Cromatografia em Coluna
Gabriel HAUAGGE¹; Maria Eduarda da S. FADEL¹; Matheus MIRANDA¹.
¹Discentes do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Campus Toledo.
RESUMO: A cromatografia em coluna (CC) é uma técnica onde ocorre a distinção de
substâncias as quais estão presentes em uma mistura entre duas fases, a fase sólida,
geralmente sílica, e a fase líquida, sendo essa um solvente ou uma mistura de solventes,
baseado na capacidade de solubilidade e adsorção desses compostos. Em geral, na CC,
os compostos mais apolares passam pela coluna com maior velocidade do que os
polares, que têm maior afinidade com a sílica, um composto polar. O experimento foi
realizado com amostras de Spinacia oleracea (espinafre) e submetido a cromatografia
em coluna para separação dos pigmentos.
Palavras - Chaves: Cromatografia em coluna, vegetais, pigmentos.
1. INTRODUÇÃO
A extração de produtos naturais e sua separação cromatográfica podem ser
utilizadas para ilustrar vários fenômenos envolvendo interações moleculares ou forças
intermoleculares. A cromatografia é uma técnica utilizada para analisar, identificar ou
separar os componentes de uma mistura. A cromatografia é definida como a separação
de dois ou mais compostos diferentes por distribuição entre fases, uma das quais é
estacionária e a outra, móvel (BRONDANI,2019).
A análise quantitativa em cromatografia é baseada em estabelecer o valor da área
da banda cromatográfica (VALENTE et al, 2003). A cromatografia em coluna é uma
técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na capacidade de adsorção
e solubilidade. O sólido deve ser uma material insolúvel na fase líquida associada,
sendo que os mais utilizados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3) geralmente na
forma de pó (BRONDANI,2019).
A cromatografia em coluna é comumente utilizada para purificação de
substâncias orgânicas ou, para promover o material de partida ou isolar o produto
desejado de uma reação. Para tal, a mistura é passada através de um tubo de vidro
vertical preenchido com sílica ou alumina (ou outra fase estacionária) e, é coletada em
pequenas frações. Os vários componentes de uma amostra podem ser separados através
da interação diferenciada como solvente (fase móvel) e o adsorvente (fase estacionária)
(BRONDANI,2019).
O experimento envolve a extração das clorofilas e carotenóides presentes no
espinafre com o auxílio de solventes e o emprego de técnicas cromatográficas para a
visualização e separação desses componentes.
2. OBJETIVOS
A aula prática teve como objetivo aplicar e compreender o método analítico de
cromatografia em coluna, para separar pigmentos de um extrato de espinafre,
baseando-se na distribuição diferencial das substâncias na fase estacionária e móvel.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Deu-se início ao experimento preparando a fase móvel, uma solução de 20 mL
acetona e 80 mL de hexano.
Pesou-se cerca de 15 g de folhas de espinafre em um becker, que recebeu água
até cobrir a amostra e foi fervido por um minuto. As folhas foram retiradas, secas com
papel e maceradas em um cadinho, juntamente com 2 g de sulfato de sódio e 20 mL da
fase móvel. Após 15 minutos de repouso o macerado foi filtrado.
Em uma bureta, um chumaço de algodão foi introduzido, evitando o
entupimento da torneira. Adicionou-se cerca de 15 g de sílica à fase móvel e a bureta foi
preenchida com a mistura (Figura 1).
O extrato de espinafre foi adicionado às paredes da bureta com o auxílio de uma
pipeta Pasteur e a torneira aberta para coletar as frações em um becker, separando por
cores. Com a completa extração dos carotenóides, visando a extração da clorofila,
adicionou-se acetona pura.
Figura 1 - Esquematização de Cromatografia em Coluna.
Fonte: Apostila de Química Orgânica Experimental.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A fase móvel foi preparada utilizando acetona e hexano. A acetona é um
solvente orgânico polar, já o hexano apolar. A fase estacionária foi preparada com sílica,
um adsolvente polar.
Figura 2- Fase móvel e estacionária
Fonte: Autoria própria.
O extrato de espinafre foi obtido por maceração com 20ml de solvente orgânico
e 2g de sulfato de sódio. A cor verde da planta se deve a presença de clorofila e sua
perda tem relação com a transição dos cloroplastos que contêm pigmentos carotenóides
amarelos e vermelhos. As clorofilas a e b estão presentes em uma proporção de
2,5-3,5:1. (LIMA et al., 2012)
A aplicação da amostra na coluna, seguida pela abertura da torneira e adição das
porções de fase móvel, visava obter a separação dos pigmentos presentes no extrato de
espinafre (Figura 1). Os pigmentos amarelos (B-carotenos, xantinas, xantofilas) (Figura
3) seriam os primeiros a saírem da coluna e os verdes (clorofila a e clorofila b) (Figura
4) seriam os últimos, com a adição da fase móvel de acetona pura. O β-caroteno é um
hidrocarboneto insaturado que deveria demonstrar maior interação com a fase móvel,
constituída de acetona e hexano, já que o hexano é um solvente orgânico apolar e na
solução estava em maior quantidade. As xantinas ou xantofilas possuem cadeias longas,
o que confere pouca afinidade com a sílica, que é polar. Por fim, as clorofilas a e b
possuem magnésio no centro de uma substância com unidades modificadas de pirrol,
fazendo com que a interação com a sílica seja mais forte do que a com o solvente,
portanto, a adição da fase móvel de acetona pura, que é polar, possibilitaria a extração
das mesmas.
Figura 3- Estruturas do β-caroteno (I) e de uma xantina ou xantofila (II).
Fonte: Fonseca e Gonçalves (2004).
Figura 4- Estruturas da clorofila a (III), da clorofila b (IV).
Fonte: Fonseca e Gonçalves (2004).
Sendo assim, após os procedimentos descritos o que se esperava ter em
diferentes beckeres eram diferentes frações eluídas, como na figura 5.
Figura 5- Frações eluídas.
Fonte: Autoria própria.
Entretanto, o resultado observado não foi o esperado. A sílica utilizada foi
fabricada em 2010 e com vencimento previsto para 2015. Suas especificações são de
350-450 m²/g de superficie específica, pH de 5,5-7,5, volume do poro de 0,65-0,85
mL/g e a distribuição das partículas é de 7% menor do que 5 µm, 10% maior que 40 µm
e de 11-15% de gesso. As especificações podem não corresponder com as ideais para a
realização da prática de cromatografia em coluna, assim como o fato de o reagente estar
vencido.
Realizou-se uma pesquisa para checar a granulação da sílica utilizada em
cromatografia de coluna. A da marca MERCK e Êxodo Científico possui granulação de
63-200 µm, ou seja, os grânulos são maiores do que os utilizados, o que reforça a
hipótese de fonte de erro.
5. CONCLUSÃO
Apesar dos erros presentes na prática relacionados aos reagentes (sílica) e as
vidrarias (coluna de cromatografia) ela serviu de base para entender que apesar de
parecer um experimento simples é necessário pesquisar préviamente que tipos de
compostos a amostra pode ter e quais reagentes usar tanto na fase estacionária quanto
móvel, como por exemplo, qual tipo de sílica é ideal. Além disso, o experimento provou
a importância de sempre checar se as vidrarias estão funcionando corretamente antes do
uso para não comprometer todo o processo.
A análise de dados adquiridos de outros grupos que realizaram o mesmo
experimento permitiu inferir que mesmo nessas condições é possível realizar com êxito
a prática e separar os pigmentos amarelados e esverdeados. Com base nesses fatores,
ainda existe a possibilidade de erro do técnico no manuseio das vidrarias e preparo das
fases estacionária e móvel. A falha do experimento não foi motivo de perda ou
desperdício já que mesmo no erro é possível adquirir experiência e conhecimento para
as próximas práticas.
REFERÊNCIAS
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Acesso em 12 de agosto de 2022.
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Universidade Federal de Jataí. Curso Bacharelado de Química.
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Disponível em: [Link] Acesso em:
12 set. 2022.
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[Link]
esh-para-cromatografia-em-coluna-500g-exodo-cientifica?utm_source=Site&ut
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[Link]
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