Aluno: Fábio Fernandes de Araújo Matricula: 209392

Relatório aula pratica:

Cromatografia Liquida em Coluna Aberta

Introdução

A cromatografia é uma técnica da química analítica utilizada para a separação de

misturas e substâncias. De maneira mais completa, a técnica baseia-se no princípio da
adsorção seletiva, um tipo de adesão. Essa técnica foi descoberta em 1906 pelo botânico
italiano naturalizado russo Mikahail Tswett, que utilizou a técnica para separar pigmentos
de plantas como a clorofila adicionando um extrato de folhas verdes em éter de petróleo
sobre uma coluna com carbonato de cálcio em pó em um tubo de vidro vertical. Enquanto
a solução percolou através da coluna os componentes individuais da mistura migraram
para baixo em tempos e velocidades diferentes e então a coluna apresentou-se marcada
com gradientes horizontais de cores. Esse gradiente recebeu o nome de cromatograma
(NAGASHIMA et al., 2013).
A cromatografia em coluna é bastante utilizada para purificar substâncias
orgânicas e para isolar o produto desejado de uma reação. Geralmente utiliza-se como
coluna um tubo de vidro vertical preenchido com sílica ou alumina. Os vários
componentes de uma amostra podem ser separados através de diversas interações com a
fase móvel e a fase estacionária. Para uma fase estacionária contendo sílica, compostos
polares irão interagir mais forte que compostos não polares, ficando mais retidos e sendo
eluídos posteriormente (BRONDANI, 2018).
Os pigmentos vegetais podem ser classificados em três principais categorias:
carotenoides, clorofilas e flavonoides. As clorofilas podem se apresentar em mais de uma
forma. Quanto à solubilidade, os carotenoides e as clorofilas são solúveis em lipídeos e
em solventes orgânicos (acetona, benzeno, clorofórmio, dissulfeto de carbono, etanol, e
éter etílico) e estão localizados nos cromoplastos e cloroplastos, respectivamente
(ROCHA; REED, 2014).
Existe vários tipos de clorofilas que podem ser encontradas e o que as diferem são
as estruturas em torno dos substituintes do núcleo da forbina. As clorofilas mais comuns
encontradas na natureza estão na proporção 3:1, essas são denominadas clorofilas a e b,
diferindo entre si pelo substituinte do carbono C-3. A clorofila a possui um grupo metil,
enquanto que a clorofila b possui o Formil como grupo. Porém, alguns grupos são comuns
a ambas as clorofilas, são eles: vinil e etil (posição C-2 e C-4); carbometoxi (C-10) e fitol
esterificado (C-7) (VON ELBE, 2000).
Já os carotenoides são compostos pouco solúveis em água e podem ser divididos
em carotenoides hidrocarbonados, representados pelos α, β e γ- caroteno, licopeno e
bixina, e em xantofilas, que são compostos de carbono, hidrogênio e oxigênio
(carotenoides oxigenados), representados pela capsorubina, capsantina criptoxantina,
zeaxantina, xantofila e luteína. O principal papel dos carotenoides na dieta dos seres
humanos é a sua capacidade de atuarem como precursores de vitamina A (GOMES,
2012).

Objetivos

Ver na prática como ocorre a separação dos carotenoides e da clorofila presentes

no extrato de espinafre por meio da técnica de cromatografia liquida em coluna aberta.

Material e métodos

Foram utilizados os seguintes matérias e reagentes para a realização das análises:

bastão de vidro, Becker, torneira para bureta, potes de penicilina, pipeta de plástico,
espátula de aço, erlenmeyers, seringa de plástico, lã de vidro, alumina, N-hexano 75% e
acetato de etila 25%.

Empacotamento da coluna

Preparou-se uma coluna para cromatografia utilizando uma seringa de plástico de

50 ml e alumina como fase estacionaria. Foi colocado uma pequena quantidade de lã de
vidro dentro da seringa para evitar vazamento do recheio da coluna. Em seguida pesou-
se aproximadamente 2 g de alumina em um Becker e misturou com 5 ml de hexano. A
mistura foi utilizada para preencher a coluna. Acrescentou-se mais hexano
aproximadamente 10 ml controlando o nível do solvente abrindo ocasionalmente a
torneira da coluna até que a fase móvel não descesse mais.

Separação dos componentes de uma mistura

 Distribuiu-se homogeneamente sobre o topo da coluna, com auxílio de uma pipeta
de pasticho, acrescentou-se 2 ml do extrato de espinafre. Feito isso a torneira da coluna
foi aberta até que a amostra entrasse completamente dentro da fase estacionaria e então
foi adicionado mais um pouco de alumina (Fase móvel) dentro da coluna com a finalidade
de evitar que amostra se dissolvesse na fase móvel quando a mesma fosse adicionada.
Depois procedeu-se a eluição com solvente Hexano, onde adicionou-se hexano
cuidadosamente para não causar distúrbios ou agitação. Depois de adicionar a fase móvel,
a vazão foi controlada para que saísse de 1 a 2 gotas por segundo até que começasse a
sair a banda amarela que continha os carotenos e assim coleta-la no frasquinho de
penicilina. Após a coleta dos carotenos foi adicionado aproximadamente 5 ml de acetato
de etila para a retirada da banda verde que continha a clorofila.

Resultados e Discussão

O empacotamento da coluna é uma etapa crítica para uma boa separação dos
analitos, onde a maior dificuldade encontra-se em empacotar de forma uniforme a coluna.
A técnica original de cromatografia em coluna aberta, utilizava como solventes o éter de
petróleo e o hexano para separar as clorofilas dos carotenoides presentes em extrato
vegetal, porem a substituição desses solventes pelo acetato de etila e hexano mostram-se
como uma boa opção, uma vez que esses solventes são menos prejudiciais ao meio
ambiente.
O método de cromatografia líquida em coluna aberta através do mecanismo de
adsorção, permitiu a separação dos dois pigmentos presentes no extrato de espinafre
(carotenoides e clorofilas). Como a fase estacionaria escolhida foi a alumina e a fase
móvel utilizada primeiro foi o hexano que apresenta característica de solvente mais
apolar, polaridade de 0,1 (SNYDER et al., 1993), os compostos (como a clorofila
apresentaram mais afinidade pela fase estacionaria e por isso tenderam a ficar retidos na
mesma, pois o hexano não possuiu força suficiente para arrastar estes compostos. Já os
carotenoides presentes no extrato foram facilmente separados utilizando o hexano, uma
vez que os carotenoides possuem mais afinidade pelo hexano do que pela alumina, e com
isso sendo arrastados pela fase móvel. Já a separação da clorofila que ficou retida na fase
estacionaria só foi possível com a utilização de um segundo solvente com característica
mais polar, onde foi utilizado o acetato de etila, que possui polaridade de 4,4 (SNYDER
et al., 1993), o qual permitiu com que a clorofila fosse arrastada junto com a fase móvel.

Conclusão

Com a realização da aula pratica de cromatografia liquida em coluna aberta, foi

possível proporcionar aos alunos uma demonstração de como ocorre na prática a
separação dos compostos presentes em uma amostra, como foi o caso do extrato de
espinafre. Também foi possível observar como o tipo de fase móvel e fase estacionarias
podem influenciar em uma melhor separação dos compostos dependendo da sua
polaridade.

Referencias

BRONDANI, Patrícia Bulegon. Cromatografia em Coluna: Dicas. Disponível em:

<http://nuquiocat.quimica.blumenau.ufsc.br/files/2016/07/Cromatografia-em-
Coluna.pdf>. Acesso em: 15 mar. 2018.

GOMES, Lidiane Martins Mendes. Inclusão de carotenoides de pimentão vermelho

em β-ciclodextrina e avaliação da sua estabilidade, visando aplicação em
alimentos. 2012. 108 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Curso de Mestrado do
Programa de Pósgraduação em Ciências Aplicadas A Produtos Para Saúde, Universidade
Federal Fluminense, NiterÓi, 2012.

NAGASHIMA, Lucila Akiko et al. Coletânea de Atividades

Experimentais. Paranavai: Gráfica Paranavaí, 2013. 84 p.

ROCHA, Danielly Santos; REED, Elaine. Pigmentos naturais em alimentos e sua

importância para a saúde. Estudos, Goiânia, v. 41, n. 1, p.76-85, mar. 2014.

SNYDER, L. R. et l. Solvatochromically based solvent-selectivity triangle. Journal of

Chromatography A, v. 656, p. 537-547, 1993.
VON ELBE, J.H. Colorantes. In: FENNEMA, O.W. Química de los alimentos. 2.ed.
Zaragoza : Wisconsin - Madison, 2000. Cap.10, p.782-799.