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Recife - 2009
INTRODUÇÃO
HISTÓRICO
PRINCÍPIOS
Na
ka =
Nn
C1
kp =
C2
Amido de batata - O amido pode reter até 35% de água e constitui um bom suporte
para uma fase estacionária. Entretanto, não possui uma grande capacidade de separação,
mas o emprego de colunas grandes, permite a preparação de quantidades relativamente
grandes. Os fenômenos de adsorção são de certa forma, intensos, quando as colunas são
utilizadas para separar diferentes substâncias (por exemplo, misturas simples de
aminoácidos), observa-se que a adsorção é praticamente o único fenômeno envolvido.
Celulose - Nas colunas por partição a celulose é bastante utilizada, sobretudo sob a
forma de pós. A celulose é um suporte hidrofílico, porém , existe a possibilidade de
preparação de celuloses hidrofóbicas para a cromatografia de fase inversa.
A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer
menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições
para sua utilização em termos analíticos.
Este é um método de extensão da cromatografia de partição sobre colunas de
celulose, idealizado por CONSDEN, GORDON e MARTIN. Podemos considerar que o
papel constitui um suporte inerte, que retém uma fase estacionária aquosa. A partição é
efetuada entre a fase aquosa fixa e a fase orgânica móvel
A aparição de novas técnicas utilizando papéis como trocadores de íons,
de celuloses hidrofóbicas, de celuloses adsorventes, transformou este método em uma
técnica universal de micro-análise.
Na cromatografia de papel, empregam-se quantidades de amostra na
ordem de microgramas ou miligramas. A resolução depende da concentração e do
diâmetro da mancha aplicada. As substâncias hidrofílicas são separadas com facilidade,
enquanto as hidrofóbicas requerem tratamento especial do papel. As fases móveis
devem estar saturadas com água. Utilizam-se cubas vedadas e de preferência com
saturação do solvente antes do início da separação cromatográfica. O desenvolvimento
pode ser ascendente, descendente, circular ou horizontal.
Fase móvel - A fase móvel em cromatografia sobre papel é variável e possui maior
efeito nas separações dos componentes de uma mistura. Considerando um par de
líquidos, o menos polar funciona como fase móvel e o mais polar, como fase
estacionária.
CROMATOGRAFIA CIRCULAR
O papel é recortado em forma de um círculo. No centro deste é feito um pequeno
orifício. As substâncias são colocadas sobre uma circunferência em torno do centro. O
círculo de papel é então colocado em uma cuba circular, o solvente é derramado a partir
da parte inferior da cuba e conduzido por capilaridade até a porção central do papel. As
substâncias se apresentam ao final da migração como arcos em torno do centro.
Papéis simples - Os primeiros ensaios foram conduzidos sobre papéis de filtro comuns.
Porém a sua qualidade era inadequada, levando à necessidade de preparação de papéis
especiais, que conduzissem a resultados reproduzíveis, sendo necessário uma certa
regularização na sua fabricação e os papéis deviam apresentar um certo grau de pureza.
Atualmente, os diferentes papéis se destacam pela sua eficiência, sua durabilidade e
pelo seu grau de pureza.
Papéis especiais - São papéis com propriedades adsorventes. Eles foram criados para
adaptar as vantagens da cromatografia de papel à cromatografia de adsorção. Para tal,
fixa-se sobre o papel (entre as fibras de celulose) uma substância dotada de
propriedades adsorventes, principalmente a alumina e a sílica.
REVELAÇÃO
Quando está terminada a migração do solvente, é conveniente que o
cromatograma seja submetido a um tratamento, de forma a colocar em evidência as
substâncias separadas. A revelação não apenas torna visíveis as substâncias incolores,
mas também facilita a identificação destas substâncias. Isto é possível pela pulverização
de reativos específicos ou de procedimentos físicos convenientes.
TÉCNICA:
CÁLCULO DO Rf:
VANTAGENS DESVANTAGEM
- Optimização fácil e rápida - Difícil reprodutibilidade do Rf
- Duração curta de desenvolvimento da placa
- O adsorvente pode suportar a ação enérgica
do revelador
- Separações mais claras
- Utilização de quantidades muito pequenas
- Vasto domínio de aplicação
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA CENTRÍFUGA
OS REVELADORES
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
CLAE analítica
CLAE preparativa
CL baixa pressão
CL “flash”
CL média pressão
+ + + +
µg 1 mg 10 mg 100mg 1g
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO
O termo gel, refere-se a um material elástico que contém água. Este possui uma
estrutura tridimensional, cuja estabilidade mecânica é dada pelo material contendo
espaços (poros) que contém líquido. Partículas pequenas dão melhor resolução e
eficiência. O aumento do tamanho das partículas resulta em espalhamento da zona nos
interior dos poros. O gel quimicamente definido, deve permitir variações para o
fracionamento em diferentes intervalos de massa molecular.
TIPOS DE GÉIS
Géis de ágar e agarose - As propriedades cromatográficas do ágar fazem com que estes
géis sejam compmplementares aos géis de sephadex e poliacrilamida. O ágar é obtido
de algas e se constitui de polissacarídeos lineares de lactose e dioxi-L-galactose.
Considera-se que o tamanho dos poros e a estabilidade dos géis de ágar sejam
conseqüência da formação de microcristais.
Tamanho da amostra
Para uma boa resolução, a zona em que está a amostra deve ser pequena em
relação ao comprimento da coluna (1 a 5% do tamanho da coluna) e possuir uma baixa
viscosidade, para não ocasionar uma vazão irregular entre as zonas do gel.
FASE MÓVEL
O sucesso do processo cromatográfico, depende, entre outras coisas, do
comportamento dos solutos e das características destes e da fase móvel dentro da
coluna. Durante uma separação cromatográfica, a concentração das substâncias
separadas, pode ser determinada no líquido por diferentes métodos. Pela retenção do
soluto na fase estacionária, cada zona se movimenta com uma velocidadde característica
. O eluente deve apresentar uma relação de viscosidades em relação ao soluto de até
duas vezes. As soluções tampão são normalmente os eluentes de escolha pra
cromatografia por exclusão.
• Purificação de proteínas
• Purificação de antibióticos (caldos . de fermentação)
• CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE
MÉTODOS DE ELUICÃO
A eluição do material ligado à fese estacionária é realizada tanto com agentes
específicos como com agentes não específicos.
A utilização de agentes de eluição específicos é baseada na ligação preferencial
dessa substância com o agente específico ao invés da fase estacionária. Geralmente os
agentes de eluição específicos possuem estrutura química semelhante ao ligante da fase
estacionária.
Na utilização de agentes de eluição não específicos há a formação de
complexos entre a substância alvo com o ligante específico, o que envolve ligações
fracas como interações eletrostáticas e hidrofóbicas, ou pontes de hidrogênio isoladas ou
em conjunto, onde a variação do pH e/ou força iônica do tampão são os recursos
utilizados para provocar alterações no complexo formado ou modificam e estrutura
química deste.
APLICAÇÕES
A cromatografia de bioafinidade é aplicada para a purificação de enzimas como
a catalase e a celulase, antibióticos, antíigenos, ácidos nucléicos, drogas ou receptores
hormonais, e pequenas moléculas como peptídeos sintéticos e naturais.