivo/Coco com ar-
Staphylococcus xicação e em pacientes imunocomprometidos pode cau-
ranjo de estafilococo
aureus sar infecções sistêmicas. Em outros animais causa mas-
(em cachos)
tite, dermatite, infecções supurativas, artrite.
Positivo/Coco com ar- Membro da microbiota dos seres humanos e outros ani-
Sarcina sp. ranjo em cubo com 8 mais monogástricos, sendo citado raramente como pató-
células geno oportunista em imunocomprometidos.
Em seres humanos e outros animais pode causar infec-

Escherichia coli Negativo/Bacilo ções do trato urinário, doenças diarreicas, bacteremia
(bactérias na corrente sanguínea) e septicemia.

30
6
OBJETIVO
COLORAÇÃO DIFERENCIAL
DE GRAM
Observação de formas e
arranjos de bactérias
Realizar a coloração diferencial de Gram e observar as formas e os arranjos

de bactérias, diferenciando-as como Gram-positivas ou Gram-negativas.
A coloração de Gram constitui-se de um método de dupla coloração,

INTRODUÇÃO introduzido na Microbiologia pelo médico dinamarquês Hans Christian
Gram, em 1884. Essa técnica é muito utilizada no estudo taxonômico das
bactérias, pois permite diferenciar as bactérias em dois grandes grupos,
Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo com as diferenças nas com-
posições e estruturas das paredes celulares.
A coloração diferencial de Gram é o início do processo de identificação

de uma cultura bacteriana. Além disso, uma vez identificada a coloração
de Gram de uma cultura, podemos definir o agente antibacteriano mais
indicado para aqueles microrganismos infecciosos.
A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração

de Gram, sendo indicado cultivos com no máximo de 48 horas. Em cultu-
ras envelhecidas, células Gram-positivas, frequentemente, coram-se de
Gram-negativas (resultando em um falso Gram-negativo), uma vez que
enzimas líticas são secretadas podendo danificar a parede celular bacte-
riana, acelerando a permeabilidade ao solvente (etanol-acetona) impedin-
do assim, a retenção do complexo cristal violeta-iodo no interior dessas
bactérias.
As formas bacterianas e os arranjos celulares são caraterísticos de cada

espécie, podendo a célula ter formato de coco, bacilo ou bastonete, espi-
roqueta, espirilo e vibrião. As bactérias podem se separar após a multipli-
cação ou permanecer unidas pelas paredes celulares formando arranjos
característicos como podemos observar na figura que segue.

31
COCOS BACILOS OUTRAS FORMAS
coco espiroqueta
bacilo
tétrade
diplococo espirilo
diplobacilo
sarcina
estreptobacilo vibrião
estreptococo
“paliçada” cocobacilo
estafilococo
Figura 6.1. Formas e arranjos mais comuns das bactérias.
PREPARO DO ESFREGAÇO
• Utilizar lâminas de microscopia limpas;
• Identificar com uma etiqueta na parte fosca da extremidade da lâmina, o nome da bactéria abre-
viado (utilizar lápis, pois a marcação à tinta de caneta pode ser removida pelo etanol);
• Adicionar com uma pipeta de Pasteur uma gota de água destilada estéril no centro da lâmina.
Caso a cultura bacteriana esteja em meio líquido não há necessidade de adicionar essa gota de
água;
• Com a alça de semeio (extremidade arredondada) retirar um pouco do crescimento bacteriano

(inóculo);
• Fazer o esfregaço: depositar o inóculo sobre a água e espalhar com movimentos circulares da
alça, obtendo um esfregaço fino e uniforme. Terminado o processo, flambar a alça;
• Para fixar o esfregaço, segure a lâmina com uma pinça e passe-a três vezes sobre a chama,
com o lado que contém o inóculo voltado para cima; não aquecer demais para evitar de danifi-
car as células do esfregaço;
• Submeter o esfregaço ao processo de coloração.

32
ETAPAS DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM
1. Cobrir o esfregaço com o corante Cristal Violeta por 1 minuto;
2. Remover o excesso de corante com água corrente;
3. Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto;
4. Remover o excesso de lugol com água corrente;
5. Com a lâmina inclinada, gotejar a mistura de etanol-acetona na parte superior da lâmina;
6. Remover o excesso de etanol-acetona com água corrente;
7. Cobrir o esfregaço com o corante Safranina ou Fucsina de 30 a 60 segundos;
8. Remover o excesso de corante com água corrente;
9. Remover o resíduo de água com papel absorvente pressionado levemente a lâmina ou a deixe
secar em temperatura ambiente;
10. Observar em objetiva de 100X utilizando óleo de imersão.
INTERPRETAÇÃO DAS ETAPAS DA COLORAÇÃO DE GRAM

Leia as informações contidas no quadro abaixo e compare-as com a Figura 6.2.
Reação e aspecto das células bacterianas

Soluções em ordem de
aplicação
Gram-positiva Gram-negativa
1- Cristal violeta Coradas em violeta Coradas em violeta
Formação do complexo cristal Formação do complexo CV-I no

2- Lugol violeta-iodo (CV-I) no interior da interior da célula, que permane-
célula, que permanece violeta. ce violeta.
Desidratação da parede celu-

Extração dos lipídios da mem-
lar, diminuição da porosidade e
brana externa da parede celular;
3- Etanol-acetona da permeabilidade; o complexo
o complexo CV-I é removido da
CV-I não pode sair da célula, que
célula, que se torna incolor.
permanece violeta.
A célula não é afetada, permane- A célula adquire o corante, tor-

4- Fucsina ou safranina
cendo violeta. nando-se vermelha ou rósea.

33
Gram-positiva Gram-negativa
Fixação
Cristal Violeta
Lugol
Etanol-acetona
Fucsina ou Safranina
Figura 6.2. Efeito dos reagentes e corantes sobre as células bacterianas nas etapas da coloração de Gram.

34
7
OBJETIVO
ANTIBIOGRAMA
Verificar a ação de antimicrobianos no crescimento in vitro de bactérias,

utilizando a técnica de disco difusão ou método de Kirby-Bauer.
A determinação in vitro da resistência ou sensibilidade de um microrga-

INTRODUÇÃO nismo a vários agentes antimicrobianos denomina-se antibiograma. Este
teste é útil, não apenas para orientar o tratamento clínico, mas também
para a investigação epidemiológica e para determinar o espectro antimi-
crobiano de uma nova substância artificial ou natural, como por exemplo,
óleos e extratos vegetais.
O método padrão para realização do antibiograma é a técnica de disco

difusão ou método Kirby-Bauer (Figura 7.1). No entanto, existem outras
técnicas como a diluição em tubos com meio líquido (determinação da
concentração mínima inibitória), no qual são preparadas diluições seria-
das do antimicrobiano e inoculadas com culturas bacterianas e, posterior-
mente, verifica-se a inibição do crescimento pela ausência de turvação do
meio de cultura ou por medição colorimétrica (Figura 7.2). Outro método
é denominado Etest® (Figura 7.1), que consiste em uma fita contendo um
gradiente de concentração para se determinar, quantitativamente, a sen-
sibilidade ou resistência a um determinado antimicrobiano.
Os agentes antimicrobianos utilizados na prática clínica têm os padrões

de interpretação recomendados pelo Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI). Desta forma, a interpretação da ação da droga testada
é realizada medindo-se os halos de inibição do crescimento bacteriano
ao redor dos discos impregnados com antibióticos, comparando com
padrões interpretativos dos diâmetros de halos de inibição, os quais são
considerados pelos Laboratórios de Microbiologia Clínica, indicando re-
sistência (R), intermediário (I) ou sensibilidade (S).

35
Os agentes antimicrobianos destinados ao teste de antibiograma são co-
mercializados na forma de discos, impregnados com concentrações de-
finidas, sendo específicos para diferentes grupos de bactérias, tais como
bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e enterobactérias.
Zonas ou halos
de inibição
Crescimento
bacteriano
Disco difusão Etest®
Figura 7.1. Testes de disco difusão e Etest. Observe o crescimento microbiano pela formação de um tapete de células.
concentração do antimicrobiano
Crescimento microbiano visível Ausência de crescimento
Figura 7.2. Teste de diluição em tubo. O tubo indicado pelo * contém a Concentração Mínima Inibitória (CMI) do
antimicrobiano.

36
TÉCNICA PARA REALIZAÇÃO DO TESTE DE ANTIBIOGRAMA
Preparo do inóculo
1. Cultivar a bactéria em meio àgar nutriente por 16 a 24 horas (elas
devem estar na fase Log de crescimento)
2. Coma alça de semeio, coletar um pouco do

inóculo, tendo o cuidado para não remover
fragmentos do meio.
3. Transferir o inóculo para o tubo contendo solução salina estéril (NaCl a

0,9% p/v) e homogeinizar com o agitador de tubos.
Salina estéril
4. Comparar a turbidez do tubo com a escala 0,5 de McFarland (turbidez

correspondente a 1 x 108 células/mL). Se necessário, transferir
mais inóculos para o tubo com a salina até a obtenção da turbidez
desejada.
Suspensão Escala 0,5 de

bacteriana McFarland

37
Semeio da bactéria
Ágar Mueller-Hinton
1. Semeio da bactéria no ágar Mueller Hinton.

Parte 1
Embeber um swab estéril na suspensão bacteriana (inó-
culo), remover o excesso precionando o swab contra
a parede do tubo e espalhar o inóculo na superfície do
ágar Mueller Hinton. Cobrir toda a superfície do meio.
Suspensão bacteriana
(1x108 células mL)
Parte 2
Girar a placa em 90 graus e repetir o proces-
so de estriagem, com o mesmo swab e sem
carregá-lo com mais suspensão bacteriana.
Aguardar 5 minutos antes de aplicar os dis-
cos com os antimicrobianos.
2. Depositar os discos contendo os antimicrobianos sobre o meio.

Use uma pinça flambada e resfriada para manusear os discos e posicioná-los no meio de cultura
(manter uma distância de 25 mm entre os discos).
Disco com antimicrobiano
3. Incubar as placas de teste.

Incubar as placas a 35 ± 2 0C por 16 a 24 horas, em posição in-
vertida. A temperatura e os tempos mínimos e máximos de incu-
bação para cada espécie bacteriana são estabelecidos pelo CLSI.

38
Avaliação do antibiograma Medição do halo
1. Medir os halos de inibição

Ao término do período de incubação, medir o tamanho
dos halos de inibição com uma régua ou paquímetro
e comparar com a tabela fornecida pelo fabricante do
antimicrobiano ou com os valores determinados pelo
CLSI e classificar o microrganismo como resistente (R), Crescimento
intermediário (I) ou sensível (S). bacteriano
Halo de inibição
INTERPRETAÇÃO COM OS PADRÕES DO CLSI

Durante a prática poderão ser testadas as bactérias Gram-negativa Escherichia coli e Gram-positiva
Staphylococcus aureus. Para cada bactéria utilizar dois agentes antimicrobianos recomendados na
Tabela 1.
Tabela 1. Padrões interpretativos dos diâmetros de halos de inibição para bactérias, aprovados pelo
CLSI (2020), a serem considerados pelos Laboratórios de Microbiologia Clínica.
Diâmetro do Halo de Inibição

Microrganismo/ Agente Conteúdo do (mm)
grupo Antimicrobiano Disco
R I S
Ampicilina 10 µg ≤13 14–16 ≥17
Amoxicilina +
20/10 µg ≤13 14–17 ≥18
Ácido Clavulânico
Ceftazidima 30 µg ≤17 18–20 ≥21

Enterobacteriaceae
Imipenem 10 µg ≤19 20–22 ≥23
Levofloxacino 5 µg ≤13 14–16 ≥17
Gentamicina 10 µg ≤12 13–14 ≥15
Penicilina 10 µg ≤28 – ≥29
Norfloxacino 10 µg ≤12 13–16 ≥17

Staphylococcus
Gentamicina 10 µg ≤12 13–14 ≥15
aureus
Eritromicina 15 µg ≤13 14–22 ≥23
Tetraciclina 30 µg ≤14 15–18 ≥19

39
8
OBJETIVO
TÉCNICAS DE CULTIVO
DE FUNGOS
Realizar técnicas de cultivo de fungos, bem como confeccionar micro

cultivos.
Os fungos possuem uma ampla diversidade morfológica, podendo ser

INTRODUÇÃO unicelulares (leveduras) ou multicelulares (fungos filamentosos) e al-
guns, principalmente as formas patogênicas, exibem dimorfismo (apre-
sentam duas formas de crescimento: leveduriforme e filamentosa, de-
pendendo dos fatores físico-químicos). As leveduras são constituídas
de células ovais ou esféricas com 1–5 µm de diâmetro por 5–30 µm de
comprimento, crescem formando colônias cremosas, pastosas ou mu-
coides semelhante às das bactérias.
Os fungos filamentosos, por outro lado, são formados por células tubu-
lares (hifas com 2–10 µm) e o conjunto dessas células é denominado
micélio. As hifas podem ser contínuas (hifas cenocíticas ou assepta-
das) ou apresentar divisões transversais (hifas septadas). Em meio de
cultura, as colônias de fungos filamentosos podem apresentar aspectos
variados tais como: algodonoso, aveludado, coriáceo e pulverulento.
A identificação das leveduras, assim como das bactérias, envolve uma

série de testes bioquímicos. Entretanto, os fungos filamentosos são ge-
ralmente identificados pelos aspectos macro e microscópicos, incluindo
características da colônia, das estruturas vegetativas e reprodutivas.
Para auxiliar na identificação do fungo filamentoso pode ser utilizada

a técnica de microcultivo, que envolve o crescimento do fungo numa
superfície pequena, permitindo a observação da origem das estruturas
reprodutivas, como também a visualização de estruturas em arranjo na-
tural, sem a destruição da arquitetura de crescimento.

40
TÉCNICAS DE CULTIVO DE LEVEDURAS
a. Cultivo em meio sólido (ágar inclinado)
Etapa 1: Segurar a alça de semeio (extremidade arredondada) com a mão direita, flambar até
o rubro, aguardar a alça esfriar ainda na zona de manipulação asséptica do bico de Bunsen
ou lamparina, pegar o tubo contendo a cultura com a mão esquerda, retirar o tampão com os
dedos mínimos e anelar da mão direita, aquecer rapidamente a boca do tubo, introduzir a alça
de semeio até tocar o meio e retirar uma alíquota da levedura (inóculo), aquecer rapidamente a
boca do tubo, recolocar o tampão de algodão, colocar o tubo na estante. Lembre-se de manter
a extremidade da alça contendo o inóculo dentro da área de manipulação asséptica da chama;
Etapa 2: Pegar o tubo com o meio sólido inclinado

ágar Sabouraud com a mão esquerda, retirar o tam-
pão de algodão como mencionado anteriormente,
aquecer rapidamente a boca do tubo, introduzir a
alça com o inóculo o mais interno do tubo sem to-
car o meio ágar Sabouraud (Figura ao lado, 1). Em
seguida, encostar delicadamente a ponta da alça na
superfície do meio e proceder a semeadura fazen-
do estrias (Figura ao lado, 2), retirar a alça, aquecer
rapidamente a boca do tubo, recolocar o tampão de
algodão, colocar o tubo na estante, flambar a alça
de semeio, etiquetar o tubo semeado
1 2
b. Cultivo em meio sólido em placa de Petri

Etapa 1: Retirar o inóculo da levedura, procedendo
como na Etapa 1 de “a”;
Etapa 2: Pegar a placa de Petri com a mão esquerda

e flambar as bordas, apoiar a placa na palma da mão
e abrir com os dedos polegar e indicador, encostar
a alça contendo inóculo no meio de cultura ágar
Sabouraud e iniciar a semeadura em estria simples
(Figura ao lado), aproveitando toda a superfície do
meio sem perfurá-lo, fechar a placa e flambar no-
vamente as bordas e a alça de semeio e, por fim,
etiquetar.

41
TÉCNICAS DE CULTIVO DE FUNGOS FILAMENTOSOS
a. Cultivo em meio sólido (ágar inclinado)
Etapa 1: Segurar a alça de semeio (extremidade em L) com a mão direita, flambar até o ru-
bro, aguardar a alça esfriar ainda na zona de manipulação asséptica do bico de Bunsen
ou lamparina, pegar a placa de Petri contendo a cultura do fungo com a mão esquerda
e flambar as bordas, apoiar a placa na palma da mão e abrir com os dedos polegar e indi-
cador, remover um bloco contendo micélio e/ou estruturas reprodutivas juntamente com
um pouco de meio de cultura (Figura 8.1), fechar e flambar novamente as bordas da placa;
Etapa 2: Pegar o tubo com o meio sólido inclinado ágar Sabouraud com a mão esquerda, retirar
o tampão de algodão como indicado acima, flambar a boca do tubo, colocar a alça com inóculo
dentro do tubo e depositar o bloco contendo as estruturas do fungo filamentoso no centro da
área inclinada (com a parte do crescimento fúngico em contato com o meio) (Figura 8.1), flambar
novamente a boca do tubo, recolocar o tampão de algodão, colocar o tubo na estante, flambar a
alça de semeio, etiquetar o tubo semeado.
Alguns dias após

incubação
Cultura pura
Figura 8.1. Transferência de fungo filamentoso para um tubo com ágar inclinado usando alça em L.

42
b. Cultivo em meio sólido em placa de Petri
Etapa 1: Retirar o inóculo fúngico, procedendo como na Etapa 1 de “a”;
Etapa 2: Pegar a placa de Petri contendo a cultura do fungo com a mão esquerda e flambar as
bordas, apoiar a placa na palma da mão e abrir com os dedos polegar e indicador, depositar o
bloco contendo as estruturas do fungo no centro da placa (com a parte do crescimento fúngico
em contato com o meio ágar Sabouraud), fazendo suave pressão (Figura 8.2), fechar e flambar
novamente as bordas da placa e a alça de semeio em L.
Alguns dias após

incubação
Cultura pura
Figura 8.2. Transferência de fungo filamentoso para placa de Petri contendo meio sólido usando alça em L.
MICROCULTIVO DE FUNGOS FILAMENTOSOS
Preparo da placa para microcultivo e semeio do fungo

Etapa 1: Esterilizar placas de Petri contendo em seu interior um disco de papel filtro, um suporte
para lâminas (canudo plástico dobrado em triângulo ou fita adesiva), uma lâmina de microsco-
pia e duas lamínulas;
Etapa 2: Transferir com auxílio de uma alça esterilizada um disco de meio de cultura ágar
Sabouraud para cada extremidade da lâmina contida no interior da placa esterilizada;
Etapa 3: Abrir a placa próximo a chama e transferir para as duas extremidades de cada disco
fragmentos da cultura de um fungo filamentoso e cobrir com uma lamínula. Umedecer o papel
filtro com água destilada esterilizada para obtenção de uma atmosfera úmida durante a incubação

43
Lâmina de microscopia
Disco de ágar Sabouraud Crescimento fúngico
Lamínula
Papel filtro Suporte
Figura 8.3. Detalhes da placa de microcultivo de fungos filamentosos.
FUNGOS A SEREM UTILIZADOS NA AULA PRÁTICA
Fungo Classificação Importância
Leveduras
Levedura encontrada na superfície

Reino Fungi
de frutos e que possui efeitos positi-
Rhodotorula sp. Filo Basidiomycota vos no controle de doenças de plan-
tas; um potencial agente de controle
biológico.
Levedura inócua, utilizada em apli-

Reino Fungi cações industriais como panifica-
Saccharomyces cerevisiae
Filo Ascomycota ção, produção de bebidas alcoólicas
etc
Fungos Filamentosos
Existem espécies patogênicas, dete-

Reino Fungi rioradores de alimentos e outras são
Aspergillus sp. empregadas na produção de alimen-
Filo Ascomycota tos ou produtos comerciais como
ácido cítrico e ácido gálico.
Forma perfeita (sexuada) de espé-

Reino Fungi cies do gênero Aspergillus, causado-
Emericella sp. res de diversas doenças, a exemplo
Filo Ascomycota da podridão em amendoim e mofo
preto em alho e cebola.

44
Reino Fungi Causa decomposição em frutos; em
Rhizopus stolonifer diabéticos pode causar lesões rino-
Filo Zygomycota cerebrais (região nasal e cérebro).
Algumas espécies são patogênicas,

Reino Fungi outras são produtoras de antibióti-
Penicillium sp.
Filo Ascomycota cos ou utilizadas na fabricação de
alimentos (Penicillium roqueforti).
Patógeno foliar em vegetais (inha-

Reino Fungi me, tomate, couve); como agen-
Alternaria alternata te oportunista pode causar lesões
Filo Ascomycota cutâneas e onicomicose (micose em
unhas).
Patógeno vascular em diversas

plantas que causam doenças deno-
minadas murchas. No homem pode
Reino Fungi causar lesões oculares, em unhas
Fusarium oxysporum
Filo Ascomycota e em tecido subcutâneo. Em imu-
nocomprometidos tem sido citado
como agente causal de infecções
sistêmicas.
Espécies de fungos comestíveis que

Agaricus bisporus Reino Fungi formam corpo de frutificação que
Lentinus edodes Filo Basidiomycota são ricos em proteínas, vitaminas e
sais minerais.

45
9
OBSERVAÇÃO DE
ESTRUTURAS SOMÁTICAS
E REPRODUTIVAS DOS
FUNGOS
Identificar estruturas vegetativas ou somáticas e reprodutivas de leve-

OBJETIVO duras e fungos filamentosos.
Na observação microscópica de leveduras, deve-se analisar as caracte-

INTRODUÇÃO rísticas da célula somática como: forma, tamanho, presença ou ausência
de cápsula e pseudo-hifa. E também, características de reprodução: bro-
tamento (blastoconídio) e artrósporos.
Nos fungos filamentosos, além dos elementos supracitados, devemos

analisar o diâmetro da hifa, a presença ou ausência de septos (hifas
septadas ou hifas asseptadas) e de pigmentação. Devemos observar
também a existência de estruturas diferenciadas na hifa, como: rizóides,
clamidósporos e artrósporos. No micélio com estruturas de reprodu-
ção são analisados se os esporos são endógenos (formados dentro de
esporângios, ou em ascos e basídios) ou se são exógenos (formados
em conidióforos). Com relação aos esporos, deve-se observar a forma,
o tamanho e a cor, bem como a presença de septos e ornamentação.
Pode-se observar, ainda, a existência de corpos de frutificação: perité-
cios, apotécios, cleistotécios e ascostromas.
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO MICROSCÓPICA

a. Preparação microscópica a partir de cultivo em meio sólido (observação de leveduras)
• Adicionar uma gota de corante azul de Amann no centro da lâmina de microscopia;
• Com a alça de semeio coletar um pouco de massa celular do crescimento de leveduras (sem
coletar o meio de cultura) e espalhar as células na água destilada fazendo movimentos cir-
culares;

46
• Cobrir a preparação com uma lamínula e observar ao microscópio, inicialmente com a ob-
jetiva de 10X e depois com a de 40X, obtendo aumentos de 100X e 400X, respectivamente.
ATENÇÃO! Não se utiliza a objetiva de 100X com fungos filamentosos e leveduras.
b. Preparação microscópica a partir de cultivo em meio sólido (observação de fun-

gos filamentosos)
• Adicionar uma gota de corante azul de Amann no centro da lâmina de microscopia;
• Com a alça de semeio (extremidade em L) remover um pequeno fragmento de crescimento

fúngico e depositar no corante;
• Cobrir a preparação com uma lamínula e com auxílio de uma pinça fazer leve pressão;
• Retirar o excesso de corante com papel absorvente e fazer observação ao microscópio de

estruturas somáticas e reprodutivas utilizando objetivas de 10X e 40X.
c. Preparação microscópica utilizando fita adesiva (observação de fungos filamen-

tosos)
• Pressionar levemente um pedaço de fita adesiva, usando um tubo de ensaio como suporte,
na superfície de um micélio crescido em placa;
• Transferir a fita adesiva contendo fragmento de micélio para uma lâmina de microscopia
contendo uma gota de corante azul de Amann;
• Retirar o excesso de corante com papel absorvente e fazer observação ao microscópio de

estruturas somáticas e reprodutivas utilizando objetivas de 10X e 40X.
d. Preparação microscópica para observação de fungos filamentosos cultivados

pela técnica de microcultivo
• Com auxílio de uma pinça, remova a lamínula do microcultivo para uma lâmina contendo
uma gota de azul de Amann, tendo o cuidado para evitar formação de bolhas; o lado da la-
mínula contendo o fungo deverá estar em contato com o corante.
• Retirar o excesso de corante com papel absorvente e observar ao microscópio utilizando

objetivas de 10X e 40X.

47
FUNGOS A SEREM OBSERVADOS NA AULA PRÁTICA
Estruturas que podem ser

Fungo Classificação
visualizadas
Leveduras
Células esferoides, ovoides e

Reino Fungi
Rhodotorula sp. alongadas.
Filo Basidiomycota
Brotamento multilateral.
Reino Fungi Células esferoides e ovoides.

Filo Ascomycota Brotamento multilateral.
Fungos Filamentosos
Reino Fungi Hifa septada, conidióforo, vesí-

Aspergillus sp.
Filo Ascomycota cula, conidiósporos.
Reino Fungi Hifa septada, cleistotécios, as-

Emericella sp.
Filo Ascomycota cos, ascósporos.
Reino Fungi Hifa asseptada, esporangióforo,

Rhizopus stolonifer esporângio e esporangiósporos,
Filo Zygomycota rizóides.
Reino Fungi Hifa septada, conidióforo, coní-

Penicillium sp.
Filo Ascomycota dios.
Reino Fungi Hifa septada demácea, conídios

Alternaria alternata
Filo Ascomycota multiseptados.
Reino Fungi Hifa septada hialina, clamidós-

Fusarium oxysporum poros, microconídios e macro-
Filo Ascomycota conídios.
Agaricus bisporus Reino Fungi Basidiocarpo: Píleo, Himênio

(lamelas), basídios e basidiós-
Lentinus edodes Filo Basidiomycota poros.

48
ESTRUTURAS QUE DEVEM SER IDENTIFICADAS PELOS ALUNOS:
LEVEDURAS
Broto Célula parental
800X
Célula parental
Broto
400X
Rhodotorula sp.

49
FUNGOS FILAMENTOSOS
Conidiósporos
(esporos)
Vesículas
Conidióforos
Aspergillus sp.
Cleistotécio
100X Ascos
400X
Emericella sp.

50
Esporângio
(vazio)
Esporângio
(cheio)
Esporangiósporos
(esporos)
Esporangióforo
Rizoides
Rhizopus sp.
Conídios
(esporos)
Conidióforo
Hifas vegetativas
septadas
Penicillium sp.

51
Hifas septadas
demácias
Conídios
(esporos)
400X
Alternaria alternata
Microconídios
Septos
Hifas vegetativas
septadas
Fusarium sp.

52
10
OBJETIVO
QUANTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS
Determinar o número de células microbianas por microscopia ou unida-

des formadoras de colônias em meio de cultura em placa.
A quantificação dos microrganismos de uma amostra é importante para

INTRODUÇÃO avaliar, por exemplo, o grau de contaminação da água ou dos alimentos.
A quantidade de microrganismos numa amostra de solo, ou de bactérias
probióticas presentes em um leite fermentado, efetuando-se, assim, o
seu controle de qualidade.
Existem várias técnicas de contagem de microrganismos, as quais po-

dem ser realizadas de forma direta, contando-se microscopicamente o
número de células, ou indiretamente, efetuando-se análises da turbidez,
determinação da biomassa seca, concentração de substâncias químicas
(proteínas, enzimas ou um produto final de uma via metabólica, DNA,
RNA) ou através da contagem do número de colônias crescidas em placa
de Petri (método de contagem em placa). Na técnica de contagem direta
por microscopia, a amostra é corada com azul de metileno ou azul de
tripan. Utiliza-se uma lâmina especial chamada câmara de Neubauer
(Figura 10.1 A e B), sendo as células mortas identificadas pela cor azul
intensa (Figura 10.1C).
O método de contagem em placas identifica o crescimento de células

viáveis que, após incubação, produzem colônias no meio de cultura. Tais
colônias representam numericamente células individuais ou agrupadas
que foram semeadas no meio de cultura. Portanto, nem sempre o núme-
ro de colônias formadas indica o número real de células individualizadas
no meio de cultura, por isso utilizaremos o termo geral “unidades forma-
doras de colônias” (UFC) para indicar a quantidade de microrganismos
na amostra.

53
A B
Vista lateral da câmara

Amostra Lamínula
Sobra Grade de contagem
Figura 10.1. Vistas frontal e lateral da câmara de Neubauer (A); gradeamento presente na câmara de Neubauer com
destaque para os 16 quadrados presentes em cada quadrante de 1 ao 4 (B); leveduras na câmara de Neubauer com células
mortas coradas em azul e células vivas incolores (C).
Para efetuar a contagem total de microrganismos numa determinada suspensão da amostra faz-se
diluições seriadas (Figura 10.2). A partir de dada diluição, pode-se misturar uma alíquota com a
solução corante (1:2; v:v) e, a seguir, transferir a mistura para a câmara de Neubauer para observa-
ção ao microscópio. Na contagem em meio de cultura, para tal, existem dois métodos mais usuais:
Spread Plate (plaqueamento em superfície) ou Pour Plate (plaqueamento em profundidade).
Na técnica Spread Plate, o meio de cultura já se encontra solidificado na placa de Petri. Uma alíquo-
ta da diluição da amostra, geralmente 0,1 mL, é depositada na superfície do meio sólido em placa
utilizando-se uma pipeta esterilizada, seguido do espalhamento da amostra com o auxílio da alça
de Drigalski ou alça em “L”, permitindo assim, o crescimento microbiano e formação de colônias na

54
superfície do meio de cultura (Figura 10.3). Na técnica Pour Plate, adiciona-se primeiramente uma
alíquota da diluição de interesse da amostra em uma placa de Petri esterilizada, geralmente 0,5 a
1 mL. Em seguida, é adicionado o meio de cultura liquefeito mantido em banho Maria entre 40 e 45
ºC. A homogeneização do inóculo é realizada movimentando suavemente a placa sobre a bancada.
É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização, nem seja adicionado muito
quente para não matar os microrganismos. No pour plate o crescimento microbiano ocorrerá tanto
na superfície como no interior do ágar (Figura 10.3).
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
9 mL de NaCl
(0,9%) estéril
Amostra a ser
quantificada 101 102 103 104 105 Diluições
Plaqueamento de
1 mL de amostra
Número de
110 17 0
colônias
Excesso de colônias contadas
para contagem
110 X 103 = 1,1 X 105 UFC/mL

Contagem Fator de da amostra original
diluição
Figura 10.2. Diluição seriada de amostra para quantificação dos microrganismos.
Após o plaqueamento e incubação da placa em posição invertida, por tempo e temperatura ade-
quados ao microrganismo, as células vão se multiplicar dando origem às colônias. O número de
colônias quantificadas é menor quanto maior for a diluição. Por outro lado, nos tubos de menor
diluição (amostra mais concentrada) a quantidade de colônias será maior, algumas vezes sendo
impossível diferenciar as colônias entre si. Assim, idealmente devem ser escolhidas para contagem
as placas que contenham entre 30 e 300 colônias. Todavia, resultados mais confiáveis são obtidos
quando é realizada a média do número de colônias de duas placas de dada diluição.

55
Após os cálculos adequados, levando-se em conta o fator de diluição da amostra e o volume da
alíquota utilizada, é possível determinar a quantidade de microrganismos do material original.
Plaqueamento em profundidade Plaqueamento em superfície ou

ou pour plate spread plate
1,0 ou 0,1 mL 0,1 mL
1. Adicionar 1. Adicionar
inóculo numa inóculo numa
placa estéril placa contendo
o meio ágar
Diluição previamente
microbiana solidificado
2. Adicionar meio
ágar fundido
sobre o inóculo 2. Espalhar o
inóculo com a
alça de Drigalski
3. Homogeineizar
fazendo
movimento no
formato de
4. As colônias irão 3. As colônias irão

crescer em todo crescer apenas
o meio de cultura na superfície do
(na superfície e em meio de cultura
profundidade)
Colônias crescendo
em profundidade
Figura 10.3. Métodos de quantificação de células viáveis de bactérias e leveduras em profundidade (pour plate) e em
superfície (spread plate).

56
MICRORGANISMOS SUGERIDOS
Grupo de microrganismo Espécie Meio de cultura
Bacillus clausii
(Enterogermina®)
Bactéria Ágar nutriente
Bacillus cereus
(Biovicerin®)
Saccharomyces boulardii
(Floratil®)
Levedura Ágar Sabouraud
(Florax®)
PREPARO DAS DILUIÇÕES

a. DILUIÇÃO 1 x 10-1 ou 1/10: transferir 1 mL de uma cultura microbiana com 18–24 horas de
cultivo para um tubo de ensaio contendo 9 mL de salina fisiológica esterilizada (NaCl a 0,9%) e
agitar a suspensão (conforme exemplificado na figura 10.1);
b. DILUIÇÃO 1 x 10-2 ou 1/100: transferir 1 mL da suspensão anterior para um tubo de ensaio
contendo 9 mL de salina esterilizada e agitar o tubo;
c. DILUIÇÃO 1 x 10-3 ou 1/1.000: transferir 1 mL da suspensão anterior para um tubo de ensaio
contendo 9 mL de salina esterilizada e agitar o tubo.
d. DILUIÇÃO 1 x 10-4 ou 1/10.000: transferir 1 mL da suspensão anterior para um tubo de ensaio
e. DILUIÇÃO 1 x 10-5 ou 1/100.000: transferir 1 mL da suspensão anterior para um tubo de ensaio
f. DILUIÇÃO 1 x 10-6 ou 1/1.000.000: transferir 1 mL da suspensão anterior para um tubo de ensaio
CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER
• Misturar 0,5 mL da diluição 10-5 + 0,5 mL do azul de Tripan (ou azul de metileno) em um tubo de
ensaio;
• Adicionar a lamínula sobre a Câmara de Neubauer e, a seguir, uma alíquota da suspensão ante-
rior (normalmente 1 gota ou 10 µL);
• Contar as células viáveis em 4 quadrados (Figura 10.4) em um dos quatro quadrantes (Figura
10.1B).

57
Contar apenas a
célula parental
Contar a célula
parental e o broto
Figura 10.4. Esquema da contagem de células na câmara de Neubauer. Inicia-se a contagem no quadrado 1, seguindo na
direção das setas azuis e finalizando no quadrado 16. Os 16 quadrados representam um quadrante da câmara.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

Exemplo:
Quadrado 1 = 25 células
Média = 25 células x 16 quadrados = 400 células
Se 400 células g 0,0001 mL (Volume de um quadrante)
X células g 1 mL
Então, X = (400 x 1) g X = 4.000.000 células/mL

0,0001
O valor encontrado em X deverá ser multiplicado pelo fator de diluição (tubo da diluição de
onde foi aliquotado para contagem na câmara) e pela diluição realizada com o corante.
Assim, temos: 4.000.000 células x 105 (fator diluição) x 2 (diluição corante) g
A amostra possui 800.000.000.000 células/mL ou 8 x 1011 células/mL.
ATENÇÃO! Por convenção o valor final deve ser expresso como células/mL com uma casa de-
cimal somente, entre 1 e 9 (Exemplo: 8 x 1011 células/mL e não 800.000.000.000 células/mL).

58
CONTAGEM EM MEIO DE CULTURA SÓLIDO EM PLACA
a. Técnica Spread Plate: indicada para contagem de aeróbios estritos ou anaeróbios

facultativos
• Identifique duas placas de Petri contendo meio de cultura apropriado com o nome do mi-
crorganismo e a diluição 10-4. Repetir essa etapa com mais duas placas anotando a diluição
10-5;
• Com uma pipeta esterilizada, retirar 0,2 mL da diluição 10-5 e transferir 0,1 mL para a placa
contendo o meio e o restante (0,1 mL) para outra placa;
• Repetir o procedimento anterior com a diluição 10-4 (utilizando a mesma pipeta) para duas
novas placas;
• Flambar a alça de Drigalski. Para isso, passar a extremidade triangular da alça que estava
depositada em um recipiente com etanol 96% pela chama da lamparina ou bico de Bunsen; o
etanol presente na alça irá queimar; aguarde o resfriamento da alça mantendo-a na zona de
manipulação asséptica da lamparina ou bico de Bunsen, após o resfriamento da alça fazer
o espalhamento do inóculo. NÃO manter a alça de Drigalski dentro da chama da lamparina
para não aquecer exageradamente (isso poderá matar as células do inóculo).
• Incubar as placas a 35 ºC (para as bactérias) e 30 ºC (para as leveduras) por 24 a 48 horas.
b. Técnica Pour Plate: indicada para contagem de anaeróbios estritos ou facultativos
• Identifique duas placas de Petri contendo meio de cultura apropriado com o nome do mi-
crorganismo e a diluição 10-6.
• Com uma pipeta estéril, aliquotar 2 mL da diluição 10-6 e transferir 1 mL para uma placa es-
téril vazia (sem meio de cultura) e o restante (1 mL) para outra placa estéril vazia;
• Fazer o mesmo com a diluição 10-5 (utilizando a mesma pipeta anterior) para duas novas
placas;
• Adicionar 20 mL do meio de cultura liquefeito contendo ágar (mantido à temperatura de

45 ºC) a cada placa. Homogeneizar o conteúdo fazendo movimentos em forma de “8” com
as placas sobre a bancada;
• Aguardar o meio de cultura solidificar e incubar as placas em posição invertida a 35 ºC (para

bactérias) e 30 ºC (para leveduras) por 24 a 48 horas.

59
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
• Contar as colônias nas diluições cujas placas apresentaram entre 30 e 300 colônias.
• Fazer a média das contagens obtidas nas duas placas de cada diluição.
Exemplo:
Placa 1 = 70 colônias
Placa 2 = 90 colônias
Média = 80 colônias
Spread Plate = 80 colônias x 105 (fator diluição) x 0,1 mL g 8 x 107 UFC/mL

Pour Plate = 80 colônias x 105 (fator diluição) x 1 mL g 8 x 106 UFC/mL
ATENÇÃO! O volume do inóculo da técnica de Spread Plate é de 0,1 mL e na técnica de Pour Plate é
de 1 mL.
Em casos onde a amostra apresenta quantidades de colônias inferiores a 30 ou superiores a 300,

realizar o cálculo de acordo com as situações abaixo:
Situação 1: Umas das placas com 30 a 300 colônias e a outra com menos de 30 ou com mais de 300.
Exemplo: diluição 10-4
placa 1 (34 colônias)

placa 2 (26 colônias)
média = 30
Resultado
Spread plate: 30 x 104 x 10 UFC/mL g 3 x 106 UFC/mL
Pour Plate: 30 x 104 UFC/mL g 3 x 105 UFC/mL
Situação 2: Duas diluições consecutivas com 30 a 300 colônias (deixar na mesma base)
Exemplo: diluição 10-4 diluição 10-5
placa 1 (240 colônias) placa 1 (33 colônias)

placa 2 (260 colônias) placa 2 (37 colônias)
média = 250 média = 35
Resultado: 25 x 105 Resultado: 35 x 105
Resultado
Spread Plate: 25 + 35 = 30 x 105 x 10 UFC/mL g 3 x 107 UFC/mL
2
Pour Plate: 25 + 35 = 30 x 105 UFC/mL g 3 x 106 UFC/mL
2

60
Situação 3: Não aparecimento de colônias na menor diluição.
placa 1 (<1 colônia)

placa 2 (<1 colônia)
média = <1
Resultado
Spread Plate e Pour Plate: <1 x 101 UFC/mL
Situação 4: Todas as diluições apresentam mais de 300 colônias. Nesse caso, escolhe-se a placa
de maior diluição e a divide em 4 quadrantes. Contam-se as colônias presentes em um desses
quadrantes.
¼ placa 1 (80 colônias) g 4 x 80 = 320

¼ placa 2 (90 colônias) g 4 x 90 = 360
média = 340
Resultado
Spread Plate: 340 x 104 x 10 UFC/mL g 3,4 x 107 UFC/mL
Pour Plate: 340 x 104 UFC/mL g 3,4 x 106 UFC/mL

61
11
OBJETIVO
CONTROLE DO
CRESCIMENTO DE
MICRORGANISMOS
Determinar a susceptibilidade de microrganismos a agentes físicos e

químicos.
O controle do crescimento microbiano pode prevenir a transmissão de

INTRODUÇÃO doenças, evitar a contaminação da água e do ambiente, além de evitar
ou retardar a deterioração dos alimentos. Estas ações são realizadas por
meio de agentes físicos e químicos, utilizando diversos processos:
• Esterilização: processo de destruição ou remoção de todas as formas

de vida microbiana, incluindo endósporos bacterianos e outras estru-
turas de resistência.
• Pasteurização: tratamento térmico moderado, seguido de resfriamen-

to rápido aplicado em alimentos para destruição de microrganismos
patogênicos e/ou deterioradores.
• Desinfecção: processo que visa à destruição de microrganismos pa-

togênicos, em superfícies ou substâncias inertes. Elimina as células
vegetativas, mas não estruturas de resistência.
• Sanitização: tratamento destinado a reduzir as contagens microbia-

nas nos utensílios alimentares a níveis seguros de saúde pública.
• Antissepsia: processo que visa à destruição ou inibição do crescimen-

to de microrganismos em tecidos e mucosas. A sanitização e a antis-
sepsia são variantes da desinfecção.
• Pressão osmótica: processo que diminui a disponibilidade de água nos

alimentos pela adição de sal ou açúcar (aumento da pressão osmótica),
retardando ou paralisando o crescimento dos microrganismos.

62
• Alteração do pH: método utilizado geralmente na indústria alimentícia
pela adição de ácidos (ex. ácido cítrico) em alimentos, diminuindo o
pH e, consequentemente, impedindo o crescimento de microrganis-
mos neutrófilos e alcalifílicos.
Os agentes antimicrobianos podem agir causando lesões na parede celu-

lar, alterações na permeabilidade da membrana citoplasmática, alterações
das moléculas de proteínas e de ácidos nucleicos, inibição da ação enzi-
mática, inibição da síntese de ácidos nucleicos, entre outros. O controle
microbiano é influenciado pelo tipo de microrganismo, estado fisiológico
das células e condições ambientais. Os agentes são considerados micro-
bicidas, quando matam os microrganismos, ou microbiostáticos, quando
apenas inibem o crescimento e multiplicação destes.
Diversos métodos a base de agentes físicos e químicos são empregados

no controle do crescimento de microrganismos, a exemplo dos citados
no quadro abaixo:
Agentes Métodos Tipos Mecanismos de ação
Raios gama
Ionizantes
Raios X
Radiação Atuam sobre o DNA
Não ionizantes Raios ultravioleta
Estufa
Calor seco Flambagem Oxidação das moléculas
Alta Incineração
temperatura Autoclave
Físicos Desnaturação das prote-
Calor úmido Água fervente
ínas
Pasteurização
Refrigeração Diminuição do metabo-
Baixa temperatura
Congelamento lismo
Membranas filtrantes
Filtração Filtros Hepa (cabine de Remoção mecânica
fluxo laminar)

63
Fenol (ácido fênico), clo- Rompem as membranas
Compostos fenólicos
rexidina, triclosan e desnaturam proteínas
Solubilização de lipídeos
Álcoois Etílico, isopropílico e Desnaturação das pro-
teínas
Compostos de cloro, dió-
Oxidação de moléculas
Halogênio xido de cloro (hipoclorito
celulares
Químicos de sódio)
Gás de peróxido de hi- Oxidação de moléculas
Peroxigênio
drogênio celulares
Quaternário de amônio (Quats) Derivado de amônio Agentes tensoativos
Gás mutagênico Mutações nos ácidos

Óxido de etileno
Gases alquilantes nucleicos
ENSAIOS COM AGENTES FÍSICOS
a. Temperatura
• Transferir 1 mL de uma cultura líquida de Bacillus cereus com 24 horas para 4 tubos con-
tendo 3 mL de Caldo Nutriente. Identifique o primeiro tubo com C (controle), o segundo com
“10” (10 minutos), o terceiro com “20” (20 minutos) e o quarto com “30” (30 minutos);
• Mergulhar o tubo C no banho Maria ajustado a 80 ºC e retirar logo em seguida, repousando-

-o em banho de gelo por 1 minuto. Os outros tubos devem ficar respectivamente por 10, 20
e 30 minutos no banho Maria, sendo que ao fim do tempo devem ficar imersos em banho de
gelo por 1 minuto;
• Incubar os tubos a 35 ºC por 18–24 horas. Observar se houve crescimento microbiano

(turvação do meio de cultura).
b. pH
• Transferir 0,1 mL de uma cultura líquida de Bacillus cereus com 24 horas para 3 tubos de
ensaio contendo Caldo Nutriente com valores de pH 3.0; 7.0 e 9.0, respectivamente;
• Incubar os tubos a 35 ºC por 18–24 horas. Observar se houve crescimento microbiano (tur-
vação do meio de cultura).

64
c. Pressão osmótica
• Transferir 0,1mL de uma cultura líquida de Rhodotorula sp. com 24 horas para 3 tubos de
ensaio contendo Caldo Sabouraud com NaCl a 0 (zero), 5 e 10%, respectivamente;
• Incubar os tubos a 35 ºC por 18–24 horas. Observar se houve crescimento microbiano (tur-
vação do meio de cultura).
ENSAIOS COM AGENTES QUÍMICOS

• Adicionar no primeiro tubo de ensaio 1 mL da substância teste pura ou concentrada.
• Adicionar no segundo tubo 1 mL da substância teste na diluição de uso;
• Transferir 0,1 mL de uma cultura líquida de Escherichia coli com 18–24 horas para os dois
tubos e aguardar 10 minutos;
• Tocar a suspensão com uma alça de inoculação e transferir o inóculo para uma placa com
ágar nutriente;
• Aguardar mais 10 minutos e repetir o procedimento anterior. Identificar e incubar a placa

a 35 ºC por 18–24 horas. A Figura abaixo ilustra como deve ser o plaqueamento desse
procedimento.
Diluído Concentrado
10 minutos 10 minutos
Diluído Concentrado
20 minutos 20 minutos

65
12 BIBLIOGRAFIA
RECOMENDADA
HIRATA, M. H.; HIRATA, R. D. C.; FILHO, J. M. Manual de biossegurança. 3

ed. São Paulo: Manole, 2016.
JORGE, O. C. Microbiologia: atividades práticas. 2 ed. São Paulo: Ltc –

Livros técnicos e científicos, 2008.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; BENDER, K. S.; BUCKLEY, D. H.; STAHL,

D. A. Microbiologia de Brock. 14 ed. Porto Alegre: Artmed, 2016.
Manual Segurança do Paciente - Higienização das Mãos. ANVISA/MS.

Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/pa-
ciente_hig_maos.pdf>. Acesso em: 10 jul.2020.
OKURA, M. H.; RENDE, J. C. Microbiologia – Roteiros de aulas práticas. 1

ed. São Paulo: Tecmedd, 2008.
RIBEIRO, M. C.; STELATO, M. M. Microbiologia prática – Aplicações de

aprendizagem de microbiologia básica. São Paulo: Editora Atheneu, 2011.
SILVA-FILHO, G. N.; OLIVEIRA, V. L. Microbiologia: manual de aulas práti-

cas. Florianópolis: Ed. UFSC, 2004.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. Porto

Alegre: Artmed, 2017.
VERMELHO, A. B.; PEREIRA, A. F; COELHO, R. R. R; SOUTO-PADRÓN, T.

Práticas de microbiologia. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2019.
WEINSTEIN, M. P. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility

Testing, M100. 30 ed. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute,
2020.

66

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1. Microbiologia – Manuais, guias, etc. I. Lima Filho, José Vitor

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A aula prática é considerada uma importante ferramenta metodológica no

O guia aborda as técnicas de manipulação assépticas de microrganismos,

Este guia é destinado aos estudantes que cursam a disciplina de micro-

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José Vitor Moreira Lima Filho é bacharel em Ciências Biológicas pela

Norma Suely Sobral da Silveira é bacharel em Ciências Biológicas (1983)

Elineide Barbosa de Souza é engenheira Agrônoma (1991), mestra em

Marcos Antônio Barbosa de Lima é bacharel em Ciências Biomédicas

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Éder Galinari Ferreira é licenciado em Ciências Biológicas (2004) pelo

Yone Vila Nova Cavalcanti é bacharel em Ciências Biológicas (1995) pela

Rosa Maria Nunes Galdino é bacharel em Ciências Biológicas (1980) e

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2. Microscopia e observação de microrganismos 15

3. Princípios gerais de esterilização 18

5. Técnicas de cultivo e isolamento de bactérias 27

6. Coloração diferencial de Gram – observação de formas e arranjos de

8. Técnicas de cultivo de fungos 40

9. Observação de estruturas somáticas e reprodutivas dos fungos 46

10. Quantificação de microrganismos 53

11. Controle do crescimento de microrganismos 62

12. Bibliografia recomendada 66

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Conhecer a estrutura do laboratório de microbiologia, os equipamentos

Na figura abaixo estão listados alguns símbolos relativos à biossegurança

Símbolo indicativo de risco Símbolo indicativo de Símbolo indicativo de

Figura 1.1. Alguns símbolos de biossegurança mais presentes em laboratórios de microbiologia.

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Via respiratória (qualquer estrutura com potencial infeccioso):

BOAS PRÁTICAS LABORATORIAIS (BPL)

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4. Esfregue a palma da mão direita 5. Entrelace os dedos e friccione

6. Esfregue o dorso dos dedos de uma 7. Esfregue o polegar direito,

8. Friccione as polpas digitais e unhas 9. Esfregue o punho esquerdo,

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Equipamentos de Proteção Individual (EPI)

Proteção contra gotículas, aerossóis ou queda de

Proteção contra respingos, impacto de objetos ou

Descartáveis: utilizadas para manuseio de micror-

Jaleco, bata ou avental Proteção contra respingos em geral.

GUIA DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

Extintores de incêndio (água, pó químico, espuma

Limpeza após acidente com culturas ou reagentes

Dispositivos utilizados para sucção e dispensação

Materiais utilizados, principalmente, para cobrir

Garantem um ambiente para manipulação assép-

Manuseio de reagentes químicos voláteis e produ-

NÍVEIS DE BIOSSEGURANÇA DE LABORATÓRIOS

• Laboratório NB 1: manipulam-se microrganismos que possuem baixo ou nenhum risco indivi-

• Laboratório NB 2: manipulam-se microrganismos que possuem risco individual moderado e

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• Laboratório NB 4: manipulam-se microrganismos que possuem risco individual e ao meio am-

PROCEDIMENTOS EM CASO DE ACIDENTES NO LABORATÓRIO

• Avisar imediatamente ao professor, monitor ou técnico do laboratório;

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

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Placas de Petri e tubos de ensaio Cultivo e armazenamento de microrganismos