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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUMICA RELATRIO II: ATIVIDADE 2 DISCIPLINA: Qumica Orgnica

Experimental QUI031 PROFESSOR: Bruno

ATIVIDADE 2 CROMATOGRAFIA EM COLUNA: EXTRAO E FRACIONAMENTO DE PIGMENTOS VEGETAIS


REALIZADA EM 02/10/2012

INTEGRANTES DA BANCADA 4 - TURMA: F3 Juliana Alves Martins Monique Aline Ribeiro dos Santos

Belo Horizonte - MG

Outubro - 2012 I OBJETIVOS Extrair pigmentos vegetais e fracion-los atravs da tcnica de cromatografia de absoro em coluna.

II INTRODUO
i.

-Caroteno
Os carotenos so pigmentos orgnicos encontrados nas plantas e microrganismos

como algas e fungos. So essenciais para a vida e nenhum animal pode sintetiz-los, por isso devem ser ingeridos na dieta. O -caroteno um dos mais de 600 carotenoides presentes na natureza. Essa substncia a mais abundante e eficaz provitamina A, encontrada em diversas plantas e frutas, tais como espinafres, broclis, couve, chicria, agries, papaias, mangas, carambolas, nectarinas e pssegos. Sendo que, o contedo de beta-caroteno de frutas e vegetais pode variar dependendo da estao e do grau de amadurecimento. Entre as propriedades biolgicas do -caroteno so: funes anti-oxidantes, que ajudam a neutralizar os radicais livres, e ajuda a extinguir o oxignio sinlgleto, uma molcula reativa que gerada na pele por exposio luz ultravioleta e que pode induzir alteraes prcancergenas nas clulas. Os carotenoides podem perder alguma de sua atividade, durante o armazenamento dos alimentos, devido ao das enzimas e exposio luz e oxignio. Alm disso, a desidratao dos vegetais e frutas tambm pode reduzir grandemente a sua atividade biolgica. A perda de atividade ocorre devido presena de insaturaes presentes na molcula, conforme mostra a figura 1, que faz essa molcula ser bastante reativa. Entretanto se os alimentos forem congelados, a estabilidade dos carotenoides mantida.

Figura 1 Molcula de Beta Caroteno

Algumas das propriedades fsico-qumicas deste composto so: hidrofbico, lipoflico, insolvel em gua e solvel em solventes orgnicos como acetona, lcool e clorofrmio e o seu pigmento vai do amarelo ao vermelho.

ii. Clorofila
A clorofila um grupo de pigmentos presentes nas clulas das plantas e algas e responsvel pela colorao verde. Em sua estrutura molecular, conforme figuras 3 e 4, contm magnsio e transporta oxignio nas clulas da planta.

Figura 2 Molculas de clorofila a, b e c

O nome clorofila foi proposta por Pelletier e Caventou, em 1818, para denominar a substncia verde que se podia extrair das folhas com o auxlio do lcool. Este pigmento produzidos nos cloroplastos das folhas e em outros tecidos vegetais e funciona como fotorreceptor da luz visvel utilizada no processo da fotossntese. A clorofila absorve muito bem a luz das regies azuis e vermelhas, refletindo a luz verde. As diferenas aparentes nas cores dos vegetais so devidas presena de outros pigmentos associados, como os carotenides, os quais sempre acompanham as clorofilas. Existem vrios tipos de molcula de clorofila, variando de acordo com o comprimento de onda da luz que cada uma capaz de absorver. Outros pigmentos, denominados pigmentos acessrios, organizam-se em conjuntos cuja funo primordial captar a energia luminosa, para conduzi-la at a clorofila. Quimicamente, as clorofilas a e b so lcoois diterpenides, tm estrutura tetrapirrlica e so steres, derivados de diidroporfirina, que so quelatos com um on de magnsio localizado centralmente. Alm disso, as clorofilas possuem um lcool isoprenide monoinsaturado, um diterpeno e o fitol, que esterificado com o quarto anel, e se encontra na configurao trans. O fitol representa o lado hidrofbico da molcula, enquanto o resto da molcula hidroflico. Logo, a presena do fitol confere a clorofila uma caracterstica apolar e lipoflica.

iii. Cromatografia em Coluna A cromatografia um mtodo fsico-qumico de anlise para a purificao, separao, identificao e quantificao de substncias em uma mistura. realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases, que esto em contato. Uma das fases permanece estacionria enquanto a outra move-se atravs dela. Durante a passagem da fase mvel sobre a fase estacionaria, os componentes da mistura so distribudos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes seletivamente retido pela fase estacionria, resultado em migraes diferenciais destes componentes.

Entre os mtodos de anlise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao das espcies qumicas, por si mesma ou em conjunto com outras tcnicas instrumentais. Alm disso, a grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias torna esta tcnica extremamente verstil e de grande aplicao. Na cromatografia em coluna um tubo de vidro empacotado com material adsorvente (fase estacionria) que pode ser slica gel, alumina, carbonato de clcio, xido de magnsio, carvo ativado, sacarose e amido. A coluna colocada na posio vertical e a soluo dos compostos passa de cima para baixo arrastada por um ou mais solventes (fase mvel). A eluio feita de modo a obter fraes que podem conter misturas de compostos ou compostos puros. A cromatografia em coluna fundamenta-se no fato de que os componentes de uma mistura movem-se com solventes pela coluna com velocidades diferentes, dependendo de fatores como a natureza de cada substncia, a natureza do solvente e a atividade do adsorvente. A separao dos constituintes de uma mistura efetuada atravs da passagem do solvente pela coluna e baseia-se na interao dos componentes da amostra e do solvente com a superfcie adsorvente. Isso possvel porque o adsorvente slido ativo tem uma grande rea superficial e pelo fato de dispor inmeros stios polares podem se combinar reversivelmente ou adsorver pequena concentrao de substncias atravs de foras de atrao eletrosttica. O solvente movendo-se pela superfcie do adsorvente compete com a amostra adsorvida e com o adsorvente, e ento desloca seus constituintes reversivelmente e continuamente pela coluna. Este processo pode ser visualizado como uma competio entre a amostra, o solvente e o adsorvente e pode ser expresso pelo equilbrio a seguir: Amostra-Adsorvente Amostra-Solvente

Solvente

O fluxo de solvente deve ser contnuo e a velocidade de eluio dos compostos depende da natureza de cada um destes compostos. Sendo que, compostos polares ou polarizveis, tais como lcoois, cidos carboxlicos, amidas, aminas, so adsorvidas mais fortemente e eluidos menos prontamente do que compostos menos polares, tais como compostos halogenados, aldedos, cetonas, teres e hidrocarbonetos. medida que os
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compostos da mistura so separados, bandas ou zonas comeam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto. Em geral, os compostos apolares passam atravs da coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros tm menor afinidade com a fase estacionria. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela no se mover. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eludos sem serem separados. Por uma escolha cuidadosa das condies, praticamente qualquer mistura pode ser separada. Sendo assim, solventes pouco polares so empregados para substncias fracamente adsorvidas enquanto solventes polares so para aquelas fortemente adsorvidas. A atividade do adsorvente slido tambm determina a velocidade com que as substncias so eluidas. A atividade determinada pelo seu contedo de gua e pela granulao das partculas. Alguns solventes comumente utilizados esto listados a seguir na ordem de aumento da polaridade. Hexano Diclorometano Clorofrmio ter Etlico Acetato de Etila Etano Metanol gua Partindo destes princpios, pode-se realizada a extrao da clorofila e o -Caroteno

de folhas de espinafre atravs da cromatografia em coluna.

III MONTAGENS E MATERIAIS UTILIZADOS

III.i. Reagentes Coluna com torneira; Basto de vidro;


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Algodo; Papel Absorvente; Pipeta conta-gotas; Erlenmeyer de 125,0 mL; Proveta de 25,0 mL; Tela de Amianto; Trip; Basto de Vidro com borracha; III.i. Montagem

Bqueres de 50,0 mL; Almofariz com pistilo; Suporte; Garras e Mufas; Esptula; Bico de Gs; Funil de haste longa; Chapa eltrica.

garra

erlenmeyer

Haste universal Figura 4 Montagem para cromatografia em coluna

III PARTE EXPERIMENTAL III. I PROCEDIMENTOS

i.

Empacotamento da Coluna Uma coluna de vidro foi fixada, verticalmente, em um suporte, fechou-se a torneira e com o auxlio de um funil introduziu-se 10,0 mL de hexano. Com um arame, foi introduzido, at a conexo do tubo com a torneira, um pequeno chumao de algodo. Preparou-se uma suspenso contendo cerca de 5,0 g de slica gel e hexano (quantidade de hexano de forma que este ficou cerca de 5,0 mL acima da slica), esta foi introduzida na coluna com o auxlio de um funil e com a ajuda de um basto de vidro com borracha foi dadas leves pancadas na coluna para que a acomodao do solvente ocorre de forma homognea. Como a coluna encheu antes da total transferncia da suspenso, a transferncia foi completada simultaneamente com a retirada do eluente. Aps a total transferncia da suspenso, o solvente foi recolhido at que o nvel de solvente ficasse por volta de 3,0 cm acima do topo da fase estacionria.

ii. Preparo do Extrato Foi pesado aproximadamente 10,0 g de folhas de espinafre, removeu-se as nervuras e ferveu estas folhas por aproximadamente 2 minutos em 100,0 mL de gua destilada. Desprezou-se a gua na pia, as folhas foram resfriadas com gua gelada e foram enxugadas utilizando papel toalha. As folhas foram colocadas em um almofariz e adicionou-se uma mistura de hexano e acetona 1:1. Em seguida, as folhas foram trituradas at obter um soluo verde que foi transferida para um bquer pequeno. No bquer contendo a soluo, foi colocada duas pontas de esptula (tipo canoa) de slica para encorpar o extrato. Essa mistura foi colocada em uma chapa quente, localizada na capela, para o solvente secar, sendo que, neste procedimento o bquer foi agitado para no haver projeo.
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iii. Eluio da Coluna Cromatogrfica O extrato foi adicionado no topo da coluna com o auxlio de um funil de haste longa e a torneira foi aberta para o solvente escoar at a soluo atingir o topo do recheio, a torneira foi fechada e adicionou-se um pouco de hexano, utilizando pipeta conta-gotas para lavar a parede da coluna. Em seguida a torneira foi aberta at o solvente atingir novamente o topo do recheio. Este procedimento foi repetido. Fechou-se a torneira, colocou-se o hexano at completar a coluna para proceder a eluio. Abriu-se a coluna e recolheu o solvente at que a primeira banda esteja bem prxima a torneira, este solvente recolhido no erlenmeyer foi chamado de frao I. Sendo que quando o solvente contido na coluna atingia o topo do recheio foi adicionado mais hexano para no ressecar a slica. Substitui-se o frasco de coleta e recolheu a frao II at o eluente perder a cor. Substitui-se novamente o erlenmeyr coletor, aguardou o solvente atingir o topo do recheio, o solvente foi substitudo por acetona e continuou recolhendo o eluente at que a segunda banda esteja bem prxima a torneira, a soluo contida neste erlenmeyer foi chamada de frao III. Substitui o frasco coletor e recolheu a frao IV. Comparou-se as cores dos eluatos obtidos, transferiu-se as fraes recolhidas para os frascos identificados na capela. Em seguida, remou-se o adsorvente das colunas deixando-o no local indicado e desprezou-se todas as folhas no lixo.

IV RESULTADOS E DISCUSSO

Na parte de preparo do extrato as folhas de espinafre foram fervidas para que as substncias solveis em gua fossem extradas e, como as substncias de interesse so

orgnicas, esta gua foi desprezada. J a adio de cetona e hexano seguida de macerao das folhas foi realizada para extrair as substncias orgnicas.

Os eluatos obtidos apresentavam as seguintes coloraes: Tabela 1: Coloraes dos eluatos obtidos Frasco 1 Frasco 2 Frasco 3 Frasco 4 Incolor Levemente amarelo Incolor verde

A adio da amostra seguida do hexano, no tubo, ocorreu a separao em duas bandas, uma de colorao verde e a outra de colorao amarela. Sendo que a substncia de colorao amarela estava na parte inferior, conforme mostra a figura 2.

eluente Banda 2: verde Banda 1: amarela

Figura 4 Coluna aps a adio da amostra e hexano

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O frasco coletor 1 apresentava-se incolor devido este haver basicamente hexano e, possivelmente, traos da substncia de colorao amarela, mas isto foi imperceptvel a olho n, j que a maior parte da substncia amarela ainda estava prxima torneira da coluna. J o frasco 2, possua colorao levemente amarelada. Pelo fato desta substncia possuir esta colorao, ter sido extrada com hexano, que um solvente apolar, e pelas estruturas moleculares apresentadas na introduo, indica que esta substncia o caroteno que, por ser uma substncia apolar, interage menos com o adsorvente e mais com o hexano, logo, nessa competio pelo substrato, o solvente consegue interagir de forma mais eficiente e arrasta-o pela coluna mais facilmente. No frasco 3, a colorao tambm era incolor. Entretanto neste frasco pode haver ainda traos do beta caroteno, alm disso poderia haver hexano que estaria contido na parte interior do tubo no inicio da adio de acetona, a prpria acetona e possivelmente traos da substncia verde. No tubo 4, a colorao era esverdeada. Como esta substncia apresenta esta cor, foi extrada com acetona, que um solvente polar, e foi adsorvido mais fortemente, indica que esta substncia a clorofila que por sua estrutura molecular ser mais polar interage mais com a acetona, logo na competio entre o solvente e o adsorvente o primeiro conseguir interagir mais eficientemente com a molcula e arrast-la no tubo.

V CONCLUSO Pela tcnica de cromatografia em coluna empregando slica como adsorvente e hexano e acetona como eluentes foi possvel a extrao de clorofila e c aroteno. Isso foi possvel porque estas duas ltimas substncias apresentam polaridades distintas, logo foram adsorvidas de forma diferenciada pelo adsorvente, sendo que, a slica adsorve melhor as substncias mais polares. Segue-se, ainda, que a adio do eluente menos polar interagiu de forma mais eficiente com o -Caroteno logo este foi extraido pimeiro. Logo aps a adio da acetona foi extrado a clorofila por esta ser mais polar e interagir melhor com a acetona.

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VI - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS [1] COLLINS, Carol H; BRAGA, Gilbert L.; Introduo a Mtodos Cromatogrficos, Editora da Unicamp, 5 Ed., Campinas, 1993, pginas 13 a 27. [2] TEIXEIRA, Marco Antnio, Cromatografia Gs-Lquido: princpios e aplicaes, pginas 1 a 3. [3] SHINER, Ralph. L; FUSON, Reynold C.; CURTIN, David Y; MORRILL, Terence C.; Identificao Sistemtica dos Compostos Orgnicos Manual do Laboratrio; Editora Guanabara Dois S.A., 6 Ed., Rio de Janeiro, 1983, pginas 331 a 343.

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QUESTIONRIO
1)

Consulte na literatura as estruturas do caroteno e das clorofilas? As estruturas do -Caroteno e das clorofilas so

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2)

Considerando que os carotenos apresentam cores prximas do amarelo enquanto as clorofilas so verdes, avalie as polaridades das misturas obtidas e identifique o contedo das mesmas. Como o caroteno foi extraido com hexano, e este por sua vez um solvente apolar, o beta caroteno apolar. J a clorofila foi extraida com a acetona, e sendo este um solvente polar, conclui-se que as clorofilas so polares.

3) Correlacione a polaridade com a estrutura qumica dos componentes da mistura. As clorofilas possuem 40 carbonos, sendo 2 ciclos de 6 e 11 duplas ligaes conjugadas. Isso confere molcular um carter apolar. J as clorofilas possuem quelatos de magnsio, cetonas, estres, aldedos e cidos carboxlicos que confere molcula um carter polar. 4) Um aluno leu rapidamente o procedimento experimental e comeou esta prtica, no entanto, ao invs de utilizar inicialmente o hexano ele confundiu e comeou a coluna com acetona. Discute o que voc acha desta troca de eluentes. A troca de eluentes no ir separar as substncias e ambas sero arrastadas pelo solvente. Isso ocorre poque a substncia menos polar menor adsorvida, logo a tendncia esta ser arrastada pelo solvente, mesmo a substncia sendo apolar.

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Enquanto que, apesar da clorofila ser mais adsorvida, neste caso, esta competio favorece o eluente, logo esta tambm ser arrastada. Suponha que voc tenha uma mistura de trs substncias orgnicas, sendo todas slidas: um lcool, um hidrocarboneto saturado e uma cetona. Proponha uma separao cromatogrfica destas substncias utilizando slica-gel como adsorvente e os eluentes que achar necessrio. Tendo em vista que a ordem de polaridades destas trs substncias : Hidrocarboneto < acetona < lcool No caso de ser usada a cromatografia em coluna com slica gel, o lcool ser mais adsorvido e o hidrocarboneto ser menos adsorvido. Sendo assim, deve-se proceder a eluio primeiramente com hexano, que sendo um solvente apolar, conseguir interagir e arrastar o hidrocarboneto. Em seguida, a eluio deve ser com ter dietlico que um composto no to polar. Isso far com que haja a extrao da cetona. Por fim, a eluio dever ser feita com etanol, pois este um solvente bastante polar e conseguir competir mais eficientemente com o adsorvente pelo substrato e o lcool ser extrado. Faa uma pesquisa sobre os adsorventes que podem ser utilizados em mtodos de separao por cromatografia em coluna, mostrando qual a diferena entre eles. Alguns dos adsorventes que podem ser usados na cromatografia em coluna so os seguintes: Adsorvente Negro de Fumo Silicato de Magnsio Alumina (Al2O3) Slica-Gel Sulfato de Clcio Acar Celulosa em p Comentrioa Considerado fraco no caso de compostos com interaes do tipo ligao de hidrognio Usado comumente no caso de compostos estveis Usado comumente, especialmente no caso de compostos orgnicos mais sensveis. Adsorvente muito fraco.
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5)

6)

Estes adsorvente foram listados em ordem do poder do poder da adsoro. A alumina e a slica-gel so os usados mais habitualmente. Entretanto, adsorventes de fase invertida tambm existem no mercado. Logo, com estes adsorventes, os componentes mais polares da amostra so eludos mais rapidamente. J a alumina usada comercialmente pode ser cida, bsica ou neutra. Sendo que, a alumina cida til na separao de cidos carboxlicos e aminocidos; a bsica utilizada para a separao de aminas.

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