ISPEBR 2023 - Validação de Método para VL

Treinamentos Online
ISPE Brasil
Validação Analítica para Metodologia de
Limpeza
12 e 13/09/23 - São Paulo, SP
Instrutor: Ana Carolina Gonzales Moraes
E-mail: anacarolina@qspharma.com.br
Telefone: (16) 98131-1135
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conteúdo e exatidão, destinando-se a orientar os diversos participantes dos treinamentos da ISPE Brasil – Afiliada Independente da
ISPE tais como profissionais que atuam no ciclo de vida de produtos farmacêuticos, de biotecnologia, cosméticos e de higiene
pessoal, produtos médicos e de diagnóstico in vitro, estudantes de graduação e pós-graduação, inspetores dos órgão reguladores
nacionais e internacionais, e público geral em relação às Boas Práticas de, mas não limitadas a Pesquisa, Desenvolvimento,
Fabricação, Importação, Armazenagem, Distribuição e Transporte, para cumprir os requisitos reguladores vigentes. A ISPE Brasil –
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Apoio Anual à ISPE Brasil 2023
Connecting Pharmaceutical Knowledge ispe.org

Instrutor
Ana Carolina Gonzales Moraes, MSc.
Farmacêutica, Mestre em Ciências. Atuou na indústria farmacêutica nas
áreas de Controle de Qualidade, Desenvolvimento e Validação Analítica.
Com mais de 13 anos de experiência na área de desenvolvimento analítico,
hoje é consultora e diretora na QS Pharma. Atua e gerencia a equipe
analítica em desafios gerais, desenvolvimentos, seleção, validações e
transferências de métodos analíticos aplicados à Validação de Limpeza, teor,
impurezas, produtos de degradação, MIE, perfil de dissolução, teste de
solubilidade, entre outros. Elabora e revisa documentações e justificativas
técnicas, ministra treinamentos.

Programa
1. Introdução a Validação de Limpeza e Requerimentos regulatórios
2. Seleção do Método Analítico
3. Técnicas Analíticas
4. Desenvolvimento de Estudo de Recuperação
5. Avaliação do Visualmente Limpo
6. Validação de Método Analítico para Validação de Limpeza
7. Documentação do Método Analítico
8. Considerações finais
9. Referências bibliográficas

INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO
VALIDAÇÃO DE LIMPEZA
Estabelecer evidências documentadas, científicas e baseadas em risco que forneçam um alto grau de
garantia de que um método ou procedimento de limpeza limpará consistentemente o equipamento em
conformidade com suas especificações pré-determinadas.
 Durante a fabricação do produto pode ficar resíduos e esses resíduos podem contaminar o próximo
produto que será fabricado.
 Quando um produto é adulterado com o resíduo do lote anterior do mesmo produto é chamado de
contaminação e um novo produto que é adulterado com os resíduos do produto anterior é chamado de
contaminação cruzada.
 Portanto o objetivo da Validação de Limpeza é evitar possível contaminação e contaminação cruzada.

INTRODUÇÃO
REGULAMENTAÇÕES
 A Validação de Limpeza na indústria farmacêutica tem sido um dos tópicos mais debatidos desde de
2018-2019 até agora, à medida que a indústria transita para avaliação baseada na ciência e no risco e
com limites de exposição baseados em saúde (HBEL) versus os métodos tradicionais;
 As principais Diretrizes de Validação de Limpeza foram revisadas nos últimos 2 anos ou estão em
processo de revisão:
• FDA - FDA Cleaning Validation Guideline from CFR 211.67 e Guide to inspections validation of
cleaning processes
• EMA - Guideline on setting health based exposure limits for use in risk identification in the
manufacture of different medicinal products in shared facilities e Q&A on implementation of risk-based
prevention of cross-contamination in production and ‘Guideline on setting health-based exposure
limits for use in risk identification in the manufacture of different medicinal products in shared facilities’
• WHO - Points to consider when including Health-Based Exposure Limits (HBELs) in cleaning
validation
INTRODUÇÃO
REGULAMENTAÇÕES
• PIC/S - Cross-contamination in shared facilities PI-043-1; Guideline on Setting HBEL for use in risk
identification in the manufacture of different medicinal products in shared facilities; Inspection of
Health Based Exposure Limit (HBEL) Assessment and use in Quality Risk Management PI 052-1
• PDA – TR 29: Points to Consider for Cleaning Validation e TR 49: Points to Consider for
Biotechnology Cleaning Validation
• APIC - Guidance on Aspects of Cleaning Validation in Active Pharmaceutical Ingredient Plants
• ASTM – ASTM E3106 - Standard Guide for Science-Based and Risk-Based Cleaning Process
Development and Validation e ASTM E3212 - Standard Guide for Derivation of Health-Based
Exposure Limits (HBELs)
• ISPE - Cleaning Validation Lifecycle - Applications, Methods, & Controls e Risk-Based Manufacture of
Pharmaceutical Products 2nd Edition

INTRODUÇÃO
REGULAMENTAÇÕES
• ANVISA – RDC 301/2019 - RDC 658/2022
 Uso da toxicologia para gestão de risco em contaminação cruzada com a avaliação dos LEBS;
 Compartilhamento de áreas e rotas produtivas que até então se mantinham segregadas;
 Aplicação de Gerenciamento de Risco Robusto.

INTRODUÇÃO
 A contaminação pode ser proveniente de:
• Fungos e Bactérias;
• Resíduos de produto anteriormente manufaturado (IFA e excipientes);
• Resíduos de agentes de limpeza (detergentes e sanitizantes);
• Resíduos de materiais transportados pelo ar (poeira, material particulado);
• Resíduos de lubrificantes;
• Resíduos de decomposição provenientes do produto manufaturado ou do detergente.
 Para garantir que o processo de limpeza elimine efetivamente esses resíduos, um programa de
validação de limpeza é delineado, executado e avaliado.

INTRODUÇÃO
 A validação de limpeza bem-sucedida é aquela que:
• Garante a segurança do paciente por meio de estudos baseados em risco realizados no

desenvolvimento dos processos de limpeza;
• Evita a adulteração do produto e obtenha um produto livre de contaminação;
• Satisfaz os requisitos regulamentares;
• Permitir a reutilização do mesmo equipamento para produtos diferentes;
• Otimiza processos e custos devido à troca sistemática de produtos.
 Assim, a validação da limpeza é um requisito regulatório de BPF que visa garantir:

• Integridade e qualidade do produto
• Segurança do paciente

INTRODUÇÃO
 Os dados usados para confirmar uma validação de limpeza bem sucedida são sustentados pelos resultados
obtidos através dos MÉTODOS ANALÍTICOS.
 Para atender a esse requisito, é fundamental garantir um alto nível de confiança na geração dos resultados
derivados do uso do método. Isso, por sua vez, é sustentado pelo desenvolvimento de um método analítico
adequado à essa finalidade, projetado não apenas para ser específico para o analito, mas também capaz de
garantir sua capacidade de quantificar nos limites de resíduos pré-determinados.
 Existem dois tipos fundamentais de métodos analíticos: ESPECÍFICO e NÃO ESPECÍFICO.
 A seleção desses métodos requer uma abordagem baseada na ciência e no risco.
 A avaliação inadequada e a seleção de qualquer um desses métodos podem gerar objeções regulatórias.

SELEÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
MÉTODO ESPECÍFICO MÉTODO NÃO ESPECÍFICO
Não fornece medição ou quantificação direta do

Quantificação exata do resíduo alvo resíduo. Qualquer resíduo detectado deverá ser
considerado o resíduo de interesse
Recomendado durante a validação de limpeza Recomendado após a validação de limpeza
Pode apresentar falsos positivos devido à presença

Detecta interferentes na amostra
de outras substâncias
HPLC, IC, AAS TOC, pH, condutividade

ANALITO
ESPECIFICIDADE SOLUBILIDADE
DESENVOLVIMENTO
DO MÉTODO
SENSIBILIDADE SUPERFÍCIES
ARL MÉTODOS

Total Organic Carbon for cleaning validation programs; cleaning validation programs; laboratory, online & at-line Analysis. www.suezwatertechnologies.com/sievers

 Baseada na ciência e no risco.
 O nível de esforço deve corresponder ao nível do risco.
 A medida que o nível de risco aumenta, o nível de sofisticação analítica
deve aumentar.
 Métodos específicos devem ser considerados para produtos ou situações
de alto risco.
FONTE: Center of Pharmaceutical Cleaning Innovation – Andrew Walsh
 A figura apresenta uma hierarquia para selecionar métodos

analíticos em referência à escala de toxicidade derivada de
LEBS (exposição diária aceitável em gramas).
FONTE: Revision Update PDA Technical Report 29 e 49 - Igor Gorsky

 As principais considerações para a avaliação de risco podem incluir o perigo ou risco do resíduo do processo
a ser analisado (pontuação de toxicidade), nível de detecção necessário, aplicabilidade dos métodos
existentes, outros riscos de qualidade e conformidade, bem como riscos para o negócio, como dificuldade de
implementação e a possível manutenção a longo prazo do método para programas de monitoramento
contínuo.
 Uma abordagem racional e lógica precisa ser adotada, pois alguns métodos podem ser desnecessariamente
caros ou difíceis de implementar para os resíduos do processo em consideração. Por outro lado, um método
simples e barato pode não ser apropriado para todos os resíduos do processo.
 Em geral, as técnicas mais simples devem ser examinadas primeiro e usadas se forem consideradas
apropriadas por meio de uma avaliação baseada na ciência e no risco. Em última análise, o objetivo deve ser
usar a técnica mais simples que seja apropriada e possa ser justificada.

 O conservadorismo indevido no cálculo do LEBS por meio da aplicação excessiva de fatores de ajuste pode facilmente
resultar em limites de swab ou enxágue tão baixos que são inatingíveis.
 Adotar uma abordagem racional e lógica, pois alguns métodos podem ser desnecessariamente caros ou difíceis de
implementar para os resíduos do processo em consideração. Por outro lado, um método simples e barato pode não ser
apropriado para todos os resíduos do processo.
 Os limites devem ser "práticos, alcançáveis e verificáveis (FDA).
 Outra forma para a escolha do método analítico pode ser baseado no limite de detecção (LD).
 LD mais baixos permitiriam que o método TOC fosse usado mais amplamente. No entanto, se os limites de TOC
definidos forem muito baixos, usando limites arbitrários ou não baseados em saúde, o TOC não poderá ser justificado.
 Os reguladores devem pedir para ver os limites de swab cientificamente justificados (ou seja, com base no LEBS),
juntamente com o LD correspondente quando TOC ou qualquer outro método analítico for usado para validação de
limpeza. FONTE: Center of Pharmaceutical Cleaning Innovation – Andrew Walsh

 O princípio simplesmente informa ao usuário se um método para um determinado composto pode ser
considerado aceitável com base em seu limite de swab (ou enxágue):

FONTE: Center of Pharmaceutical Cleaning Innovation – Andrew Walshc

• Se o LEBS for muito baixo ("Zona Verde"), o limite de swab correspondente também será muito baixo e
provavelmente ultrapassará o LD do método, e a escala dará uma medida de quão bom isso é.
• Se eles estiverem na "Zona Vermelha" e o LD for igual ou superior ao limite de swab, eles não podem
detectar o composto em um nível que garanta o cumprimento do limite baseado em LEBS.
• Tais métodos não devem ser considerados completamente inúteis; eles ainda podem ser usados para
demonstrar que os resíduos foram removidos perto do limite. No entanto, o usuário precisaria seguir etapas
adicionais para garantir que os resíduos estejam em níveis seguros, como demonstração de inativação,
degradação ou descontaminação.
FONTE: Center of Pharmaceutical Cleaning Innovation – Andrew Walshc

PRODUTOS BIOFARMACÊUTICOS
 Alguns IFAs são susceptíveis a degradação como resultado do processo de limpeza, por ex. sofrem hidrólise com altas
temperaturas combinadas a compostos alcalinos ou ácidos. Nesses casos, o método precisa ser capaz de detectar
esses degradantes ao invés do IFA ou além do IFA.
 No caso de algumas proteínas, por ex., o procedimento de limpeza promove a degradação em moléculas menores e
um método não especifico pode ser mais apropriado. Em outros casos, pode ser necessário combinar um método
específico para verificar se o resíduo foi degradado pelo processo de limpeza e combinado com um método não
específico para verificar se removeu os degradantes. Assim, a avalição de risco deve ser usada para determinar se irá
utilizar um método específico ou não específico.

PRODUTOS BIOFARMACÊUTICOS
TIPO DE ANALITO MÉTODO
Bioensaio, Absorbância, TOC, ELISA, SDS-PAGE,

Proteínas Determinação de proteína baseada em ensaio
HPLC, Osmolalidade.
Compostos inorgânicos Condutividade, pH, ICP
Compostos orgânicos Absorbância, TOC
Componentes biológicos Análise de células viáveis , Biocarga, Endotoxina

FONTE: Jegadeesh Kundan, ASQ-CQA

 Esta técnica possui a sensibilidade necessária?
 Este método é suficientemente seletivo para uso sem interferência dos outros componentes da
amostra?
 Os reagentes e equipamentos necessários para este método estão disponíveis ou são obtidos a um
preço razoável?
 O tempo necessário para realizar esta técnica é adequado?

 Como selecionar o método baseado no nível de risco?
• Os limites de detecção (LDs) e como eles são determinados são fundamentais para essa discussão.
• Para métodos HPLC - "A determinação da relação sinal-ruído é realizada comparando os sinais medidos de
amostras com baixas concentrações conhecidas de analito com os de amostras em branco e estabelecendo a
concentração mínima na qual o analito pode ser detectado de forma confiável. Uma relação sinal-ruído entre 3 ou
2:1 é geralmente considerado aceitável para estimar o limite de detecção.“
• Para métodos onde não há ruído de fundo específico para medir, como TOC, outras técnicas podem
ser empregadas, como o desvio padrão do branco - A medição da magnitude da resposta analítica de fundo
é realizada analisando um número apropriado de amostras em branco e calculando o desvio padrão dessas
respostas. Da mesma forma, um múltiplo de 3 é aplicado ao desvio padrão do branco e definido como LD. Por
exemplo, para um branco com média de 100 e desvio padrão de 30, o LD seria definido em 190 (100 + 30 x 3).

TOC
 É um método de análise não específico.
 Simples, rápido e pode detectar limites baixos de resíduos (ppb).
 Todo o carbono orgânico é detectado e, portanto, qualquer resíduo detectado deve ser considerado resíduo de
interesse.
 A análise TOC envolve a oxidação do carbono e a detecção do dióxido de carbono resultante. Existem várias
técnicas de oxidação diferentes, incluindo oxidação fotocatalítica, oxidação química e combustão em alta
temperatura.
 O método depende da completa conversão dos componentes orgânicos em dióxido de carbono, que é então
detectado e quantificado por condutividade ou medição infravermelha não dispersiva.
 Muito utilizado para agentes de limpeza e compostos biológicos, devido à sua facilidade de uso, ao alto teor de
carbono das proteínas e às dificuldades físico-químicas no uso de métodos específicos, como o ensaio
imunoenzimático (ELISA) .

TOC
 Técnicas de oxidação:
• UV - Usa a radiação UV para oxidar os orgânicos presentes na amostra. Não é forte o suficiente para
as matrizes contendo carbono encontradas na maioria dos resíduos de limpeza
• UV / persulfato – combina radiação UV e um reagente de persulfato para aumentar substancialmente a
eficiência da oxidação. É poderosa o suficiente para quase todos os resíduos de limpeza
• Temperatura - oxida a amostra aquecendo-a a 680–1000 °C. Embora forte o suficiente para oxidação
completa da amostra, não é ideal para análise de baixo nível de TOC pois apresenta um TOC de fundo
elevado e altamente variável em comparação com a resposta típica da amostra
• A chave para obter resultados precisos de TOC de baixo nível é maximizar a resposta de carbono da
amostra, minimizando o TOC de fundo. Como resultado de sua resposta amostra-ruído superior, a
tecnologia UV-persulfato alcança maior precisão e limites mais baixos de detecção, e também alcança
boa precisão em toda a gama de análise.

TOC
 Técnicas de detecção
• Detectores de condutividade - medem a condutividade da amostra antes e depois de oxidado, atribuindo a
diferença para o TOC na amostra (Total de carbono orgânico = carbono total – carbono inorgânico total)
• Medições de condutividade > 50 ppb variam com as espécies de carbono existentes e podem levar a um
erro significativo. Possíveis interferências de outros íons.
• Detecção NDIR - oferece uma solução mais prática e livre de interferências.
 Análise de TOC – envolve 3 etapas:
1. Etapa de acidificação
• A fim de medir apenas o carbono orgânico total, é necessário medir e descontar o carbono inorgânico total
(carbonato, bicarbonato e dióxido de carbono dissolvido) do total de carbono. Com a adição de ácido
fosfórico, ocorre a conversão de qualquer carbono inorgânico em CO2. O carbono é medido
independentemente do carbono orgânico.
2. Etapa de oxidação
• O carbono orgânico presente na amostra é convertido em CO2 por uma das técnicas já citadas
anteriormente

TOC
3. Etapa de medição
• Medida direta - NDIR

• Medida indireta - condutividade
 Composto deve ser solúvel em água e a maioria dos compostos pior caso são considerados insolúveis
em água.
FONTE: Farmacopeia Brasileira
• Esses compostos são solúveis até certo ponto e essa quantidade pode não ser necessariamente uma
restrição para uso do TOC.

TOC
 O limite de detecção do TOC é baseada na resposta de fundo das amostras do branco do swab. Essa
resposta de fundo pode ser afetada por:
• Nível de TOC da água utilizada (< 10 ppb)
• Nível de TOC dos frascos/vials utilizados – facilmente controlado lavando umas 3 x com a agua de
baixo TOC. Uso de frascos de vidro minimizam a contribuição no background.
• Nível de TOC dos swabs utilizados – difícil de controlar e a fonte mais significante de valores de
background, mesmo lavando varias vezes com agua de baixo TOC antes do uso. Dar preferência para
swabs de poliéster.
 Reduzir os níveis de background consequentemente reduz o LD
 Outra fonte de aumento de background pode ser os coupons utilizados e consequentemente podem
afetar diretamente o estudo de recuperação. Por isso certificar que foram removidos todo resíduo
presente que possa contribuir com o sinal de TOC. Dedicar esses coupons para analise de TOC e
armazenar corretamente para evitar danos e contaminação.

TOC
 Limite de detecção
 O Limite de Detecção do TOC pode ser comparado ao limite de TOC de um composto para justificar o seu uso.
 Quanto maior o LD do TOC, mais difícil será justificar seu uso para compostos com limites mais baixos. Claramente,
obter um LD baixo é uma tarefa muito importante para o analista que desenvolve o método, e isso é algo que o
analista deve estar ciente e abordar durante o desenvolvimento do método.
 Para medir a distância relativa podemos observar a razão dos dois valores. Se tomarmos o log desta razão
podemos obter uma escala logarítmica que:
• É igual a zero quando os valores do limite de TOC swab e limite de detecção de TOC são iguais
• É negativo quando o limite de detecção de TOC é menor que o limite de TOC swab
• É positivo quando é maior.
 Esse cálculo pode nos fornecer um índice de detecção de carbono (IDC) que pode ser aplicado na seleção do
método de TOC.

TOC
𝐿𝐷𝑇𝑂𝐶
𝐼𝐷𝐶 = 𝑙𝑜𝑔
𝐿𝑆𝑇𝑂𝐶
Onde:
𝐼𝐷𝐶 = Índice de detecção de carbono
𝐿𝐷𝑇𝑂𝐶 = Limite de detecção TOC
𝐿𝑆𝑇𝑂𝐶 = Limite de swab TOC

TOC

TOC
 É recomendado dedicar os demais materiais utilizados na análise de TOC.
 Sempre comparar o branco da água com o branco do swab como um controle.
 Sempre usar luvas apropriadas para evitar contaminação.
 Evitar conversas durante o estudo de recuperação e amostragem da validação de limpeza, pois

pequenas gotas de saliva pode contaminar o coupon ou as amostras. Usar máscaras pode ser uma
forma de prevenir essa contaminação.
 Por conta do alto conteúdo de carbono dos solventes os orgânicos, tipicamente não são utilizados na
amostras de swab e rinse. Em alguns casos, quando o solvente é utilizado (por ex. Metanol) como
solvente de amostragem, ele deve ser removido antes da análise (por ex. estufa a 104°C ou estufa a
vácuo a 80°C).

TOC
 A contaminação orgânica de utensílios de laboratório e recipientes de amostra resulta em valores de TOC mais altos.
Portanto, é importante usar material de laboratório e recipientes que tenham sido escrupulosamente limpos fim de
evitar resíduos orgânicos.
 Sempre comparar o branco da água com o branco do swab como um controle.
 Sempre usar luvas apropriadas para evitar contaminação.
 Evitar conversas durante o estudo de recuperação e amostragem da validação de limpeza, pois pequenas gotas de
saliva pode contaminar o coupon ou as amostras. Usar máscaras pode ser uma forma de prevenir essa
contaminação.
 Por conta do alto conteúdo de carbono dos solventes os orgânicos, tipicamente não são utilizados na amostras de
swab e rinse. Em alguns casos, quando o solvente é utilizado (por ex. Metanol) como solvente de amostragem, ele
deve ser removido antes da análise (por ex. estufa a 104°C ou estufa a vácuo a 80°C).

TOC – DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
 TOC é uma técnica analítica não específica com alta sensibilidade e alta probabilidade de contaminação ambiental com
compostos contendo carbono. Portanto, a qualidade dos solventes, reagentes e técnicas adequadas de manuseio de
amostras são importantes para um método robusto;
 Durante o desenvolvimento do método deve minimizar a contaminação durante a preparação da amostra e para
maximizar a recuperação dos níveis residuais de detergentes;
 Fatores que podem impactar negativamente a análise TOC (exatidão, precisão, limite de detecção e calibração da
análise): a concentração e o volume do diluente, método de extração, localização de preparação da amostra e taxa de
fluxo do oxidante.
 Concentração de ácido fosfórico no diluente
• O ácido fosfórico além de ser usado como reagente “Ácido” no analisador TOC para remover o carbono inorgânico da
solução de amostra, pode ser usado como diluente para extração do resíduo do swab. No entanto, se a concentração
de ácido for muito alta, pode haver extração indesejável de carbono orgânico dos cotonetes de amostragem;

• Portanto, é indicado avaliar as extrações de swab em branco em diferentes concentrações para minimizar o fundo de
TOC medido
 Volume do diluente
• Determinar o impacto do volume/concentração da solução de amostragem;
• A capacidade do frasco de TOC é de 40 mL. No entanto, é desejável que a concentração da amostra seja a mais alta
possível para melhorar o limite de quantificação/detecção. Volumes menores pode ajudar no limite de quantificação,
porém pode provocar carryover. Por isso, avaliar o branco antes e após as injeções da solução amostra;
• Atenção a volumes maiores, que em contato com o cabo do cotonete pode contaminar a solução.
 Método de extração
• Ultrassom ou vórtex e depois agitar manualmente;
• Comparar a precisão de extração (% de recuperação) e precisão (repetibilidade) entre as técnicas de extração;

 Localização do ambiente/laboratório
• A análise TOC é extremamente sensível e não pode diferenciar as diferentes fontes de carbono (por exemplo:
amostra, contaminação do ambiente ou manuseio, incluindo exalações). Desta forma, minimizar o tráfego de
pessoas dentro/fora do laboratório durante o experimento e evitar as respirações/conversas durante a
preparação da amostra.
 Taxa de fluxo do oxidante
• Na análise por TOC o conteúdo de carbono elementar do analito é oxidado a dióxido de carbono usando
persulfato de amônio como agente oxidante. A taxa de fluxo que determina a quantidade de oxidante na reação
e esse valor deve ser otimizado.
• A taxa de fluxo baixa pode impactar em uma oxidação incompleta do analito e uma taxa de fluxo alta pode
resultar em um valor menor de TOC. Avaliar a recuperação em diferentes taxas de fluxo.

 <643> TOTAL ORGANIC CARBON
 Solução Adequação do sistema
• Padrão USP 1,4-benzoquinona RS
 Solução padrão
• USP Sacarose RS
 Solução branco da água – usar uma quantidade adequada de Água Reagente obtida ao mesmo tempo que a utilizada
nas preparações de Solução padrão e Solução de adequação do sistema
 Solução branco de reagentes ou outras soluções necessárias - para estabelecer a linha de base do aparelho ou para
ajustes de calibração seguindo as instruções do fabricante e execute os brancos apropriados para zerar o instrumento,
se necessário.
 Solução amostra

 Leitura do Padrão
• Medir o TOC da Solução branco da água e registrar a resposta (rw)
• Medir o TOC da Solução padrão e registrar a resposta (rS)
• Calcular a resposta da Solução padrão corrigida, que é a resposta limite (rL), subtraindo a resposta da Solução
branco da água da resposta da Solução padrão:
𝑟𝐿 = 𝑟 𝑆 − 𝑟w
 Leitura da Adequação do sistema
• Medir o TOC da Solução Adequação do sistema e registrar a resposta (rSS)
• Calcular a resposta da Solução Adequação do sistema corrigida (𝑟C), subtraindo a resposta da Solução branco
da água da resposta da Solução Adequação do sistema:
𝑟C = 𝑟𝑆𝑆 − 𝑟w

• Calcular a porcentagem de eficiência de resposta (rE):
rE=100 × (rC/rL)
• O sistema de medição de TOC é adequado se a porcentagem de eficiência de resposta (rE) é NLT 85% e
NMT 115%. A adequação do instrumento deve ser periodicamente demonstrada.

EXEMPLO USANDO TOC

EXEMPLO USANDO TOC

HPLC
 Estrutura química do resíduo de interesse;
 Detector;
 UV – presença de cromóforo;
 Fluorescência, eletroquímico – ausência de cromóforo;
 Derivatização

HPLC
PARA AUMENTAR A SENSIBILIDADE EM ANÁLISES HPLC:
Fase móvel
 Escolha o grau de solvente que corresponde aos
requisitos do seu método (“grau HPLC”, “grau LC –
MS” ou “grau UHPLC – MS”...). Os solventes que não
possuem grau de pureza adequado darão um alto
sinal de fundo;
 Ao usar um detector de UV em comprimentos de onda

inferiores a 210 nm, selecione acetonitrila em vez de
metanol, uma vez que a acetonitrila tem um corte de
UV inferior (190 nm).

HPLC
Fase estacionária
 Coluna com diâmetro menor - relação sinal-ruído aumenta, o que melhora a sensibilidade;
 Tamanho de partícula menor (atenção à pressão), melhora eficiência de separação;
 Coluna com partículas de núcleo fundido ou superficialmente porosas (SPP). Os SPPs fornecem alta
resolução e eficiência sem a necessidade de lidar com altas pressão de retorno;
 Colunas monolíticas - alta tolerância de matriz e permitem separações rápidas em baixa pressão de
retorno.

HPLC
PARA AUMENTAR A SENSIBILIDADE EM ANÁLISES HPLC
Tempo de equilíbrio
 Fase reversa: evite longos tempos de equilíbrio em condições altamente aquosas – provoca acúmulo de
contaminantes no topo da coluna. Em execuções de gradiente, esses contaminantes eluem em tempos de
retenção específicos e comprometem a sensibilidade ou até mesmo geram picos fantasmas;
 Boa prática - lavar periodicamente a coluna com 10 volumes de coluna de solvente 100% orgânico, como
acetonitrila, para remover quaisquer contaminantes que tenham se acumulado.

HPLC
PARA AUMENTAR A SENSIBILIDADE EM ANÁLISES HPLC
Consideração do instrumento: Evite volumes mortos

 Uma configuração adequada do próprio sistema HPLC pode contribuir para aumentar a sensibilidade.
Grandes volumes mortos podem causar alargamento de pico, cauda ou divisão, levando a uma pobre
resolução e desempenho reduzido - e, portanto, menor sensibilidade. As peças do sistema (tubos,
conectores, acessórios e assim por diante) devem contribuir para minimizar os volumes mortos.

HPLC
Volume de injeção
 Aumentar o volume de injeção.
Preparo de amostra: clean-up

 Ao trabalhar com matrizes mais complexas, o uso de extração em fase
sólida (SPE) ajuda a remover os principais grupos de contaminantes,
como proteínas e sais.

OUTRAS TÉCNICAS ANALÍTICAS
AAS
 A absorção atômica é um método específico para íons metálicos. Pode ser aplicado se o IFA está na forma
de sal com íons metálicos (como Ca, Mg, K e Na) ou quando o íon metálico faz parte de sua estrutura
(carbonato de lítio, sulfadiazina de prata).
ESPECTROSCOPIA UV
 Para certos surfactantes que possuem um cromóforo, a espectroscopia UV pode ser uma ferramenta de
escolha.
TITULAÇÕES
 As titulações podem variar de titulações de alcalinidade ou acidez, que podem ser usadas para agentes de
limpeza e procedimentos de titulação mais específicos para quelantes em agentes de limpeza.

CROMATOGRAFIA IÔNICA
 Análise de ânions e cátions em uma solução iônica usando o método de troca iônica. O processo
cromatográfico separa os diferentes íons dentro da amostra. A quantidade de um ânion/cátion é medida
pela mudança na condutividade.
 Os diferentes íons do eluente são separados em uma coluna recheada com uma resina de troca iônica
(fase estacionária). As resinas para análise de cátions terão uma carga negativa, enquanto que para
análise de ânions os sítios ativos terão uma carga positiva.
 A cromatografia de íons inclui métodos específicos para ânions e cátions e estão sendo utilizados para
formulações de limpeza com sódio e potássio como cátions, por exemplo, e ânions de detergentes ácidos,
como fosfatos e citratos, ou construtores, como carbonatos, EDTA.
 Os limites mínimos de detecção de concentração podem ser tão baixos quanto algumas partes por bilhão
(ppb).
CROMATOGRAFIA IÔNICA
FONTE: https://www.mee-inc.com/hamm/ion-chromatography-ic/

DESENVOLVIMENTO DO ESTUDO DE RECUPERAÇÃO

The firm should challenge the analytical method in combination with the sampling method(s) used to show that
contaminants can be recovered from the equipment surface and at what level, i.e. 50% recovery, 90%, etc. This
is necessary before any conclusions can be made based on the sample results. A negative test may also be the
result of poor sampling technique
GUIDE TO INSPECTIONS VALIDATION OF CLEANING PROCESSES, FDA 1993

PARÂMETROS QUE DEVEM SER AVALIADOS:
 MOC
 Método de amostragem;
 Características swab;
 Solvente amostragem;
 Solvente de extração;
 Técnica de extração.

MATERIAL DE COMPOSIÇÃO (MOC):
 Aço inoxidável
 Látex
 Silicone
 Vidro
 Plástico
 Policarbonato
Forsyth, R. J. Journal of Validation Technology [Autumn 2009]

MÉTODO DE AMOSTRAGEM
 Amostragem direta - swab
 Amostragem indireta – enxague
Qualificar a recuperação é uma expectativa regulatória - não apenas de uma

perspectiva analítica, mas também para treinar e qualificar adequadamente o
pessoal de amostragem

• AMOSTRAGEM DIRETA - SWAB
O swab deve oferecer:
1. Interferências extraíveis mínimas
2. Partículas e fibras ultrabaixas
3. Compatibilidade com solvente
4. Altas taxas de recuperação
https://www.youtube.com/watch?v=Posmx2zi2MI&t=19s

COMPATIBILIDADE DO SWAB COM OS SOLVENTES
Texwipe Cleanroom Swabs

COMPATIBILIDADE DO SWAB COM OS SOLVENTES

COMPATIBILIDADE DO SWAB COM SOLVENTES
 Estudo realizado entre Axios Brasil e uma importante

indústria farmacêutica brasileira (16 de fevereiro de 2023)
 Mostrou que a quantidade de interferentes detectados pode

variar dependendo do Swab escolhido e do solvente
utilizado;


 Os 3 swabs TX714A, TX715 e TX716 apresentaram
um número semelhante de compostos lixiviáveis na
maior parte das soluções, entretanto o TX716 leva
uma grande vantagem na solução de isopropanol
50% e 100%
Fonte: https://axiosbrasil.com.br/swabs-texwipe-por-que-e-qual-modelo-utilizar/

 A maior vantagem do TX716 ocorreu quando analisaram as áreas dos picos
 Em resumo, os resultados do estudo indicaram que o swab TX716 é superior aos outros modelos (TX714A e TX715)
quanto à presença de contaminantes que possam interferir no resultado;
 Os modelos TX714A e TX715 apresentam resultados satisfatórios a depender da solução de extração e o custo
benefício;
 Concluem enfatizando a importância na escolha do Swab e na avaliação quanto a qualidade e robustez do teste
Fonte: https://axiosbrasil.com.br/swabs-texwipe-por-que-e-qual-modelo-utilizar/

COMPOSIÇÃO DO SWAB
 São feitos de uma fibra de poliéster que umedece com a maioria dos
solventes;
 Adsorve o material residual dissolvido;
 Deve ser capaz de remover a analito da superfície que está sendo testada
e liberar o resíduo no solvente de extração.
 Por ex. Swabs Texwipe exibem apenas picos de interferência quando são
extraídos com um solvente orgânico forte, como acetonitrila, por um longo
período de tempo. Possui baixo carbono orgânico total (TOC)

AVALIAR O ESPECTRO DE ABSORBÂNCIA DO SWAB
 Swab com fundo de alta absorbância de UV (190-235 nm) pode interferir no resultado ocultando a
contaminação de resíduos
 TOC são relatados em parte por bilhão (ppb - μg/L). Quaisquer partículas do material do cotonete ou do
recipiente de amostra pode contribuir para o valor TOC.

ÁREA
 5 cm x 5 cm de área (25 cm2)
 10 cm x 10 cm (100 cm2)

TAMANHO DO SWAB
 Grandes e pequenos;
 Padronizar o tamanho de swab grande para garantir melhor que o resíduo seja suficientemente recuperado
- abordagem equivocada!
 Swab menor pode recuperar adequadamente várias centenas de µg de resíduos;
 Normalmente 0,1 mL de solvente de amostragem é suficiente;
 Permite extrações com apenas 2 mL de solvente;
 Deve ser um nível alto e mais flexibilidade com outros parâmetros de recuperação;
 Tamanhos maiores requerem mais solvente de amostragem (0,5 mL) e um maior volume de solvente de
extração, e limita a sensibilidade do método analítico.

QUANTIDADE DE SWAB
 Um único swab requer um solvente de extração mínimo;
 Menor volume de solvente de extração maximiza o LOD;
 Simplifica o processo de amostragem;
 Uma área maior exigirá mais frequentemente mais de um swab
 Vários swabs aumentarão a recuperação apenas em uma base incremental;
 Maior volume de solvente de extração;
 Aumenta etapas no processo de amostragem e riscos de erros;
 Testar um único swab, explorar outros parâmetros para melhorar a recuperação – solvente, técnica e
tempo, antes de aumentar o número de swabs.

TÉCNICA DE AMOSTRAGEM
 A técnica é um fator importante na variabilidade dos dados de recuperação de amostragem;
 Inúmeras descrições da técnica de amostragem;
 A técnica deve ser descrita em detalhes suficientes para facilitar o treinamento e a execução;
 Deve cobrir a área da amostra de forma completa e consistente;
 Avaliar e reduzir erros que causam a variabilidade de pessoa para pessoa

1. O primeiro lado do primeiro cotonete é passado dez vezes
horizontalmente.
2. A cabeça do cotonete é virada e o segundo lado é deslizado

verticalmente dez vezes sobre a mesma superfície.
3. O cotonete é depositado no frasco.
4. O primeiro lado do segundo cotonete é passado dez vezes

para cima na diagonal.
5. O cotonete é virado e o segundo lado é deslizado

https://www.youtube.com/watch?v=AAwA5DkV0Ng
diagonalmente para baixo dez vezes.
6. A segunda ponta de cotonete é depositada no frasco.



SOLVENTE DE AMOSTRAGEM
 Analito de interesse deve ser solúvel e compatível com o solvente de extração e com o método analítico;
 Solvente orgânico que evapora e não deixa nenhum resíduo (ex. álcool);
 TOC limitado à água purificada;
 A quantidade deve ser suficiente para umedecer toda a superfície da malha do swab, mas não tão úmido a
ponto de ser deixado na área amostrada;
 Quantidade diferente ao usar água e solvente orgânico e depende do tamanho;
 Swabs pequenos retem 0,1 mL e swabs grandes 0,5 mL, aproximadamente;
 Umedecer completamente e pressionar ambos os lados do swab usando a lateral do recipiente.

RECIPIENTE DE AMOSTRAGEM
 Tamanho adequado para o volume de solvente de extração;
 Deve ser compatível com o solvente de extração e não conter nada que possa ser extraído no solvente –
fonte de contaminação;
 Picos extras ou valor mais alto TOC;
 Preferencialmente frascos descartáveis inertes;
 Ex.: tubos Falcon, frascos de TOC de vidro com tampas forradas de Teflon

SOLVENTE DE EXTRAÇÃO
 Deve dissolver completamente o analito de interesse e recuperar da malha do swab;
 Pode ser o mesmo que o solvente de amostragem, mas não precisa ser;
 Deve ser compatível com o método analítico;
 Usar o mesmo solvente pode não ser a melhor opção;
 Normalmente o solvente de extração é adaptado do método de teor;
 TOC o solvente deve ser água purificada, ou ácido diluído ou base diluída;
 O volume depende do ARL e da sensibilidade da técnica analítica;
 Usar o volume mínimo e resultar em uma concentração que caia dentro da faixa linear do método;
 TOC normalmente requer de 20-40 mL;
 HPLC volumes menores (2 mL), geralmente de 5-10 mL.

TÉCNICA DE EXTRAÇÃO
 Vórtex;
 Agitação;
 Sonicação;
 Técnica e tempo dependem da estabilidade das amostras.

Solução Fortificada

R. Forsyth, “Best Practices for Cleaning Validation Swab Recovery Studies," Pharmaceutical Technology 40 (9) 2016




AMOSTRAGEM INDIRETA
 Permite amostrar grandes superfícies;
 Áreas que são inacessíveis ou que não podem ser rotineiramente desmontadas;
 Peças desmontáveis: como tubos, mangueiras de transferência, telas metálicas;
 Remete a uma “imagem global”;
 De extrema utilidade para verificação de resíduos de agente de limpeza;
 Ideal ser utilizada em combinação com outros métodos de amostragem, como a amostragem por swab;
Fonte: Guia ISPE

AMOSTRAGEM INDIRETA
 O resíduo pode não ser solúvel ou pode estar ocluído fisicamente no equipamento;
 O volume e tipo de solvente a ser empregado (rinsagem) devem ser determinados previamente;
 O volume de rinse, o tempo de contato, a temperatura e agitação são fatores que afetam no teste de
recuperação;
 Pode gerar um falso resultado em equipamentos com difíceis pontos de limpeza;
 Dificuldade em remover resíduos secos ou ressecados e/ou insolúveis em água. Nestas situações o swab
deve ser utilizado obrigatoriamente para amostragem;
 Todos os materiais diferentes devem ser avaliados no teste de recuperação;
Fonte: Guia ISPE

AMOSTRAGEM INDIRETA
Dois procedimentos diferentes podem ser utilizados como um método adequado:
1. ÁGUA DE ENXÁGUE
 Resíduo é quantificado no último enxágue do equipamento;
 Adequando em equipamentos CIP (clean-in-place) e tubo estreito;
 Amostragem dificultada se o analito de interesse não for solúvel em água;
2. RINSAGEM
 Resíduo quantificado em um volume de enxágue adicional usado no equipamento limpo após o enxágue final;
 Mais usado em peças desmontáveis;
 Pesquisa de solvente - avaliação de risco

AMOSTRAGEM INDIRETA - MÉTODO DE RECUPERAÇÃO
 Determinação do volume é muito importante para permitir detectar o analito de interesse no solvente de lavagem -
sensibilidade do método analítico;
 Realizado em peças (quando disponível) ou em placas do material de composição por onde passará o enxágue ou
rinse;
 Aplicar quantidades conhecidas do analito, aguardar secar;
 Passar o volume determinado na superfície do cupom teste e homogeneizar ou agitar por tempo específico e coletar.
Seguir o método de preparo analítico, se aplicável. É difícil simular a agitação e a força do fluxo da água.
 Se não estiver disponível um recipiente com mesmo MOC, o cupom com o mesmo MOC pode ser colocado dentro de
um recipiente (por ex. Becker) e seguir conforme já descrito ou realizar o teste de recuperação direto na peça do
equipamento.

AMOSTRAGEM INDIRETA - MÉTODO DE RECUPERAÇÃO

AMOSTRAGEM INDIRETA
VOLUME DE RINSE
 Quantidade mínima para evitar diluições desnecessárias da amostra;
 Um ponto de partida seria de 0,5 – 1 mL/cm2, mas depende da superfície do equipamento/peça – Guia ISPE;
 Lembrar que a quantidade de solvente utilizada na rinsagem não é recuperado em 100% devido a perdas
por evaporação e solvente remanescente na superfície amostrada;
 A razão do volume do solvente de rinsagem usado por área de superfície do equipamento deve ser
calculado e usado nos estudos de recuperação;
Fonte: Guia ISPE

AMOSTRAGEM INDIRETA
EXEMPLO - AMOSTRA DE RINSAGEM
ARL (µg/cm2) 3 µg/cm2

Área total superfície da peça 50 cm2
ARL para peça (µg) 50,00 x 3 150 µg
ARL (µg/mL) - ANALÍTICO

ARL para peça (µg) 150 µg
Volume (mL) da peça 250 mL
ARL (µg/mL) 150,00 ÷ 250,00 0,6 µg/mL
Cupom de 25cm2 25 x 3 75 µg
Volume diluição (mL) 125 mL

AMOSTRAGEM INDIRETA
SOLVENTE DE RINSE
 O rinse final de limpeza e solvente de rinse após a limpeza normalmente é agua, mas outros solventes
podem ser utilizados;
 Não existe nenhum requerimento de serem iguais, apenas quando for usar TOC como método analítico;
 Proibido solventes considerados perigosos: benzeno, diclometano, etc.
Fonte: Guia ISPE

AVALIAÇÃO DO VISUALMENTE LIMPO

 Limite calculado e estabelecido por alguns pesquisadores para resíduos visualmente detectáveis.
 Fourman e Muller: 10µg para cada 5 cm2 de área amostrada ou 4 µg/cm2;
 Jenkins e Vanderwielen: resíduos abaixo de 1 µg/cm2 com o auxílio de luz apropriada;
 Forsyth: resultados entre 0,4 a 10 µg/cm2 para APIs.
 Para garantir o valor exato dos resíduos é necessário uma amostragem por swab mediante calculo de
comparação do limite aceitável e resultado das análises do controle de qualidade.
 Qualificação através dos testes de cupom
 Referência Guia ISPE e RT n° 29 PDA


VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
RECURSOS – LEGISLAÇÕES E GUIAS
 RDC nº 166 – ANVISA (2017)
 Guia nº 10 - Guia para Tratamento Estatístico da Validação Analítica – ANVISA (2017)
 ICH Q2 (R2) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (2022)
 Guidelines on Validation - WHO (2016)
 Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements – AOAC (2016)
 Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry – FDA (2018)
 Guia de Validação e Controle de Qualidade Analítica – MAPA (2011)

(1) Nos casos em que foi conduzida a reprodutibilidade, não é necessário conduzir a precisão intermediária. (2) Nos casos de
ensaios de identificação, pode ser necessária a combinação de dois ou mais procedimentos analíticos para atingir o nível
necessário de discriminação.
(3) Pode ser necessário em alguns casos – VL!!!

 A validação de um método não específico é similar a validação do método específico, com a exceção que as condições
de operação do método não modifica, ou modifica muito pouco, quando muda de composto para composto.
• Seletividade/Especificidade – não aplicável para métodos não específicos
• Limite de detecção e quantificação
• Linearidade
• Exatidão
• Precisão
• Robustez
• Estabilidade da amostra
• System Suitability
• Estudo de recuperação

SELETIVIDADE
Deve ser demonstrada por meio da sua capacidade de identificar ou quantificar o analito de
interesse, inequivocamente, na presença de componentes que podem estar presentes na
amostra, como impurezas, diluentes e componentes da matriz (Art19°)
 Normalmente é o primeiro parâmetro a ser avaliado;
 Método pouco específico: problemas com a execução de outros parâmetros, como exatidão e precisão;
 Pureza cromatográfica: cromatografia líquida (resposta obtida atribuída apenas à substância de interesse, não há
co‐eluição de duas ou mais substâncias).

SELETIVIDADE
• Fase móvel
• Branco do Swab (simulando o ensaio)
• Padrão 100% e LOQ
• Padrão (extração em placa)
• Padrão + swab (sem extração em placa)
• Placebo
• Placebo + Padrão ou Matriz + Padrão (amostras complexas ou ausência de placebo)
• Agente de limpeza
• Potenciais degradantes

SELETIVIDADE
POTENCIAIS DEGRADANTES
 O método precisa ser capaz de separar conhecidos degradantes identificados durante o processo de
desenvolvimento do produto;
 A estabilidade do analito em soluções ácidas e básicas deve ser revisada para determinar o risco de
degradação durante o processo de limpeza;
 Estabilidade frente a temperatura;
 Se potencial, o degradante deve ser monitorado, sua atividade farmacológica determinada e os limites
de limpeza apropriados estabelecidos conforme necessário.

LIMITE DE DETECÇÃO
Deve ser demonstrado pela obtenção da menor quantidade do analito presente em uma amostra que
pode ser detectado, porém, não necessariamente quantificado (Art49°)
 Método visual, razão sinal-ruído, baseado na determinação do branco ou em parâmetros da curva de

calibração
• Estabelecido através de soluções conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável;
• Métodos não instrumentais: pode ser feita visualmente, onde o LD é o menor valor de concentração capaz
de produzir o efeito esperado (mudança de cor, turvação, etc);
• Métodos instrumentais: razão sinal-ruído, a qual deve ser descrita e justificada (razão ≥ 2:1) ou baseada
em parâmetros da curva analítica: LD = 3,3 x DP / IC, determinado analisando 3 curvas contendo o analito
próximo ao LD ou da análise de amostras do branco.

LIMITE DE DETECÇÃO
• TOC – preparar 10 amostras do branco - água com baixo TOC ou brancos de swab (se aplicável) que
contabilizam a contribuição de carbono da água e do frasco usado no experimento. Uma vez que o
desvio padrão das 10 amostras foi determinado multiplicar o desvio padrão por 3 para obter LOD.
Ideal que se verifique o LOD real do método

LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
Deve ser demonstrado pela obtenção da menor quantidade do analito presente em uma amostra pode ser
determinada com precisão e exatidão aceitáveis (Art55°)
 Método visual, razão sinal-ruído, baseado na determinação do branco ou em parâmetros da curva de

calibração
• Estabelecido através de soluções conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível determinável
com precisão e exatidão aceitáveis;
• Métodos não instrumentais: pode ser feita visualmente, onde o LQ é o menor valor determinável (com
precisão e exatidão) de concentração capaz de produzir o efeito esperado (mudança de cor, turvação, etc);
• Métodos instrumentais: razão sinal-ruído, a qual deve ser descrita e justificada (razão ≥ 10:1) ou baseada
em parâmetros da curva analítica: LQ = 10 x DP / IC, determinado analisando 3 curvas contendo o analito
próximo ao LQ ou da análise de amostras do branco.
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
• TOC – preparar 10 amostras do branco - água com baixo TOC ou brancos de swab (se aplicável) que
contabilizam a contribuição de carbono da água e do frasco usado no experimento. Uma vez que o
desvio padrão das 10 amostras foi determinado multiplicar o desvio padrão por 10 para obter LOQ;
• Exatidão e Precisão no LOQ.
Ideal que se verifique o LOQ real do método

LINEARIDADE
Deve ser demonstrada por meio da sua capacidade de obter respostas analíticas diretamente
proporcionais à concentração de um analito em uma amostra.(Art23°)
 Três soluções mães independentes – no mínimo cinco concentrações;
 Sendo o LOQ o primeiro ponto;
 Guia ISPE - aconselhável estender a linearidade acima do ARL para entender possíveis limitações do
método;
 Deve-se obrigatoriamente passar pela concentração 100% (Limite de Especificação do Resíduo);
• Ex. 20% (LOQ), 40%, 60%, 80%, 100%, 110% e 125%;
• Utilização de ferramentas estatísticas aplicadas à validação de métodos analíticos.

LINEARIDADE
I.- representação gráfica das respostas em função da concentração do analito;
II.- gráfico de dispersão dos resíduos, acompanhado de sua avaliação estatística;
III.- equação da reta de regressão de y em x, estimada pelo método dos mínimos quadrados;
IV.- avaliação da associação linear entre as variáveis por meio do coeficientes de correlação (r) e de
determinação (r²);
V.- avaliação da significância do coeficiente angular.
§ 1º A homocedasticidade dos dados deve ser investigada para a utilização do modelo adequado.
§ 2º Nos testes estatísticos, deve ser utilizado um nível de significância de 5% (cinco por cento).
§ 3º O coeficiente de correlação deve estar acima de 0,990.
§ 4º O coeficiente angular deve ser significativamente diferente de zero.

LINEARIDADE
 Inspeção visual do gráfico das respostas

em função da concentração

LINEARIDADE
 Estimativa da equação da reta

 MMQO
 Análise do gráfico de dispersão dos resíduos

LINEARIDADE

LINEARIDADE
 Teste estatístico para comprovar a homoscedasticidade dos dados
 ANVISA recomenda o teste estatístico de Cochran
- Guia 10/2017
- Nível de significância de 5%
- Teste de hipótese – P-valor ou Valor do Teste C
 H0 : variâncias iguais  P-valor ≥ 0,05 ou Ccalculado < Ctabelado dados HOMOCEDÁSTICOS

 H1 : variâncias diferentes  P-valor < 0,05 ou Ccalculado ≥ Ctabelado dados HETEROCEDÁSTICOS

LINEARIDADE
 Avaliar o coeficiente de correlação (r)
- Quanto mais próximo de 1, melhor o ajuste
- ANVISA
 Critério de aceitação r > 0,990

LINEARIDADE
 Avaliar o coeficiente angular
- Deve ser comprovada a significância do coeficiente angular
- Teste de Hipótese – P-valor ou Teste F
- Tabela ANOVA
 H0 : coeficiente angular é igual a zero  P-valor ≥ 0,05 Fc ≤ FT

 H1 : coeficiente angular é diferente de zero  P-valor < 0,05 Fc > FT
 Teste F (tabela Distribuição F Fisher-Snedecor  1 GL no numerador e n-2 GL no denominador

LINEARIDADE
 Avaliar o coeficiente linear
- Comprovar que o intercepto é igual a zero
- Impacto na exatidão do método
- Uso ponto único ou curva de calibração?
- Caso seja comprovado que não passa pelo zero, deve-se avaliar se tem impacto na exatidão do método
- Realizar a exatidão e comparação de curva pontual com curva de calibração

LINEARIDADE
Teste de Hipótese – P-valor ou Teste T
 H0 : coeficiente linear é igual a zero  P-valor ≥ 0,05
 H1 : coeficiente linear é diferente de zero  P-valor < 0,05

LINEARIDADE
 Avaliação da normalidade
- Deve seguir distribuição normal
- Ryan-Joiner, Shapiro-Wilk, Anderson-Darling, Kolmogorov-Smirnov
- Teste de Hipótese
 H0 : possui distribuição normal  p-valor ≥ 0,05
 H1 : não possui distribuição normal  p-valor < 0,05
- Definir em protocolo qual teste estatístico será usado

Distribuição Normal
- Apresentação gráfica – QQ-Plot

LINEARIDADE
 Avaliação da normalidade

LINEARIDADE
 Avaliar outliers
- Resíduos Padronizados
- Resíduos Studentizados

LINEARIDADE
Independência de medida
- As medidas devem ser independentes
- No gráfico não deve ter comportamento crescente ou decrescente
- Teste de Durbin-Watson
 D ≥ 1,5  os resíduos são independentes
 D < 1,5  os resíduos não são independentes

EXATIDÃO / RECUPERAÇÃO
Deve ser deve ser obtida por meio do grau de concordância entre os resultados individuais do
método em estudo em relação a um valor aceito como verdadeiro (Art42°)
 No mínimo, 9 determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja, 3

concentrações: baixa, média e alta, com 3 réplicas em cada nível;
 Recomendado avaliar a recuperação para os níveis 125% do ARL, 100% do ARL e 75% do ARL, no
mínimo, e estender até o LOQ prático do método de teste;
 Aconselhável estender até LOQ do método e de um a três níveis intermediários, que é onde a maioria dos
dados devem estar.

CRITÉRIO DE ACEITAÇÃO
 Guia ISPE 70% a 110% - DPR ≤ 15% - não utilizar um único resultado mais baixo como o fator de
recuperação!!! Usar a média dos resultados encontrados dentro do intervalo linear;
 Guia WHO: mínimo 80%.
 Investigar resultados fora deste intervalo: MOC cupom, material swab, solvente de amostragem, solvente de
extração, condições de extração (tempo, vórtex, ultrassom, agitação).
 Qualificação do pessoal de amostragem - a média das três recuperações dentro de ± 10% do RF

estabelecido com uma variabilidade de < 15% RSD. (Guia ISPE)

FATOR DE RECUPERAÇÃO
 Uma abordagem APARENTEMENTE conservadora é usar a única recuperação mais baixa como o fator de
recuperação;
 Cientificamente e estatisticamente, essa abordagem não faz sentido!
 Cientificamente, usar essa abordagem faria com que as amostras próximas ao ARL falhassem na limpeza
quando, de fato, elas passam.
 Estatisticamente, a única recuperação mais baixa não é representativa porque ignora a maioria dos dados
de recuperação;
 A abordagem recomendada é usar a média do conjunto de dados de recuperação como o fator de

recuperação para todas as amostras de limpeza.

FATOR DE RECUPERAÇÃO
EXATIDÃO/RECUPERAÇÃO
Nível baixo Nível Médio Nível Alto
86,60% 88,90% 92,20%
85,90% 90,10% 89,90%
87,70% 91,10% 92,10%
Exemplo:
• Resultado da análise: 0,324ppm
• Fator de Recuperação = 89,39%

EXEMPLO
As recuperações em 5
μg/amostra de 25 cm2 estão
abaixo do nível de
recuperação (> 70%)
Fonte: Guia ISPE

PRECISÃO
Deve avaliar a proximidade entre os resultados obtidos por meio de ensaios com amostras
preparadas conforme descrito no método analítico a ser validado (Art33°)
 6 preparos no nível de concentração a 100% ou 3 preparos em cada nível: baixo, médio e alto;
 Normalmente utiliza as amostras da exatidão;
 Contaminar a placa com Padrão + Placebo ou Matriz + Padrão;
 Os resultados devem estar acima da recuperação mínima exigida e o DPR recomenda-se conforme tabela AOAC ou no
máximo 15% conforme guia ISPE;
 Repetibilidade e Intermediária;
• Todos os analistas/operadores que irão realizar a amostragem devem executar o parâmetro de Precisão –
Qualificação.
 Reprodutibilidade (entre laboratórios)

ROBUSTEZ
Indica a sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações das condições analíticas
(Art61°)
 Realizado no desenvolvimento analítico do método;
 Necessário em todas as validações;
 Demonstrar a adequação do sistema em todos os parâmetros da Robustez;
 Avaliar o impacto das variações através da comparação da recuperação da condição nominal com a condição
variada através – Teor (exatidão);
 Caso haja susceptibilidade do método à variações nas condições analíticas, estas deverão ser controladas e
precauções devem ser incluídas no procedimento;
 Não é permitido alterar os parâmetros de como é realizada a amostragem;
 Quanto mais robusto o método, maior a confiança deste em relação a precisão.

ROBUSTEZ
Estabilidade das soluções analíticas

Preparo de Amostras Tempo de extração
Compatibilidade de filtros
Variação do pH da solução
UV-Vis
Diferentes lotes ou fabricantes de solventes
Variação do pH da FM
Variação na composição da FM
HPLC Temperatura
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Fluxo da FM
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
GC Temperatura
Velocidade do gás de arraste

ESTABILIDADE
 A estabilidade do resíduo deve ser considerada ao desenvolver métodos analíticos para validação de limpeza
 Pré e pós-extração
 Avaliar se o intervalo de tempo entre a remoção dos resíduos e a realização dos testes analíticos não altera a
integridade das amostras coletadas;
 A falha neste estudo pode levar à detecção de quantidades menores do que as realmente existentes;
 Amostra no swab pode secar e se tornar mais difícil de extrair ou o analito de interesse pode degradar;
 Avaliar a estabilidade da amostra antes e após a extração;
 Recomenda-se estabilidade de pelo menos dois a três dias em caso de falha do instrumento durante o teste ou se
resultados inesperados precisarem ser confirmados;

ESTABILIDADE
Exemplo de Estudo de estabilidade das amostras em 24, 48 e 72 horas:
1. Amostras secas nas placas e somente coletadas nos períodos de interesse
2. Amostras coletadas nas placas no primeiro dia e acondicionadas em vials e somente diluídas nos
períodos de interesse
3. Amostras coletadas nas placas no primeiro dia e diluídas no mesmo momento, mas a análise
realizada apenas nos dias de interesse

EFEITO MATRIZ
Detergentes (ausência de placebo) e IFAV
 Aplicável quando não tem a matriz disponível
 Matriz complexa
 Mesmas condições da linearidade
 No mínimo, 5 (cinco) concentrações diferentes em, no mínimo, triplicata
 Comparação da curva em solvente com a curva da amostra fortificada com SQR
• Provar o paralelismo das curvas
• Coeficientes angulares (inclinação) não devem ser significativamente diferentes

DOCUMENTAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
 No PTC de Validação de Limpeza deve fazer referência à Validação Analítica (protocolo e relatório) do ativo,
detergente, agentes de limpeza
 Solventes utilizados nas análises;
 Descrição e marca do Swab;
 Técnica de amostragem

DESAFIOS DA VALIDAÇÃO DO PROCESSO DE LIMPEZA
BIOFARMACÊUTICA
 Os ativos biotecnológicos são quase universalmente degradados por processos de limpeza
 Os ciclos de limpeza biofarmacêutica geralmente incluem uma lavagem alcalina quente prolongada. O pH e a temperatura da
lavagem alcalina são tipicamente em torno de 13,3 e 70°C, respectivamente. A limpeza é normalmente seguida de sanitização a
vapor a ~120°C. Nessas condições, os anticorpos monoclonais e outras proteínas terapêuticas humanas (HTP) degradam e
desnaturam rapidamente em fragmentos farmacologicamente inativos.
 A degradação de proteínas durante a limpeza e sanitização tem implicações importantes para a validação de limpeza. Os resíduos
deixados após a limpeza são os degradantes dessas biomoléculas
 Geralmente esses fragmentos degradados são menos perigosos (ou não são mais perigosos) do que a proteína nativa, em parte
devido à imunotoxicidade das proteínas, que é conhecida por ser uma função do peso molecular (as proteínas de menor peso
molecular são menos preocupantes).
 No entanto, a degradação não pode ser assumida e deve ser demonstrada para que esse fenômeno seja usado para defender
programas de validação de limpeza.

BIOFARMACÊUTICA
 As empresas devem simular em laboratório o processo de limpeza (concentração de agente de limpeza,
temperatura, tempo de contato) para medir a degradação
 Avaliações para identificar fragmentos menores, ou seja, quantificar o grau de degradação de proteínas (a
eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida [SDS-PAGE]) e/ou um teste de atividade biológica
para confirmar que os degradantes não são biologicamente ativos da mesma maneira que a proteína nativa.

BIOFARMACÊUTICA
 As análises de carbono orgânico total (TOC) e proteína total são usadas para validação do processo de limpeza biofarmacêutica
porque um método analítico específico para determinação de resíduos não é apropriado devido ao fato de que os resíduos de API
são degradados
 Se a área de superfície total da rota do equipamentos for utilizada, no entanto, a proporção do tamanho do lote para os limites de
unidades de área de superfície é tão baixa que não são mensuráveis usando essas técnicas. Essa questão pode ser compensada
pelo fato de que é uma expectativa científica razoável que os resíduos das etapas anteriores de limpeza após a fermentação e a
colheita sejam removidos pelos vários processos de purificação cromatográfica usados no processamento a jusante. Por esse
motivo, muitas empresas optam por fazer um cálculo de transferência para fabricação a granel com base na área de superfície do
equipamento após a purificação. Em cálculos de carryover desse tipo, assume-se que todo o TOC (se esse for o método analítico)
é devido à proteína nativa, embora se saiba que o que está sendo medido são fragmentos degradados dessa proteína e outros
materiais orgânicos.

BIOFARMACÊUTICA
 É necessário ter dados que demonstrem que houve degradação e o grau dessa degradação (peso molecular), bem
como dados que confirmem a falta de atividade biológica das proteínas (ou, pelo menos, a mesmo atividade biológica
como da proteína nativa).

CONSIDERAÇÕES FINAIS
 Os estudos de recuperação são parte crítica de um programa de validação de limpeza;
 Devem ser executados de maneira cientificamente sólida e consistente;
 Os parâmetros de um estudo de recuperação podem aumentar ou limitar o valor do estudo de recuperação;
 Invista tempo neste estudo para garantir que todos os dados gerados deem apoio ao programa de validação de limpeza.
Fonte: Guia ISPE

Referências Bibliográficas
• Forsyth, R. J. “Best Practices for Cleaning Validation Swab Recovery Studies," Pharmaceutical
Technology 40 (9) 2016;
• Cleaning Validation Lifecycle—Applications, Methods, and Controls - The International Society for
Pharmaceutical Engineering (ISPE) Sept. 17, 2020;
• https://www.pharmtech.com/view/best-practices-cleaning-validation-swab-recovery-studies ;
• Forsyth, R. J. Journal of Validation Technology. Autumn, 2009;
• https://www.pharmtech.com/view/best-practices-cleaning-validation-swab-recovery-studies ;
• RDC n°166/2017 – Validação de Métodos Analíticos – ANVISA;
• Livro – Cleaning Validation - Science, Risk and Statistics-based Approaches. CPDI 1st Edition.
Andrew Walsh

Apoio Anual à ISPE Brasil 2023
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Obrigada
Validação Analítica para Metodologia de Limpeza
12 e 13/09/23 - São Paulo, SP

Instrutor: Ana Carolina Gonzales Moraes
E-mail: anacarolina@qspharma.com.br
Tel: (16) 98131-1135

ISPEBR 2023 - Validação de Método para VL

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Treinamentos Online

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2. Seleção do Método Analítico

4. Desenvolvimento de Estudo de Recuperação

5. Avaliação do Visualmente Limpo

6. Validação de Método Analítico para Validação de Limpeza

7. Documentação do Método Analítico

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 Portanto o objetivo da Validação de Limpeza é evitar possível contaminação e contaminação cruzada.

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• ANVISA – RDC 301/2019 - RDC 658/2022

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• Garante a segurança do paciente por meio de estudos baseados em risco realizados no

 Assim, a validação da limpeza é um requisito regulatório de BPF que visa garantir:

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 Existem dois tipos fundamentais de métodos analíticos: ESPECÍFICO e NÃO ESPECÍFICO.

 A seleção desses métodos requer uma abordagem baseada na ciência e no risco.

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MÉTODO ESPECÍFICO MÉTODO NÃO ESPECÍFICO

Não fornece medição ou quantificação direta do

Recomendado durante a validação de limpeza Recomendado após a validação de limpeza

Pode apresentar falsos positivos devido à presença

HPLC, IC, AAS TOC, pH, condutividade

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FONTE: Center of Pharmaceutical Cleaning Innovation – Andrew Walsh

 A figura apresenta uma hierarquia para selecionar métodos

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 Os limites devem ser "práticos, alcançáveis e verificáveis (FDA).

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FONTE: Center of Pharmaceutical Cleaning Innovation – Andrew Walshc

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FONTE: Center of Pharmaceutical Cleaning Innovation – Andrew Walshc

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TIPO DE ANALITO MÉTODO

Bioensaio, Absorbância, TOC, ELISA, SDS-PAGE,

Compostos inorgânicos Condutividade, pH, ICP

Compostos orgânicos Absorbância, TOC

Componentes biológicos Análise de células viáveis , Biocarga, Endotoxina

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 O tempo necessário para realizar esta técnica é adequado?

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 Simples, rápido e pode detectar limites baixos de resíduos (ppb).

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 Análise de TOC – envolve 3 etapas:

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• Medida direta - NDIR

FONTE: Farmacopeia Brasileira

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 Reduzir os níveis de background consequentemente reduz o LD

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