INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO DE

JANEIRO

RELATÓRIO DE MÉTODOS DE ANÁLISES BIOQUÍMICAS I

Cromatografia Líquida de Gel Filtração

Alessandra Passaroni

Bianca Passos

Mariana Rocha

Pedro Henrique Bastos

Professoras: Gisele e Leila

Turma: 261

Rio de Janeiro
2023
Introdução
A cromatografia líquida de gel filtração (GFC), cromatografia por exclusão de tamanho
(SEC), cromatografia de permeação de em gel (GPC) ou exclusão molecular é uma técnica
cromatográfica capaz de separar moléculas dissolvidas com base no seu tamanho e forma,
movendo-as através de colunas com interior microporoso.
Por conta dessa diferença entre o tamanho e a forma das moléculas, é possível observar certos
comportamentos que padronizados entre elas, como a velocidade de moléculas maiores ser
maior que as menores pela incapacidade de penetração no interior dos poros citados acima,
proporcionando assim uma capacidade de diferenciação de diversas características dessas
moléculas, como por exemplo, o volume hidrodinâmico que influencia diretamente na eluição
das mesmas.
Uma importante observação a ser comentada é a possibilidade de diluição de amostras na
cromatografia de gel filtração, justamente por necessitar um fluxo contínuo de solvente, ou
seja, esse fluxo permite uma maior capacidade de purificação e determinação da massa
molecular, além da dessalinização de soluções diversas.

Objetivos
Observar como a resina de Sephadex é formada em uma coluna cromatográfica e visualizar a
variação de concentração ao longo do tempo e coloração.
Além disso, Sephadex é considerada uma substância muito importante em situações
laboratoriais em que a dessalinização de soluções são necessárias.

Materiais e métodos
Os materiais utilizados consistiram em:
Azul de Dextran a 5 mg/mL em água destilada (anteriormente preparadas);
Vermelho de Fenol a 2 mg/mL em água destilada (anteriormente preparadas);
Azida sódica 0,001%;
Sephadex G-50;
Coluna cromatográfica;
Suporte para coluna;
Algodão hidrofóbico;
Bastão de vidro;
Tampão PBS;
Proveta de 10 mL;
Tubos de ensaio;
Espectrofotômetro.

Após separação dos materiais e soluções necessárias para a prática, inicialmente, pesou-se 1g
de Sephadex G-50 (conforme as instruções do fabricante) em um béquer de 50 mL em uma
balança analítica, a fim de preparar uma cama de 10 mL, aproximadamente. Após isso,
reidratar-se o Sephadex G-50 com 15 mL de PBS.
Para a preparação da coluna, colocou-se um fragmento de algodão hidrofóbico no interior da
coluna, com o auxílio de um bastão de vidro, com a coluna já fixada no suporte universal.
Para a preparação da cama, foi-se depositando de forma contínua a resina de Sephadex G-50,
deixando a coluna empacotar por cerca de 10 minutos. Foi importante durante o período de
empacotamento, não permitir a coluna secar, sempre gotejando a mistura da cama.
Com auxílio de uma pipeta pasteur, fez-se a pré-eluição da coluna, gotejando o tampão PBS
por 10 minutos.
Depois desse procedimento, pode-se preparar para carregar a coluna para receber a amostra.
Antes, foi necessário esperar até que o menisco do tampão PBS tocasse a superfície da resina.
Assim que isso ocorreu, fechou-se a torneira e carregou-se a coluna (bem próximo à resina)
com uma mistura de 200µL de Azul de Dextrano (2.000.000 Da) e 200µL de Vermelho de
Fenol (300 Da).
Posteriormente, abriu-se a torneira da coluna e esperou a penetração completa da amostra à
resina, aplicando fase móvel. Depois disso, foi mantido um fluxo constante de aplicação de
fase móvel até o final da eluição.
Assim que a amostra foi aplicada à coluna, iniciou-se a coleta das frações. Isso foi realizado
coletando 2mL em provetas de 10 mL, e posteriormente transferindo a alíquota para um tubo
de ensaio já rotulado; repetindo essa operação até que se validou que não havia mais vestígio
de corante.
Contando com o auxílio da professora, a coluna foi lavada em água destilada, desempacotada,
e guardada em um frasco contendo azida sódica 0,0001% na geladeira.
A partir da obtenção de todas as frações, elas foram lidas no espectrofotômetro, em dois
comprimentos de onda (λ) diferentes; sendo 620 nm para as frações azuis (faixa de absorção
máxima para o corante azul) e 560 nm para as frações vermelhas (faixa de absorção máxima
para o corante vermelho).
Resultados e discussão

Gráfico I

Gráfico II
Com estes resultados, foi possível observar ligeiros erros que acometeram em tais valores nos
gráficos demonstrados acima, um dos motivos mais plausíveis foi a falta de rinsagem da
proveta utilizada entre a coleta das amostras. Dito isto, ainda foi possível observar os picos
dos corantes vermelho de fenol e azul de dextrano, porém ambos, teoricamente, deveriam
apresentar-se de tamanhos aproximadamente iguais, sinalizando apenas a diferença de tempo
de tais acontecimentos.

Perguntas
1) Construa o cromatograma Abs x Volume de eluição (mL) da gel filtração dos corantes
em coluna Sephadex G-50, determinando os volumes morto e final da coluna
R: Em relação ao gráfico I, é possível observar a associação da absorbância e volume de
eluição dos corantes utilizados (vermelho de fenol e azul de dextrano) e os volumes morto (18
mL) e final (20 mL), no gráfico II.
2) Descreva o que foi observado em relação ao volume coletado da amostra após a
eluição. Justifique.
R: Nos volumes iniciais, foi constatado uma baixa absorbância, que foi se elevando à medida
que a eluição avançava. Após o pico da eluição de ambos os corantes, foi observado uma
queda em suas absorbâncias, visto que os corantes estavam sendo retirados da coluna.
Em nosso ensaio, foi observado um ligeiro atraso da retirada do corante azul de dextrano em
relação ao vermelho de fenol, situação que não deveria acontecer devido ao seu alto valor de
massa molecular, além disso, seu pico foi bem maior que o outro corante observado. Além
disso, este experimento pôde ser considerado pobre em resultados, pois o volume inicial foi
excluído e volume final foi incluído porque adentrou aos poros e só houve uma análise de
dois pontos específicos. Apesar dessas situações, foi possível entender os procedimentos do
ensaio em questão.
3) Analise a resolução, seletividade e eficiência obtidas neste ensaio.
R: Tal ensaio, infelizmente pode ser considerado de má resolução, má seletividade e uma
eficiência não ideal, visto que os erros interferiram na confecção dos resultados e,
consequentemente dos gráficos em virtude das relações de valores demonstrados nos mesmos.
Gráficos com resolução ótima apresentam uma maior separação entre os dois picos e a
seletividade representa uma medida do tempo ou da distância entre os picos analisados. Já a
eficiência está relacionada à largura dos picos, onde picos mais largos apresentam menor
eficiência, enquanto os mais estreitos caracterizam uma eficiência maior.
4) Por que as colunas armazenadas em metanol são pré-eluídas com água?
R: O metanol é utilizado no armazenamento das colunas utilizadas, pois possui a importante
função de permitir que o equipamento esteja suscetível a separação de fases e componentes da
amostra vistas neste ensaio, justamente pela sua característica de ser um solvente polar,
aumentada pela água aplicada, que aumenta o tempo de retenção das mesmas na coluna.

5) Por que as resinas devem ser guardadas em azida sódica? Como atua a azida?

R: A utilização da azida sódica consiste em soluções tampão para o armazenamento de

resinas, visto que essa substância possui um enorme potencial de atuar contra a proliferação
de microrganismos.

6) Como você procederia caso desejasse trabalhar com maior volume de amostra?

R: Primeiramente deve ser realizada uma avaliação das dimensões da coluna a ser utilizada.
Neste caso, o diâmetro da coluna seria o fator limitante principal. Quanto maior o diâmetro,
maior o volume necessário para sua utilização. Além disso, o uso do solvente é algo muito
importante, visto que, caso o solvente da amostra se mostrar mais fraco que a fase móvel, um
volume maior deverá ser utilizado, assim como o contrário.

7) Duas moléculas de mesma massa molecular obtiveram diferentes tempos de retenção.

Explique.

R: A cromatografia líquida de filtração em gel é um método que separa moléculas com base
em seu tamanho. Em teoria, moléculas menores demoram mais para eluir à medida que
penetram nos poros da coluna, fazendo com que demorem mais para passar pela coluna. Por
outro lado, moléculas maiores não penetram nesses poros, então elas eluem primeiro. No
entanto, certas propriedades dessas moléculas, como a polaridade, podem afetar a taxa de
eluição. Proteínas, por exemplo, apresentam um certo grau de compressão, que também afeta
a velocidade de eluição, ou seja, proteínas comprimidas demoram mais para passar pela
coluna do que proteínas cilíndricas. Essas características podem ajudar a explicar a diferença
nos tempos de retenção das duas moléculas.

8) Você está utilizando Sephacryl 5-500 HR. Entretanto, a eluição está demorando
excessivamente. O que fazer?

R: Uma opção a ser utilizada é reduzir o comprimento ou a largura da coluna, porém, outras
estratégias podem ser escolhidas para a redução dos tempos de eluição, como diminuição das
partículas da fase estacionária ou aumento da temperatura da coluna. Além disso, o fluxo de
eluição também pode ser controlado através da abertura da torneira da coluna.
 9) O que fazer quando a única chance de liberação de 2 substâncias é através de aumento
de "mesh" da resina e da ampliação do número de pratos teóricos?

R: Quanto maior a malha, menor o tamanho das moléculas que formam a renda, então
aumentar o comprimento da coluna é o ideal nesse caso.

10) Como você procederia para determinar a massa molecular de uma proteína presente
em uma solução incolor contendo várias macromoléculas?

R: Poderia ser realizado uma estimativa e comparação com os valores aproximados de massas
moleculares já categorizadas publicamente de proteínas conhecidas, visto que ocorre uma
relação entre peso molecular e o tempo de retenção dessas moléculas dentro da solução
utilizada para purificação neste ensaio, visto que moléculas mais pesadas e maiores
necessitam de uma maior quantidade de tempo para serem eluídas corretamente.

11) Como você calibraria sua coluna?

A curva de calibração dos corantes escolhidos foi realizada a partir da escolha da absorbância
mais alta de cada e seus respectivos volumes que caracterizam sua suposta saída de maior
intensidade. Dito isto, foi estabelecido que a saída de azul de dextrano ocorreu no volume
aproximado de 18 mL, enquanto o vermelho de fenol foi retirado em torno do volume
aproximado de 20 mL e a posterior leitura da massa molecular (em kD) correspondente, como
visto abaixo.

● Azul de dextrano : 6,30 kD (gráfico 4)

● Vermelho de fenol : 2,47 kD (gráfico 3)

Dito isto, a partir desses valores, foi possível o cálculo dos valores de antilog de cada corante
a partir da fórmula: 10x = MM, onde x é o log MM, visto adiante:

● Azul de dextrano

MM = 106,30103

MM = 2.000.000,0199681

● Vermelho de fenol

MM = 102,477127

MM = 300,0039687253

Tais valores correspondem aos valores apresentados em aula, sendo o MM do corante azul de
dextrano de 2.000.000 Dalton e vermelho de fenol de 300 Dalton.
Gráfico 3: Identificação da massa molecular do corante vermelho de fenol. O resultado obtido
foi de 2,47 kD

Gráfico 4: Identificação da massa molecular do corante azul de dextrano. O resultado obtido

foi de 6,30 kD
Conclusão

A cromatografia em gel filtração é um ótimo método para separação de moléculas de

diferentes tamanhos e formas, podendo também ser utilizada na separação dos pigmentos
utilizados que apresentam tamanhos bem distintos.
A prática foi realizada conforme demonstrado no protocolo de práticas e a coluna de gel
Sephadex G-50 foi devidamente empacotada, não sendo permitido o ressecamento do gel, que
não apresentou presença de rachaduras ao final do processo.
Após a preparação, a amostra foi adicionada a coluna e a coleta de cores ocorreu
adequadamente nos tubos de ensaio, sendo utilizados quatorze tubos para a completa coleta
das fases, nas quais foram adicionados 20 microlitros de cada cor em uma placa de poços. A
leitura foi feita corretamente no espectrofotômetro, utilizando os dois comprimentos de onda
solicitados pelo protocolo, entretanto, a ausência de lavagem das provetas entre a coleta das
frações comprometeu o processo, alterando e prejudicando completamente a visualização dos
resultados e impedindo a construção de um gráfico correto.

Referências Bibliográficas

Foram utilizados os materiais de apoio disponibilizados pelas professoras.