INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO DE

JANEIRO

RELATÓRIO DE MÉTODOS DE ANÁLISES BIOQUÍMICAS II

Cromatografia de camada delgada de lipídios (CCD)

Bianca Passos
Giovanna Verra
Maria Eduarda Teofilo
Mariana Rocha
Pedro Henrique Bastos
Thamires Maciel

Prática do dia: 16/12/2022

Professoras: Gisele e Leila
Turma: 261

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Introdução:
A cromatografia em camada delgada de lipídios tem como princípio a diferença de polaridade
e solubilidade da amostra. Essa amostra vai se dispersar entre a fase estacionária, que foi
utilizado sílica gel por ser uma material insolúvel e polar, e uma fase móvel, que é formada
por um sistema de solventes. A fase estacionária reveste a placa inerte, que pode ser de
vidro, plástico ou alumínio. É colocada a amostra em uma extremidade da placa e posta
verticalmente em uma câmara fechada com a fase móvel (solvente). A partir de capilaridade,
a fase móvel, também chamada de eluente, se direciona para o topo da placa. As substâncias
com menor afinidade com a fase estacionária percorrem mais rapidamente. Já as
macromoléculas polares se aderem ao ácido siálico da placa. Quando a fase móvel chega no
topo, a placa é retirada, o solvente é evaporado e os componentes separados são visualizados.
Caso os compostos fossem corados, a visualização pode ser feita a olho nu. Mas, geralmente,
os compostos não são corados e, com isso, são analisados sob luz UV. Para o sistema de
eluição, é necessário que se leve em consideração parâmetros como: toxicidade, custo e
inflamabilidade É um método considerado simples, rápido e barato para a obtenção de
resposta rápida quanto à composição química de uma dada mistura.

Objetivo:
O objetivo prática em questão foi utilizar os conceitos e técnicas de cromatografia utilizadas
muitas vezes para análise de diversas amostras com potencial para uso em ambientes
laboratoriais. Dito isto, o exemplo escolhido foi a gema de ovo de galinha, possibilitando a
posterior análise qualitativa dos lipídios presentes.

Materiais e métodos:
Algumas soluções foram utilizadas durante a prática, dentre elas: solvente de extração,
solução corante e solução descorante. Para a fase móvel sugerida para ocorrer a separação de
lipídeos de polaridade mista: Hexano/ Éter Dietílico/ Ácido acético (90:10:1) que é apolar, foi
preciso realizar um cálculo que se encontra na parte denominada de “resultados e discussão”.
A fase estacionária foi representada por um material polar e insolúvel denominado sílica gel.
Primeiro se ativou a placa de TLC na estufa por 2 horas a 100ºC. Após isso, foi preparado 50
mL do sistema de solventes. Foi depositada a fase móvel no interior da cuba cromatográfica,
de forma que cubra o fundo da cuba com 1 cm de altura. A cuba foi fechada hermeticamente
por 1 hora, para que ocorra a sua saturação com os solventes. Para manusear a placa de TLC
é necessário uma cautela para que não arranhe a camada de sílica, por isso, foi utilizado

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luvas. Recortou-se a placa e foi feita a marcação da linha de origem de aplicação da amostra e
padrões. A linha foi feita 2 cm acima da base da placa. Foi feita a marcação de 4 pontos
equidistantes para a aplicação da amostra e dos três padrões de lipídeos sendo: fosfolipídeos,
colesterol e triglicerídeo. Após isso, realizou-se a pré-corrida da placa (ou seja, uma eluição
inicial sem aplicação da amostra e nem dos padrões). Com isso, eluiu-se a fase móvel até a
parte final da placa de TLC. Enquanto ocorria a pré-corrida, foi preparado a amostra em
duplicata. A gema, separada da clara, foi colocada em um becker de 100 mL e adicionou-se
40 mL de água. Foi feita a homogeneização e avolumou-se a 100 mL em um cilindro. Em um
tubo de ensaio, foi colocado 2 mL da gema de ovo diluída. Adicionou-se 4 mL da solução de
extração clorofórmio/metanol e foi agitado para que ocorresse a extração dos lipídios da
gema. Após isso, foi realizada uma centrifugação a 3300 rpm por 10 minutos. Coletou-se 0,5
mL da amostra com um pipeta Pasteur, inserida até a fase orgânica. Esse volume foi
transferido para um eppendorf. Quando a pré-corrida se encerrou, foi retirada a placa da cuba
e colocada para secar no interior da capela. Após a secagem, aplicou-se os padrões de lipídios
e, por último, a amostra. Foram realizadas 3 aplicações por amostra, esperando o tempo de
secagem entre elas. Posteriormente, foi colocado a placa de TLC novamente no interior da
cuba, de forma que a base de cada fase móvel estivesse imersa. Esperou-se até que a frente da
fase móvel atingisse 2 cm do topo da placa. Ao final da eluição, retirou-se a placa e
realizou-se a marcação do front. Foi colocado na capela para que ocorresse a secagem. Após
isso, coloca-se a placa, com a parte da sílica voltada para baixo, em uma bacia com corante
(cobrindo a placa) e agitou-se por 5 minutos. Transferiu-se a placa para outra bacia com
solução descorante e agitou-se até que as manchas de lipídios estivessem bem definidas.

Resultados e discussão:
Cálculo realizado na fase móvel sugerida para ocorrer a separação de lipídeos de polaridade
mista: Hexano/ Éter Dietílico/ Ácido acético (90:10:1):
90/101 = 10/101 = 1/101

90/101 = X/50
X ≅ 44,55 mL → Hexano

10/101 = X/50
X ≅ 4,95 mL → Éter Dietílico
50/101 = X

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X ≅ 0,495 mL → Ácido acético
Somatório ≅ 50 mL

Análise qualitativa:

Na parte inferior da imagem acima, foi aplicada a amostra, o colesterol da amostra é

esterificado, por este motivo, quando é realizada a corrida ele fica apresentado na forma de
bandas. Na parte superior é a região da pré-corrida, sendo que a eluição ocorreu em um ponto
da parte esquerda superior (poderia ter corrido melhor), padrões correram mais. Foram
encontradas duas manchas próximo ao meio, um pouco mais para a parte superior, para medir
a mancha é utilizada uma forma estatística, utilizando o ponto que ela tem início e o de final,
realizando a medição do ponto médio e calculando o raio (como se fosse um círculo para tirar
seu raio).
Perguntas
1) Determine os Rf(s) das amostras e discuta a possível identificação dos lipídios da
gema do ovo.
Fator de Retenção (Rf);
eluição da amostra (dc) = 2 cm

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eluição do front (ds) = 7 cm
Rf= eluição da amostra (dc) / eluição do front (ds)
Rf= 0,28

2) Utilizando a tabela de séries eluotrópicas discuta a polaridade e justifique a escolha da

fase móvel.
A fase móvel por capilaridade, consegue ascender a placa e eluir (sendo retiradas as
substâncias que absorvidas, o que é ocasionado por um fluxo de líquido ou de gás por meio
de adsorvente) ou a amostra é percolada (passada de um líquido utilizando um meio para
realizar a filtração ou retirar substâncias do meio). Desse modo, a fase móvel foi escolhida
para a separação de lipídeos de polaridade mista. A respeito da polaridade, macromoléculas
polares se aderem de modo forte ao ácido salicílico presente na placa, porém substâncias que
possuem menor polaridade, que têm baixa afinidade com a fase estacionária, conseguem se
deslocar mais rápido. Sendo assim, utilizando a tabela de séries eluotrópicas, o hexano
apresenta menor polaridade na fase móvel, depois o Éter Dietílico apresenta polaridade de 2,8
na fase móvel (maior que do hexano) e o Ácido acético possui polaridade de 6,0 na fase
móvel (maior polaridade entre os três).
3) Discuta o princípio, sensibilidade e especificidade da revelação adotada.
R: Tal ensaio utiliza o princípio de adsorção, consistindo na presença de uma fase
estacionário fixada em uma placa (TLC) e uma fase móvel, composta por um solvente ou
combinação de solventes (no presente caso, clorofórmio/metanol 2:1), denominado de
eluente. As amostras são aplicadas diretamente na placa, que é adsorvente por conta de sua
composição química, geralmente sílica gel ou alumina.
Dito isto, tais fases estacionárias são extremamente polares, portanto, para uma boa adsorção
das amostras, é necessário uma ótima escolha de combinações e sensibilidades polares para o
solvente que será utilizado, para que não ocorram erros inesperados durante o ensaio.
Além disso, o solvente de extração utilizado envolvendo clorofórmio/metanol 2:1 (Método de
Bligh & Dyer) é deveras utilizado para a extração de lipídios, devido a especificidade e
capacidade de evaporação de clorofórmio e retirada de água mais metanol da solução em
questão, possibilitando apenas a amostra para ser analisada, sem nenhuma interferência.

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 4) Quais as modificações necessárias no sistema cromatográfico para realizar uma TLC
de fase reversa?
R: A cromatografia de fase reversa é uma técnica de cromatografia líquida que envolve a
separação de moléculas com base em interações hidrofóbicas entre as moléculas de soluto na
fase móvel e os ligantes fixados na fase estacionária. São empregues substâncias polares
quimicamente ligadas e os eluentes mais utilizados são: água, metanol e acetonitrilo. Nesse
método, o componente mais polar elui primeiro por ter maior solubilidade na fase móvel,
aumentando a polaridade da fase móvel, aumenta-se o tempo de eluição. A fase estacionária é
apolar.
5) Discuta os resultados hipotéticos caso utilize nesse ensaio uma TLC de fase reversa.
R: A cromatografia de fase reversa é um processo que envolve a separação de moléculas com
base na interação de uma fase móvel (solvente) com características polares, mais comumente
água, metanol, acetonitrila e tampão, além de uma fase estacionária apolar, caracterizada pela
presença de sílica ligada a hidrocarbonetos. Dito isto, os componentes com características
mais polares deveriam ser eluídos primariamente, com o aumento do tempo dessa eluição por
conta do constante aumento de polaridade da fase móvel.
Se fosse o caso do presente ensaio, o ácido acético deveria ser eluído primeiro, deixando o
hexano como último, neste caso, ou nem seria eluído, devido ao aumento de polaridade da
fase móvel.
6) Uma mancha única de área bem grande foi obtida a partir de uma TLC de fase
normal. Como se certificar da presença de um único lipídio ou aminoácido na
preparação?
R: Utilizando o presente ensaio como exemplo, é necessário uma medição dos valores da
mancha em questão e, para medir a mancha é utilizada uma forma estatística, utilizando o
ponto que ela tem início e o de final, realizando a medição do ponto médio e calculando o
raio. Isso faz com que seja possível a estimativa de que apenas um lipídio ou aminoácido
esteja naquela região.
7) Como proceder para melhorar a resolução de duas amostras distintas que após a
revelação apresentaram Rf(s) próximos?
R: Visto que o fator de retenção é definido como uma razão entre a distância percorrida pela
mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente, caso ocorra a presença de
valores de Rf próximos, é necessário uma avaliação entre os compostos utilizados, já que
existem vários que apresentam o mesmo Rf. Entretanto, caso não seja esta a situação,
algumas condições podem ter afetado os valores obtidos e seria necessário a revisão das

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mesmas, como por exemplo: o sistema do solvente utilizado; o adsorvente usado; a espessura
da camada adsorvente ou a quantidade relativa do material.

Conclusão:
Portanto, através da aula prática e da leitura da apostila de apoio, foi possível obter uma
melhor compreensão dos conceitos a respeito da cromatografia de camada delgada, o que
permitiu um melhor entendimento e análise dos resultados. Nesse sentido, foi possível
construir o cromatograma e a curva de calibração dos dois corantes. Além disso, a confecção
do relatório auxiliou na elaboração das respostas para as perguntas da apostila.

Referências bibliográficas:
Foram utilizados os materiais de apoio disponibilizados pelas professoras.