Separação de compostos orgânicos: extração da

7 cafeína do chá, análise qualitativa por TLC e

análise quantitativa por espectrofotometria

I. Objetivos
 Conhecer técnicas de separação de substâncias;
 Conhecer as propriedades dos compostos e utilizá-las para a sua purificação;
 Compreender a técnica de extração líquido-líquido;
 Aplicar técnicas de cromatografia em camada fina na identificação de substâncias;
 Conhecer o conceito de reta de calibração;
 Dosear a cafeína por espectrofotometria.

I. Introdução
Muitas substâncias orgânicas são obtidas a partir de produtos naturais, sendo necessário extraí-las e
purificá-las. A extração é a técnica mais usada quando se pretende isolar um produto natural das
substâncias em que aparece na natureza.

A extração líquido-líquido é uma operação básica de separação de compostos com diferentes

características de solubilidade face a solventes orgânicos e aquosos imiscíveis entre si. Assim, é possível
isolar os dois componentes de uma mistura, A e B, em que A é muito solúvel em água e pouco solúvel
num solvente orgânico imiscível com a água, ao passo que B tem o comportamento exatamente oposto.
Colocando um sistema de dois solventes imiscíveis, como água e clorofórmio, por exemplo, em contacto
com a mistura A+B e misturando bem as duas fases (orgânica e aquosa) por agitação vigorosa, poder-se-
á atingir um estado de equilíbrio (equilíbrio de partição líquido-líquido) no qual a maior parte de A se
encontra na fase aquosa e a maior parte de B se encontra na fase orgânica. A repetição do processo
extrativo conduz, em último caso, ao isolamento da totalidade de A, isento de B, na fase aquosa e, do
mesmo modo, à recuperação da totalidade de B, isento de A, na fase orgânica. Deste modo, após simples
eliminação dos solventes, consegue-se obter A e B separados e puros.

Dependendo da solubilidade de cada composto, quando se agita uma solução aquosa de determinado
composto com um solvente orgânico em que o composto é pelo menos razoavelmente solúvel, haverá
distribuição do soluto por ambas as fases. Teremos, portanto, uma concentração (quantidade de soluto
por unidade de volume) do soluto na fase aquosa (C água) e uma concentração de soluto na fase orgânica
(Corg), que é aproximadamente igual às suas solubilidades, Sorg e Ságua, a uma dada temperatura.

À razão entre as concentrações do soluto nos dois solventes em equilíbrio chama-se coeficiente de
distribuição (KD):
Laboratório de Biotecnologia 1
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C org S org
K D= =
C água S água

Neste trabalho, vai isolar-se um composto natural existente em produtos naturais como o chá e o café, o
1,3,7-trimetil-2,6-dioxopurina ou cafeína.

A cafeína existe numa percentagem de 2 a 5% em massa nas folhas do chá. A cafeína é solúvel em água
a ferver, mas muito mais solúvel em clorofórmio, estes serão então os dois solventes a utilizar na
extração.

Juntamente com a cafeína (Fig. 1), extraem-se ácidos tânicos que não nos interessam neste trabalho,
estes compostos formam sais de cálcio insolúveis em água que precipitam e podem ser e removidos por
filtração. Para promover a formação destes sais ir-se-á utilizar carbonato de cálcio.

Fig. 1 Cafeína

Cromatografia em camada fina

A terceira parte deste trabalho será a identificação da cafeína extraída por cromatografia em camada
fina (CCF ou TLC – Thin Layer Cromathography). A CCF é frequentemente usada em química
orgânica para monitorizar o progresso de uma reação ou identificar os componentes de uma mistura. Na
CCF, uma pequena gota do composto a identificar é aplicada próximo da extremidade de uma placa fina
recoberta com uma fase estacionária sólida adsorvente (por exemplo, gel de sílica). A extremidade da
placa é então mergulhada numa câmara contendo uma pequena quantidade do eluente apropriado (fase
móvel), o qual sobe por capilaridade. À medida que o eluente sobe pela placa ( eluição), arrasta consigo
os componentes da mistura a diferentes velocidades, dependendo da tendência de cada componente para
ficar “agarrado” à placa (fase estacionária) ou dissolver no eluente. A velocidade de fluxo de
determinado componente, sob as condições de análise, pode ser traduzida através do parâmetro Rf (rate
of flow ou velocidade de fluxo), que se define como:
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d ( distância percorrida pela mancha desde a linha de aplicação )

Rf =
D ( distância percorrida pelo solvente )
O Rf é característico de determinada substância sob determinadas condições. No entanto, depende
fortemente de parâmetros experimentais como temperatura, humidade atmosférica, condições de
eluição, entre outros, pelo que não é um parâmetro tabelável. Assim, e apesar de ser útil na identificação
de substâncias por comparação com os valores de Rf de compostos padrões conhecidos, tal comparação
só tem significado se for garantida a medição dos R f em condições rigorosamente iguais. Na prática, tal
assegura-se mediante a análise simultânea dos padrões e da mistura em análise, colocados na mesma
placa, que será submetida a um único processo de eluição.

Uma vez efetuada a eluição, será necessário revelar o cromatograma obtido, o que se consegue quer
por métodos químicos (aplicação de reagentes que formem derivados corados com os compostos
impregnados na placa), quer por métodos radioativos (irradiação da placa com luz de comprimento de
onda adequado, para que se possam visualizar as manchas devidas aos compostos). Neste trabalho, a
revelação será feita por irradiação com luz ultravioleta. As placas de CCF usadas têm um indicador
fluorescente (pelo que se apresentam como um fundo brilhante quando irradiadas com luz UV), ao passo
que as manchas correspondentes a compostos aparecerão ou como manhas escuras (absorção total da
radiação incidente) ou como manchas muito brilhantes (absorção da radiação seguida de fluorescência).

Lei de Lambert-Beer

Embora a CCF nos indique a presença ou não de uma substância, não nos permite fazer uma análise
rigorosa. A espectrofotometria é um método instrumental, que nos permite superar essa dificuldade.

Os métodos espectrofotométricos baseiam-se na absorção ou emissão de radiação por parte das

moléculas. Quando a radiação monocromática de comprimento de onda adequado passa através de uma
amostra em solução, a luz emergente terá menor intensidade que a luz incidente. A perda de intensidade
(isto é, a absorvância) está diretamente relacionada com a capacidade que a amostra tem de absorver
radiação de comprimento de onda utilizado, com a concentração da amostra em solução e com a
distância que a radiação tem que atravessar através da solução. Esta relação é traduzida pela lei de
Lambert-Beer, que se representa por:

A=xlxC

onde A é a absorvância,  é a absortividade molar ou coeficiente de extinção molar (a medida da

capacidade da substância para absorver radiação do comprimento de onda considerado. O l representa o
comprimento do caminho ótico ou passo ótico da solução (distância que a radiação atravessa através da
solução) e C representa a concentração da solução na solução analisada. É, pois, evidente a utilidade
desta lei na determinação da concentração de substâncias em amostras desconhecidas, por comparação
com as absorvâncias medidas para soluções-padrão (isto é, de concentração conhecida) da mesma
substância. Tal é conseguido através do uso de radiação de comprimento de onda específico e um par de
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cuvetes iguais de comprimento ótico constante, nas quais serão colocadas as soluções de concentração
conhecida. Nestas condições as duas equações

Aconh= x l x Cconh

Adesc= x l x Cdes

podem se combinar dado que  e l, resultando

Aconh/ Adesc = Cconh/Cdes

Quando as absorvâncias das duas soluções tiverem sido determinadas no espectrofotómetro (Fig. 2), a
concentração da solução desconhecida pode ser calculada.

Fig. 2 Espectrofotómetro

O método mais frequente de análise quantitativa baseia-se na construção de uma curva de calibração,
construída por representação gráfica dos pontos experimentais obtidos por leitura da absorvância de
diversas soluções da substância de interesse com concentrações conhecidas (soluções-padrão). A relação
entre a absorvância e a concentração da substância é linear em condições adequadas (há limites para a
linearidade da Lei da Lambert-Beer), pelo que na maioria das análises espectrofotométricas
quantitativas, os pontos experimentais podem ser ajustados a uma reta, da qual se pode obter, por
intrapolação, o valor da concentração da mesma substância numa amostra desconhecida cuja
absorvância seja determinada nas mesmas condições.
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II. Materiais e reagentes

Materiais e Equipamentos Reagentes

Balança analítica Água destilada

Balão volumétrico 100, 50, 25 mL Cafeína Pura
Bomba de vácuo Carbonato de cálcio
Borracha de adaptação para o funil Clorofórmio
Capilares Chá
Cuvetes quartzo (UV) Acetato de etilo:hexano (1:1)
Espetrofotómetro Hidróxido de cálcio
Gobelés Medicamentos contendo cafeína
Funil de Buchner
Funil de separação
Funil de vidro
Kitasato
Matraz
Papel de filtro
Pipetas de Pasteur
Placa de aquecimento
Placas de sílica gel
Pipetas graduadas
Pompete
Porcelana porosa
Provetas
Régua
Suporte de argola para funis de separação
Suporte para funis
Tina de CCF
Tubos de ensaio
Vidro de relógio

III. Procedimento experimental

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1. Análise da cafeína por cromatografia em cama fina (CCF)

1.1. Preparar a tina cromatográfica, introduzindo uma tira retangular de papel de filtro e
adicionando o eluente (acetato de etilo:hexano 1:1) até que atinja uma altura de 0,5cm no
interior do copo. Tapar a tina.

1.2. Manuseando a placa de CCF com cuidado para não dobrar nem sujar, marcar a lápis uma linha
transversal a cerca de 1cm de uma das extremidades, com o auxílio de uma régua.
1.3. Ainda com a ajuda de uma régua, marcar o número de pontos necessários (cafeína pura e
amostra), equidistantes, sobre a linha desenhada em 1.2, legendando-os.
1.4. Dissolver num tubo de vidro cada amostra com clorofórmio.
1.5. Com o auxílio de um tubo capilar, colocar 3 gotas da solução no ponto respetivo, previamente
marcado e legendado na placa de CCF. Repetir para as outras amostras.
1.6. Colocar cuidadosamente a placa de CCF dentro da tina, mergulhando a extremidade em que se
marcam as amostras no eluente (o nível de eluente deve ser inferior ao da linha marcada a
lápis!). Tapar a tina com a tampa.
1.7. Deixar o eluente subir a placa por capilaridade, até atingir cerca de 1cm da extremidade
superior, altura em que se deve retirar a placa e marcar a lápis a linha de solvente.
1.8. Deixar evaporar o eluente e observar a placa sob a lâmpada de luz UV e contornar as manchas
observadas a lápis.
1.9. Retirar a placa da lâmpada de UV e determinar os valores de Rf para todos as manchas
registadas.

Fig. 1 Esquema CCF.

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2. Análise da cafeína por espetrofotometria

2.1. Preparação da infusão de chá
2.1.1. Pesar 1 g de café e 0,5 g de hidróxido de cálcio para um gobelé e adicionar 50 mL de
água.
2.1.2. Deixar ferver durante 10 minutos.
2.1.3. Deixar arrefecer e filtrar a vácuo.
2.1.4. Passar a solução para um balão volumétrico de 100 mL e perfazer o volume com água
destilada até à marca.
2.1.5. Transferir 10,00 mL da solução para a ampola de decantação.
2.1.6. Adicionar 5 ml de clorofórmio à ampola. Tapar, agitar cuidadosamente, destapar e
aguardar a separação das duas fases.
2.1.7. Recolher a fase mais densa e transferi-la novamente para a ampola de decantação.
Repetir a extração mais duas vezes.
2.1.8. Por fim, recolher a fase mais densa para um balão volumétrico de 20 ml separada por
filtração por gravidade.
2.1.9. Perfazer o volume de 20,00 mL com clorofórmio.
2.2. Construção da curva de calibração
2.2.1. Preparar uma solução padrão de cafeína de concentração 10,00 g/L, por dissolução
rigorosa de 0,5 g de cafeína em 50 mL de clorofórmio.
2.2.2. Preparar 4 soluções em clorofórmio, de 25,00 mL cada, contendo, respetivamente,
0,1mL, 0,2 mL, 0,4 mL e 0,5 mL da solução preparada em 2.2.1 e calcular as respetivas
concentrações em cafeína.
2.2.3. No espetrofotómetro de duplo feixe, medir a absorvância a 273 nm do solvente puro
(branco) e clicar “branco”.
2.2.4. Posteriormente medir a absorvância de cada uma das 4 soluções-padrão preparadas em
2.2.2 Representar os pontos num gráfico de Abs vs. Conc. e traçar a melhor reta
correspondente a esses pontos.
2.3. Determinação da concentração de cafeína no chá
2.3.1. Encher uma cuvete com a solução preparada em 2.1 e medir o valor de absorvância.
2.3.2. Determinar o valor de concentração de cafeína no gráfico de calibração.
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1 Separação de compostos orgânicos: extração da

cafeína do chá, análise qualitativa por TLC e
1 análise quantitativa por espectrofotometria

RELATÓRIO

Autores Turno A Grupo 4 Contacto

1. Ana Freitas 4. Diogo Silva

2. Beatriz Rangel 5. Inês Barbosa

3. Bernardo Oliveira Data da aula: 24 10 2022

I. RESULTADOS
1. Reta de calibração
1.1. Preencha a tabela seguinte com os dados necessários para a construção da reta de calibração.

Tabela 1: Reta de calibração.

Concentração Absorvância ( = 273 nm)

Branco 0

0,004 0,294

0,008 0,429

0,012 0,443

0,016 0,776
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Reta de Calibração- solução padrão de
cafeína
0.9
0.8
1.2. Apresente o gráfico da reta de calibração.
0.7 f(x) = 46.5416666666667 x
0.6 R² = 0.97271857788023

Absorvância
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016 0.018
Concentração de cafeína, g/L

1.3. Determinação da quantidade de cafeína na amostra.

Tabela 2: Quantidade de cafeína na amostra

Concentração de cafeína na Concentração de cafeína na

Amostra Absorvância
solução diluída (g/mL) amostra (g/mL)

−6 −3
1 0,294 4,0 × 10 1,0 ×10
−6 −3
2 0,429 8,0 ×10 1,0 ×10
−5 −3
3 0,443 1,2 ×10 1,0 ×10
−5 −3
4 0,776 1,6 ×10 1,0 ×10
Comprimid
2,449
o

Chá 2,804
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1.4. Apresente todos os cálculos realizados na alínea 1.3.

 Concentração de cafeína:
- Nas amostras de 1 a 4 :
c = 1 g/L ; 1 mL = 1,0 x 10-3 L

1g 1L

x 1,0 x 10-3 L

x=1,0 ×10−3 g /mL

- Na amostra do comprimido:

- Na amostra do chá:

 Concentração de cafeína na solução diluída:

- Na amostra 1:
ci= 1g/L = 1,0 x 10-3 (cálculos feitos anteriormente)
Vf = 25 mL
Vi = 0,1 mL
cf = ?
ci x Vi = cf x Vf
−3
⇔ 1,0× 10 ×0,1=c f ×25
0.0001
⇔ cf = =4,0× 10−6 g/mL
25
- Na amostra 2:
ci= 1g/L = 1,0 x 10-3 (cálculos feitos anteriormente)
Vf = 25 mL
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Vi = 0,2 mL
cf = ?
ci x Vi = cf x Vf
−3
⇔ 1,0× 10 ×0,2=c f ×25
0.0002 −6
⇔ cf = =8,0 × 10 g /mL
25

- Na amostra 3:
ci= 1g/L = 1,0 x 10-3 (cálculos feitos anteriormente)
Vf = 25 mL
Vi = 0,3 mL
cf = ?
ci x Vi = cf x Vf

⇔ 1,0× 10−3 ×0,3=c f ×25

0.0003 −5
⇔ cf = =1,2 ×10 g /mL
25

- Na amostra 4:
ci= 1g/L = 1,0 x 10-3 (cálculos feitos anteriormente)
Vf = 25 mL
Vi = 0,4 mL
cf = ?
ci x Vi = cf x Vf

⇔ 1,0× 10−3 ×0,4=c f × 25

0.0004
⇔ cf = =1,6 ×10−5 g/mL
25

- Na amostra do comprimido:

- Na amostra do chá:
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2. Cromatografia em camada fina. Faça o esquema da placa obtido e calcule os

respetivos Rf:

Nota: A figura não está á escala

- Legenda:

- Cálculo do Rf:

d ( distância percorrida pela mancha desde a linha de aplicação )

Rf =
D ( distância percorrida pelo solvente )
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0,50
. Cafeína: Rf= =0,095
5,25

0,75
. Comprimido: R f = =0,143
5,25

0,70
. Chá: Rf= =0,13( 3)
5,25

II. DISCUSSÃO/CONCLUSÃO
A atividade laboratorial a que esse relatório se refere, tinha os objetivos de: Compreender a técnica de
separação de substâncias nesse caso sendo a separação liquido-liquido, Conhecer as propriedades dos
compostos e utiliza-las para sua purificação, Aplicar técnicas de cromatografia em camada fina (TLC)
na identificação de substancias, Conhecer o conceito de reta de calibração e por fim Dosear a cafeína
por espectrofotometria. Para essa experiencia foi realizado dois tipos de análise uma sendo
quantitativa(Espectrofotometria),que permite realizar uma contagem da substância em estudo
podendo ela ser sobre sua concentração ou outras características numéricas da substancia e a outra
qualitativa(TLC), que permite fazer uma analise se a substância em estudo está presente na amostra
ou não.

Outro conceito muito importante de se compreender, que será utilizado em ambas as partes da
experiencia é a solubilidade da cafeína, sabemos devido a diversas bebidas do dia a dia que a cafeína,
substancia em estudo, é solúvel em água, porém para isolar adequadamente a cafeína de outas
substancias dissolvidas no meio líquido é preciso de outra substância sendo ela um solvente orgânico
não miscível com água, nesse caso foi usado o clorofórmio, mas poderia ser usado o diclorometano,
que também é toxico como o clorofórmio ou como é mais utilizado hoje em dia o 1-propanol. Assim
isolando a cafeína nesse outro solvente que se encontra em uma faze abaixo da água, devido a sua
maior densidade e por ser apolar e a água polar, portanto não se misturam.

Para a primeira parte da experiencia em que foi realizado a Cromatografia em camada fina (TLC)
foram preparadas 3 soluções com cafeína sendo a primeira (0,1117 ± 0,0001)g de cafeína pura
dissolvidos em (3,00 ± erro da pipeta)ml de Clorofórmio, na segunda(0,1113 ± 0,0001)g de
medicamento para gripe dissolvidos em (3,00 ± erro da pipeta)ml de Clorofórmio e na terceira (x ±
erro da pipeta)ml de Chá Preto com (3,00 ± erro da pipeta)ml de Clorofórmio. Com auxilio de um
capilar foram colocados uma gota de cada amostra na placa de gel de sílica(faze estacionaria),
previamente preparada com as marcações necessárias. Para finalizar a preparação é preciso colocar a
placa em um recipiente fechado (Tina)de forma vertical, com aproximadamente 0,5cm de acetato de
etilo:hexano 1:1(faze móvel), para que esse eleunte possa correr pela placa por meio da capilaridade.
Após o eluente correr pela placa é necessário levar a placa sobe uma luz UV, visto que a cafeína
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dissolvida em clorofórmio possui um aspeto incolor, mas quando visto na luz UV é possível de ver o
quanto os 3 compostos colocados na placa correram devido a sua fluorescência e assim são feitas as
marcações na placa para que o valor de Rf seja calculado.

A Velocidade de Fluxo (Rf) é um valor característico de cada solução em condições experimentais

especificas. Esse valor pode ser usado para a identificação de substâncias, comparando os valores de
Rf de compostos padrões conhecidos, mas esses valores só podem ser considerados válidos se as
condições de medição do Rf forem iguais. Esse valor pode ser encontrado a partir da formula:

Na segunda parte da atividade laboratorial, para a construção da reta de calibração foi preciso realizar

uma análise quantitativa por espectrofotometria, que consistiu na preparação de 300ml de Chá Preto
utilizando 2 saquinhos, por infusão. O chá após estar pronto foi transferido para uma ampola de
decantação com clorofórmio e agitado bastante e colocado em repouso até que as duas fazes da
solução estivesse bem separadas. Foi retirado da ampola a parte mais densa da substância e realizado
4 diluições em balões volumétricos de 50ml. No primeiro balão foram adicionados (0,1 ± erro da
pipeta)ml da solução preparada com o chá e adicionado clorofórmio até completar aproximadamente
25ml, no segundo foram adicionados (0,2 ± erro da pipeta)ml da solução preparada com o chá e
adicionado clorofórmio até completar aproximadamente 25ml, no terceiro foram adicionados (0,3 ±
erro da pipeta)ml da solução preparada com o chá e adicionado clorofórmio até completar
aproximadamente 25ml, no ultimo foram adicionados (0,4 ± erro da pipeta)ml da solução preparada
com o chá e adicionado clorofórmio até completar aproximadamente 25ml.

Por fim, essas diluições foram transferidas para cuvete de quartzo, já que as de plástico interferem em
medições feitas no espectro UV e como dito anteriormente a solução de cafeina com clorofórmio é
incolor, portanto a medição tem de ser feita no espectro UV a 273nm no Espectrofotómetro, que por
sua vez é um equipamento capaz de medir a quantidade de radiação absorvida ou transmitida por
determinada substância. Esse equipamento é composto por uma fonte de luz, um monocromador, o
suporte em que é colocado o objeto de estudo e o detetor, essas medições são feitas tendo como base
a lei de Lambert-Beer representada abaixo:

A partir dessa lei é possível calcular a absorvância e a concentração de uma substância, com esses
cálculos também podem ser construídos gráficos de Absorvância por Concentração, em que A=logI0\

I e gráficos de Transmitância por Concentração em que T=I/I0.

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III. QUESTÕES

1. Porque é que o clorofórmio fica sempre na camada inferior quando comparado com a água?

Quando o clorofórmio e a água são adicionados na mesma solução é possível verificar que são
imiscíveis entre si, apresentando duas fases distintas. O clorofórmio, mantém-se na camada inferior e
a água fica na camada superior. Isto acontece devido a duas propriedades físicas: à polaridade (ter
cargas negativas ou positivas) e à densidade (concentração de uma massa num determinado volume).

Para duas substâncias se misturarem é necessário que as suas moléculas tenham a mesma natureza
(polares ou apolares). As moléculas de clorofórmio são apolares ao contrário das moléculas de água
são polares e por esta razão estas duas substâncias não se misturam.

O clorofórmio e a água apresentam densidades diferentes, 1,49 g/cm 3 e 1,00 g/cm3, respetivamente.
Como o clorofórmio apresenta maior densidade do que a água fica sempre na camada inferior e a
água na camada superior.

2. Qual a diferença entre curva de calibração e reta de calibração?

A curva de calibração representa todos os pontos do gráfico que estabelecem a relação entre os dois
eixos: a absorvância (eixo dos Y) e a concentração (eixo dos X). Num gráfico esta representação
traduz a influência da variável X com o resultado Y. Já a reta de calibração é um método estatístico
utilizado para determinar, de forma precisa, uma linearidade nessa curva. Parte-se do princípio que
existe uma relação de proporcionalidade direta entre a absorvância e a concentração. Quanto maior a
concentração maior será a absorvância, logo é possível estimar os valores que apresentem linearidade
dentro da curva, o que facilita a determinação de concentrações.

Normalmente os pontos da curva de calibração não estão dispostos exatamente sobre a reta de
calibração o que se traduz consequentemente num pequeno erro associado aos valores de X e Y.

3. O que entende por branco?

O branco funciona como uma solução de referência que possibilita o estudo das variáveis de uma
amostra. Um padrão branco contém apenas o solvente da solução. Assim, o espetrofotómetro
identifica o seu valor e quando posteriormente são introduzidas soluções com a amostra em estudo o
aparelho remove o valor inicial do branco e apenas fornece os valores das variáveis da amostra. Desta
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maneira é possível eliminar interferências nos valores por parte de outras substâncias que não a
amostra desejada.

O branco também é extremamente importante por servir também como termo comparativo das
amostras, como se fosse um “tubo de controlo”.

A solução de clorofórmio foi considerada o branco desta atividade laboratorial permitindo fazer
comparações entre as amostras que continham cafeína e retirar as respetivas conclusões.

Declaro que sou responsável pela informação contida neste relatório:

(Assinatura dos alunos)

Ana Freitas

Beatriz Rangel

Bernardo Oliveira

Diogo Silva

Inês Barbosa