Instituto Federal de Educação,

Ciência e Tecnologia do Maranhão

Campus São Luís - Monte Castelo
Departamento de Química

LANNA KARINNY SILVA

DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE MICROEXTRAÇÃO

LÍQUIDO-LÍQUIDO COM SOLIDIFICAÇÃO DE GOTA
ORGÂNICA FLUTUANTE (DLLME-SFOD) PARA ANÁLISE
DE ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDES (NSAID) EM
ÁGUAS SUPERFICIAIS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA PERFORMANCE

DEVELOPMENT OF LIQUID-LIQUID
MICROEXTRACTION TECHNIQUE WITH
SOLIDIFICATION OF FLOATING ORGANIC DROP
(DLLME-SFOD) FOR ANALYSIS OF NONSTEROIDAL
ANTI-INFLAMMATORY DRUGS (NSAID) IN SURFACE
WATER BY HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY

São Luís, MA
2020
 LANNA KARINNY SILVA

DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE MICROEXTRAÇÃO

LÍQUIDO-LÍQUIDO COM SOLIDIFICAÇÃO DE GOTA
ORGÂNICA FLUTUANTE (DLLME-SFOD) PARA ANÁLISE
DE ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDES (NSAID) EM
ÁGUAS SUPERFICIAIS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA PERFORMANCE
DEVELOPMENT OF LIQUID-LIQUID
MICROEXTRACTION TECHNIQUE WITH
SOLIDIFICATION OF FLOATING ORGANIC DROP
FOR ANALYSIS OF NONSTEROIDAL ANTI-
INFLAMMATORY DRUGS IN SURFACE WATER BY
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Dissertação apresentada ao Instituto Federal
de Educação, Ciência e Tecnologia do
Maranhão, Campus São Luís/Monte Castelo,
como parte dos requisitos exigidos para
obtenção do título de Mestre em Química pelo
Programa de Pós-graduação em Química.

Dissertation presented to the Federal Institute

of Education, Science and Technology of
Maranhao, Campus Sao Luis/Monte Castelo,
in partial fulfillment of the requirement for the
degree of master in Chemistry by the
Postgraduate Program in Chemistry.

Orientador: Prof. Dr. Gilmar Silvério da Silva

São Luís, MA
2020
 Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia do Maranhão
Campus São Luís - Monte Castelo
Departamento de Química

Folha de Aprovação

DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE MICROEXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO

COM SOLIDIFICAÇÃO DE GOTA ORGÂNICA FLUTUANTE (DLLME-SFOD)
PARA ANÁLISE DE ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDES (NSAID) EM
ÁGUAS SUPERFICIAIS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE
DEVELOPMENT OF LIQUID-LIQUID MICROEXTRACTION TECHNIQUE WITH
SOLIDIFICATION OF FLOATING ORGANIC DROP (DLLME-SFOD) FOR
ANALYSIS OF NONSTEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUGS (NSAID) IN
SURFACE WATER BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

São Luís, 09 de junho de 2020.

Dedico este trabalho a minha mãe
 AGRADECIMENTOS

Gostaria de expressar aqui meus agradecimentos a todos aqueles que

direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Agradeço primeiramente a Deus, pela força que me tem dado para
alcançar meus objetivos e nunca desistir diante dos obstáculos.
Ao IFMA, por ter me proporcionado grandes experiências profissionais
como Servidora e por ter possibilitado o desenvolvimento desta pesquisa.
Ao meu Orientador, Professor Gilmar Silvério pela confiança e constante
apoio neste trabalho.
Ao Professor Hilton Rangel, pela constante colaboração, consideração,
parceria e disponibilidade em ajudar no que fosse necessário.
Aos demais Servidores do Departamento Acadêmico de Química, pelo
clima caloroso no ambiente de trabalho e por todo conhecimento que me
repassaram desde quando fui aluna do Ensino Técnico até hoje.
A minha família pelo amor e apoio.
A todos os colegas da turma do Mestrado em Química de 2018 pelo
carinho e amizade.
Aos demais colegas dos laboratórios, os quais colaboraram muito com
sua amizade, conselhos e ajuda sempre que possível. Em especial: Samara Crispim,
Mali Raiol, Marcos Bispo, Reyla Dias, Adriana Ferreira, Carlos Henrique, Jeiza
Freitas e Naldirene Fonseca.
SILVA, Lanna Karinny. Desenvolvimento de Técnica de Microextração Líquido-
Líquido com Solidificação de Gota Orgânica Flutuante (DLLME-SFOD) para
Análise de Anti-Inflamatórios não Esteroides (NSAID) em Águas Superficiais
por Cromatografia Líquida de Alta Performance. 2020. 81f. Dissertação
(Mestrado em Química) – Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do
Maranhão, São Luis, MA. 2020.

RESUMO

Os anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs) são amplamente recomendados por

profissionais da saúde em todo o mundo. A ocorrência deles no meio ambiente,
ainda que em nível de traços, é potencialmente perigosa em razão de sua
toxicicidade e, em alguns casos, capacidade de bioacumulação. Uma metodologia
baseada na microextração líquido-líquido dispersiva com solidificação de gota
orgânica flutuante (DLLME-SFOD) com posterior análise por cromatografia líquida
de alta performance foi desenvolvida e validada para determinar naproxeno (NPX),
diclofenaco de sódio (DCF) e ácido mefenâmico (MFN) em águas superficiais.
Foram avaliados alguns parâmetros que podem influenciar na eficiência de extração,
tais como o tipo e volume dos solventes extrator e dispersor, efeito do pH, modo de
agitação e força iônica. As condições cromatográficas foram as seguintes: fase
móvel ACN/H3PO4 em água (pH 2,24) (60:40% v/v), fluxo 1,2 mL.min-1, 25°C,
detector UV/Vis (256nm [0-7min] e 234nm [7-15 min]) em série com detector de
fluorescência (exc=245 nm e ems=330nm). Todas as soluções estoque foram feitas
em MET. As condições da DLLME-SFOD foram as seguintes: 5mL de amostra (pH
2), 2.5% de NaCl, 150L de dispersor (ACN), 30L de extrator (1-dodecanol) e
agitação por 20s em vórtex. O método otimizado exibiu boa precisão, com desvios
padrão relativos na faixa de 0,37 a 18,67%. Os limites de detecção obtidos variaram
de 0,274 a 0,426g.L-1. As recuperações e os fatores de enriquecimento foram de 75
a 120% e de 126 a 201, respectivamente, mostrando assim elevada capacidade de
concentração dos compostos estudados. O método proposto mostrou-se também de
baixo custo, simples, rápido e compatível ambientalmente, podendo ser aplicado de
forma bem sucedida a amostras de água doce, salgada e potável.

Palavras-chave: Água. NSAID. DLLME-SFOD. Meio ambiente.

SILVA, Lanna Karinny. Development of Liquid-Liquid Microextraction Technique
with Solidification of Floating Organic Drop (DLLME-SFOD) for Analysis of
Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAID) in Surface Water by High
Performance Liquid Chromatography. 2020. 81f. Dissertation (Master in
Chemistry) – Federal Institute of Education, Science and Technology of Maranhao,
Sao Luis, MA. 2020.

ABSTRACT

Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are widely recommended by health

care professionals worldwide. Their occurrence in environment, even in trace levels,
is potentially dangerous due to its toxicity and, in some cases, bioaccumulation
capacity. A methodology based on dispersive liquid-liquid microextraction with
solidification of floating organic droplet (DLLME-SFOD) with subsequent analysis by
high performance liquid chromatography was developed and validated to determine
naproxen (NPX), diclofenac sodium (DCF) and mefenamic acid (MFN) in surface
waters. Some parameters that can influence the extraction efficiency were evaluated,
such as the extraction and disperser solvents type and volume, effect of pH, stirring
mode and ionic strength. The chromatographic conditions were as follows: mobile
phase ACN/H3PO4 in water (pH 2.24) (60:40% v/v), flow rate 1.2 mL.min-1, 25 °C,
UV/Vis detector (256nm [0-7min] e 234nm [7-15 min]) in series with fluorescence
detector (exc = 245 nm and ems = 330nm). All stock solutions were prepared in
MET. The conditions of DLLME-SFOD were as follows: 5mL of sample (pH 2), 2.5%
NaCl, 150L of disperser solvent (ACN), 30L of extraction solvent (1-dodecanol)
and vortex-mixed for 20s. The optimized method exhibited good precision, with
relative standard deviation range of 0.37 to 18.67%. The detection limits were in the
range 0.274 to 0.426g.L-1. The recoveries and enrichment factors were 75 to 120%
and 126 to 201, respectively, showing a high concentration capacity of the studied
compounds. The proposed method showed to be low-cost, simple, fast and
environmentally friendly, and can be successfully applied to samples of fresh, salt
and potable water.

Key words: Water. NSAID. DLLME-SFOD. Environment.

 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Rotas de exposição de fármacos no meio ambiente....................... 19

Figura 2 Linha do tempo dos avanços da DLLME desde sua criação......... 23
Figura 3 Esquema simplificado demonstrando as etapas da DLLME-SFOD 24
Figura 4 Área de coleta no cais da Praia Grande (a) (2°31’47.4”S
44°18’26.3”W), no Rio da Prata (b) (2°28’58.7”S 44°12’13.2”W) e
na residência (c) (2°32’26.9”S 44°16’12.8”W)................................. 36
Figura 5 Cromatograma de solução mista (200g.L-1) dos cinco NSAIDs
utilizando a proposta 1, onde apenas o NPX aparece.................... 42
Figura 6 Cromatogramas de solução mista (200g.L-1) dos cinco NSAIDs
onde nenhum composto aparece.................................................... 43
Figura 7 Comparação do sinal dos NSAIDs (1- NPX; 2- CET; 3- DCF; 4-
IBU e 5-MFN) com soluções preparadas em MET e em mistura
ACN/água (1:1)................................................................................ 44
Figura 8 Comparação do sinal do NPX em solução preparada em MET e
em mistura ACN/água (1:1)............................................................. 45
Figura 9 Comparação dos tempos de análise dos NSAIDs (1- NPX; 2-
CET; 3- DCF; 4-IBU e 5-MFN) em três fluxos diferentes (1,0; 1,1
e 1,2 mL.min-1)............................................................................... 46
Figura 10 Comparação dos cromatogramas dos NSAIDs (1-NPX; 2-CET; 3-
DCF; 4-IBU e 5-MFN) utilizando duas proporções de fase móvel
diferentes......................................................................................... 48
Figura 11 Comparação dos cromatogramas dos NSAIDs (1- NPX; 2-CET;
3-DCF; 4-IBP e 5-MFN) utilizando dois comprimentos de onda
diferentes no detector UV/Vis.......................................................... 49
Figura 12 Cromatograma do NPX (1000 g.L-1) em detector FD nas
condições cromatográficas otimizadas........................................... 51
Figura 13 Cromatograma de uma solução padrão dos quatro NSAIDs (1000
g.L-1) nas condições cromatográficas otimizadas (1-NPX; 2-
DCF; 3-IBU e 4-MFN) em detector UV/Vis...................................... 51
Figura 14 Comparação entre os cromatogramas obtidos pelo uso dos
extratores 1-undecanol e 1-dodecanol em detector UV/Vis........... 53
Figura 15 Comparação entre os cromatogramas obtidos pelo uso dos
extratores 1-undecanol e 1-dodecanol em detector FD.................. 54
Figura 16 Sobreposição dos cromatogramas do 1-dodecanol e de uma
solução mista de NSAIDs (1- NPX; 2- DCF; 3- IBU e 4-MFN) em
detector UV/Vis.............................................................................. 55
Figura 17 Sobreposição dos cromatogramas do 1-dodecanol e do NPX em
detector FD...................................................................................... 55
Figura 18 Efeito do tipo e volume do solvente dispersor................................. 56
Figura 19 Efeito da adição de NaCl na eficiência de extração........................ 58
Figura 20 Seleção do pH................................................................................. 59
Figura 21 Seleção do volume de solvente extrator......................................... 60
Figura 22 Seleção do modo de agitação......................................................... 61
Figura 23 Fluxograma das condições otimizadas da DLLME-SFOD-HPLC-
UV-FD.............................................................................................. 62
Figura 24 Sobreposição dos cromatogramas da água ultrapura fortificada e
não-fortificada com os NSAIDs (5 g.L-1), em detector UV/Vis (1-
NPX; 2- DCF; 3- MFN)................................................................... 65
Figura 25 Sobreposição dos cromatogramas da água ultrapura fortificada e
não-fortificada (5 g.L-1), em detector FD...................................... 65
Figura 26 Sobreposição dos cromatogramas da água salgada fortificada e
não-fortificada com os NSAIDs (5g.L-1), em detector UV/Vis (1-
NPX; 2- DCF; 3- MFN)................................................................... 66
Figura 27 Sobreposição dos cromatogramas da água salgada fortificada e
não-fortificada (5g.L-1), em detector FD)....................................... 66
Figura 28 Sobreposição dos cromatogramas da água doce fortificada e
não-fortificada com os NSAIDs (5g.L-1), em detector UV/Vis (1-
NPX; 2- DCF; 3- MFN).................................................................... 67
Figura 29 Sobreposição dos cromatogramas da água doce fortificada e
não-fortificada (5g.L-1), em detector FD........................................ 67
Figura 30 Sobreposição dos cromatogramas da água potável fortificada e
não-fortificada com os NSAIDs (5g.L-1), em detector UV/Vis (1-
 NPX; 2- DCF; 3- MFN)................................................................... 68
Figura 31 Sobreposição dos cromatogramas da água potável fortificada e
não fortificada (5g.L-1), em detector FD........................................ 68
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Propriedades de alguns NSAIDs...................................................... 21

Tabela 2 Solventes extratores mais utilizados em DLLME-SFOD................... 25
Tabela 3 Critérios de validação segundo a USP, ICH, FDA, ANVISA e
INMETRO.......................................................................................... 29
Tabela 4 Faixas de concentrações utilizadas na construção das curvas
analíticas (HPLC-UV-FD)................................................................... 32
Tabela 5 Resíduos gerados em cada etapa da pesquisa e respectivos
destinos.............................................................................................. 41
Tabela 6 Tempos de retenção dos NSAIDs na proporção de fase móvel 60%
ACN/40% H3PO4 em água (pH 2,24)................................................. 49
Tabela 7 Condições cromatográficas otimizadas para análise simultânea dos
NSAIDs............................................................................................... 50
Tabela 8 Parâmetros das curvas analíticas para os quatro NSAIDs por
HPLC-UV-FD..................................................................................... 52
Tabela 9 Faixas de trabalho, equações, coeficientes de determinação (r2),
limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) dos
NSAIDs............................................................................................... 63
Tabela 10 Valores do efeito matriz (ME) nas amostras reais, em três níveis de
concentração (1,2; 3 e 5 g.L-1) para os NSAIDs.............................. 69
Tabela 11 Recuperações, desvios padrão relativo (DPR) e fatores de pré-
concentração dos NSAIDs em três níveis de concentração (1,2; 3 e
5 g.L-1) nas amostras reais, para dez repetições (N=10)................. 70
Tabela 12 Comparação da DLLME-SFOD com outros métodos de
determinação de NSAIDs................................................................. 72
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACN Acetonitrila
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
COX Enzima ciclo-oxigenase
CET Cetoprofeno
DCF Diclofenaco de sódio
DLLME-SFOD Microextração líquido-líquido dispersiva com solidificação de gota
orgânica flutuante, do inglês Dispersive Liquid-Liquid
Microextraction with Solidification of Floating Organic Drop
ET Etanol
HF-LPME Microextração em fase líquida com fibra oca, do inglês Hollow-
Fiber Liquid-Phase Microextraction
HPA Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
IBU Ibuprofeno
ICH International Conference on Harmonisation
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Industrial
FD Detector de Fluorescência, do inglês Fluorescence Detector.
FP Fator de Pré-concentração
K Fator de Retenção
LD Limite de Detecção
LLE Extração líquido-líquido, do inglês Liquid–Liquid Extraction
LPME Microextração em fase líquida, do inglês Liquid-Phase
Microextraction
LQ Limite de Quantificação
ME Efeito matriz, do inglês Matrix Effect
MET Metanol
MFN Ácido Mefenâmico
RSD Desvio padrão relativo, do inglês Relative Standard Deviation
NPX Naproxeno
NSAID Anti-inflamatório não esteroide, do inglês Nonsteroidal Anti-
Inflammatory Drugs
SDME Microextração em gota suspensa, do inglês Single-Drop
Microextraction
SPE Extração em fase sólida, do inglês Solid-Phase Extraction
SPME Microextração em fase sólida, do inglês Solid-Phase
Microextraction
USP United States Pharmacopeia
UV Detector UV/Vis
exc Comprimento de onda por excitação

sem Comprimento de onda por emissão

 12

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................. 15
2 OBJETIVOS...................................................................................... 17
2.1 OBJETIVO GERAL................................................................................ 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................... 17
3 REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 18
3.1 FÁRMACOS NO MEIO AMBIENTE.................................................................... 18
3.2 ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDES (NSAIDS).................................... 20
3.2.1 Propriedades Físico-Químicas dos NSAIDs...................................... 20
3.3 TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRAS AQUOSAS PARA DETERMINAÇÃO
DE NSAIDS......................................................................................... 22
3.3.1 Microextração Líquido-líquido Dispersiva com Solidificação de
Gota Orgânica Flutuante (DLLME-SFOD)......................................... 23
3.3.1.1 Fatores determinantes na eficiência da DLLME-SFOD..................... 24
3.3.1.1.1 Efeito do tipo e volume do solvente extrator...................................... 24
3.3.1.1.2 Efeito do tipo e volume do solvente dispersor................................... 26
3.3.1.1.3 Efeito da adição de sal...................................................................... 27
3.3.1.1.4 Efeito do pH....................................................................................... 27
3.3.1.1.5 Efeito do modo de agitação............................................................... 27
3.3.2 Técnicas Cromatográficas Aplicadas à Determinação de NSAIDs... 28
3.4 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA.............................................. 28
4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................. 30
4.1 METODOLOGIA ANALÍTICA..................................................................... 30
4.1.1 Padrões Analíticos, Solventes e Reagentes..................................... 30
4.1.2 Preparo das Soluções Estoque e das Soluções de Trabalho........... 30
4.1.3 Equipamento de Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC).............................................................................................. 30
4.1.4 Definição das Condições Cromatográficas....................................... 31
4.1.5 Construção das Curvas Analíticas.................................................... 32
4.2 VERIFICAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ESTOQUE..................... 32
4.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE MICROEXTRAÇÃO................................ 33
4.3.1 Seleção do Solvente Extrator............................................................ 33
 13

4.3.2 Seleção do Tipo e Volume do Solvente Dispersor............................ 33

4.3.3 Efeito da Adição de Sal..................................................................... 33
4.3.4 Efeito do pH....................................................................................... 34
4.3.5 Seleção do Volume do Extrator......................................................... 34
4.3.6 Seleção do Modo de Agitação.......................................................... 35
4.4 ÁREA DE ESTUDO............................................................................... 35
4.5 PERFORMANCE ANALÍTICA................................................................... 37
4.5.1 Seletividade...................................................................................... 37
4.5.2 Linearidade e Coeficiente de Determinação (r2).............................. 37
4.5.3 Limites de Detecção (LD) e de Quantificação (LQ).......................... 38
4.5.4 Precisão............................................................................................ 38
4.5.5 Exatidão............................................................................................ 39
4.6 APLICABILIDADE DA METODOLOGIA DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD EM

AMOSTRAS REAIS E AVALIAÇÃO DO EFEITO MATRIZ.............................. 39

4.7 GERENCIAMENTO DOS RESÍDUOS......................................................... 40
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................ 42
5.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS................................ 42
5.1.1 Escolha do Melhor Solvente para as Soluções Estoque e de
Trabalho............................................................................................. 44
5.1.2 Otimização do Fluxo da Fase Móvel................................................ 45
5.1.3 Otimização da Separação dos Compostos....................................... 47
5.1.4 Condições Finais de Análise............................................................. 50
5.2 CURVAS ANALÍTICAS PARA OS NSAIDS USANDO HPLC-UV-FD............ 52
5.3 OTIMIZAÇÃO DA DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD.................................... 52
5.3.1 Seleção do Solvente Extrator............................................................ 53
5.3.2 Seleção do Tipo e Volume do Solvente Dispersor............................ 56
5.3.3 Avaliação do Efeito Salting out ......................................................... 57
5.3.4 Seleção do pH................................................................................... 59
5.3.5 Seleção do Volume do Extrator......................................................... 60
5.3.6 Seleção do Modo de Agitação........................................................... 61
5.3.7 Condições Otimizadas da DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD.................. 62
5.4 PERFORMANCE ANALÍTICA DA DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD............... 63
5.5 ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ESTOQUE.............................................. 64
 14

5.6 APLICAÇÃO EM AMOSTRAS REAIS E EFEITO MATRIZ............................... 64

5.7 COMPARAÇÃO COM OUTROS MÉTODOS................................................ 71
6 CONCLUSÃO.................................................................................... 73
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 74
 15

1 INTRODUÇÃO

Substâncias de origem farmacêutica presentes em ambientes aquáticos

estão entre os contaminantes emergentes que mais têm gerado preocupação no
meio científico e por isso têm sido bastante estudadas. Uma classe desses
compostos que merece destaque é a dos anti-inflamatórios não esteroides
(NSAIDs), os quais são amplamente recomendados por profissionais da saúde em
todo o mundo. Eles costumam ser utilizados principalmente no tratamento da
inflamação, dor e edema, osteoartrites, artrite reumatoide e distúrbios
musculoesqueléticos (BATLOUNI, 2010; TOLEDO-NEIRA; ÁLVAREZ-LUEJE, 2015).
Essa classe não se restringe ao uso em humanos, mas também possui aplicações
veterinárias, podendo ser introduzida em ambientes naturais aquáticos nas suas
formas metabolizada ou inalterada através dos esgotos domésticos (BELDEAN-
GALEA et al.; SHUKRI et al., 2015).
A ocorrência dos NSAIDs no meio ambiente, ainda que em nível de traços, é
potencialmente perigosa em razão de sua toxicidade e, em alguns casos,
capacidade de bioacumulação. Por exemplo, foi reportada a presença dos anti-
inflamatórios diclofenaco (DCF), ibuprofeno (IBU), naproxeno (NPX) e cetoprofeno
(CET) em plasma sanguíneo de trutas expostas a efluentes (TOURAUD et al., 2011).
Em outro caso, peixes da espécie Gasterosteus aculeatus, conhecido como peixe-
espinho, sofreram mudanças histológicas após serem expostos a faixas de
concentração de g.L-1 de DCF (NASLUND et al.,2017). Outro estudo demostrou
ainda que determinada espécie de molusco marinho apresentou alterações
imunológicas significativas ao ser exposta por sete dias ao IBU. Assim, a
determinação desses compostos em amostras ambientais, principalmente água, é
de grande importância (MATOZZO; ROVA; MARIN, 2012).
Porém, para avaliar a ocorrência desses fármacos em água são necessários
métodos analíticos muito eficientes e precisos, porque suas concentrações são
geralmente muito baixas. Então, para contornar esse problema, incorpora-se ao
procedimento analítico uma etapa de concentração antes da análise pelos métodos
cromatográficos convencionais (CALDAS et al., 2016).
Visto serem frequentes as discussões acerca de questões ambientais, tem-
se buscado técnicas de preparo de amostras que além de fornecer procedimentos
simples e rápidos, tenham um baixo consumo de solventes. A extração líquido-
 16

líquido (LLE) e a extração em fase sólida (SPE) são muito utilizadas para
determinação de fármacos em diversas matrizes. Contudo, essas técnicas fazem
uso de quantidades consideráveis de solventes orgânicos. A microextração em fase
sólida (SPME), quando utilizada em associação com métodos cromatográficos,
otimizam as análises de NSAIDs em amostras líquidas, mas possui como
desvantagem o alto custo e a limitada vida útil dos seus aparatos. Para superar
essas desvantagens, foram desenvolvidas técnicas de microextração em fase líquida
(LPME), baseadas num sistema ternário formado entre a amostra aquosa, o solvente
dispersor e o solvente extrator. Um tipo especial e relativamente novo de LPME, a
microextração líquido-líquido dispersiva com solidificação de gota orgânica flutuante
(DLLME-SFOD), surgiu para superar as dificuldades da microextração usando
solventes orgânicos ou líquidos iônicos. Era difícil a retirada do extrator, contendo o
analito, do fundo do recipiente sem resquícios de amostra, por isso a DLLME-SFOD
se tornou uma técnica atraente para extração de NSAIDs em água, já que utiliza
solventes que flutuam na superfície aquosa e que após resfriados podem ser
facilmente retirados e destinados à análise cromatográfica (BELDEAN-GALEA et al.,
2015).
No presente trabalho, foi desenvolvida e validada uma metodologia baseada
na microextração líquido-líquido dispersiva com solidificação de gota orgânica
flutuante, com posterior análise por cromatografia líquida de alta performance, para
determinar anti-inflamatórios não esteroides em águas superficiais. Em razão do
extenso uso terapêutico, foram escolhidos para esta pesquisa o NPX, DCF e MFN.
Para obter um maior rendimento possível, foram avaliados alguns parâmetros que
podem influenciar a eficiência de extração, tais como o tipo e volume dos solventes
extrator e dispersor, efeito do pH, modo de agitação e da força iônica.
 17

2 OBJETIVOS
2.1 GERAL

Desenvolver uma metodologia baseada na técnica de microextração

líquido-líquido dispersiva com solidificação de gota orgânica flutuante (DLLME-
SFOD) para determinação de anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs) em
amostras de águas superficiais.

2.2 ESPECÍFICOS

a) Desenvolver uma metodologia baseada na técnica de DLLME-

SFOD para extração dos anti-inflamatórios NPX, CET, IBU, DCF e
MFN de amostras aquosas, com posterior análise por cromatografia
em fase líquida;

b) Otimizar a metodologia desenvolvida a fim de definir parâmetros

operacionais mais eficientes (condições cromatográficas da análise,
tipo e volume dos solventes extrator e dispersor, efeito do pH, da
força iônica e modo de agitação);

c) Validar a metodologia analítica em amostras de água fluvial,

salgada e potável.
 18

3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 FÁRMACOS NO MEIO AMBIENTE

Os fármacos são classificados como poluentes emergentes e, em virtude do

constante uso em humanos e animais, frequentemente são detectados no meio
ambiente (ASCAR et al., 2013). Entre as décadas de 1980 e 1990, a questão da
presença de produtos farmacêuticos e de higiene pessoal em amostras ambientais
foi muito explorada e desde então muitos outros estudos têm sido publicados sobre
a ocorrência, destinação, comportamento, distribuição e toxicidade em matrizes
como água, efluentes, lodo de estações de tratamento de esgotos, solo e sedimento.
Entre as classes de fármacos mais investigadas estão os antibióticos, anti-
inflamatórios, analgésicos, anti-convulsionantes e ansiolíticos, devido à frequência
de consumo. Na relação dos compostos mais estudados, podem-se citar os NSAIDs
diclofenaco, ibuprofeno e cetoprofeno; o anti-convulsionante carbamazepina; os
antibióticos sulfametoxazol, trimetoprima e roxitromicina; e o analgésico fenazona
(TOURAUD et al., 2011; YIN et al., 2017). Esses compostos, tanto na condição de
metabólitos como em sua forma inalterada, podem alcançar ambientes aquáticos de
diversos modos, tais como durante sua produção, através do descarte de
medicamentos não utilizados e por resíduos domésticos e hospitalares.
Consequentemente, os organismos aquáticos acabam ficando expostos de forma
contínua a uma complexa mistura de fármacos, com toxicidade mais elevada que
cada composto individualmente. (TOURAUD et al., 2011; BELDEAN-GALEA et al.,
2015; ALINEZHAD et al., 2018).
As concentrações de medicamentos encontradas no meio ambiente variam
muito em função da localização temporal e geográfica. O perfil de consumo muda de
uma região para outra e depende também da densidade populacional da área em
estudo. Podem ocorrer também variações em decorrência de condições climáticas,
ou seja, mudanças significativas podem ser observadas em função de se estar no
período seco ou chuvoso (TOURAUD et al., 2011).
A grande preocupação em torno dos agentes terapêuticos como
contaminantes são seus efeitos. Pode-se citar, entre outros, o efeito nocivo causado
por anti-inflamatórios aos organismos aquáticos (TOURAUD et al., 2011), o aumento
da resistência bacteriana devido à presença de antibióticos no meio ambiente
(MARTI, VARIATZA E BALCAZAR, 2014) e a ação citotóxica de quimioterápicos
 19

(SOUZA, REICHERT e MARTINS, 2018). Além disso, é preciso considerar que

esses compostos não aparecem sozinhos no meio ambiente e sim como complexas
misturas, às quais podem gerar efeitos sinérgicos indesejados e ainda não
plenamente conhecidos (PETRIE, BARDEN e KASPRZYK-HORDERN, 2015).
Embora seja muito preocupante a suscetibilidade de espécies aquáticas aos
fármacos, os pesquisadores também estão bastante focados nos riscos à saúde
humana associados ao consumo de água contaminada com esses poluentes. Isso
porque os processos comumente utilizados em estações de tratamento são
insuficientes para eliminar esses contaminantes, fato comprovado por estudos que
demonstraram a presença deles em concentrações em torno de 100 ng.L -1 em água
de consumo humano (GAFFNEY et al., 2015). Assim, independentemente da classe
e da origem dos fármacos, seu destino final geralmente são as estações de
tratamento de água e, consequentemente, as residências das pessoas, conforme
esquematizado na Figura 1.

Figura 1 – Rotas de exposição de fármacos no meio ambiente.

Fonte: ARAÚJO (2013).

A exposição humana aos compostos farmacêuticos é resultado não somente

da água que consomem, mas também da ingestão de peixes contaminados após
sofrerem exposição em seu ambiente natural (TOURAUD et al., 2011).
 20

3.2 ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDES (NSAIDS)

Os anti-inflamatórios não esteroides são uma classe de fármacos muito

utilizada na medicina humana e animal por possuir efeito antipirético, analgésico e
por ter aplicabilidade no tratamento de diversos tipos de inflamações. Essa classe
inclui a aspirina, o acetaminofeno (paracetamol), ibuprofeno, naproxeno, diclofenaco
de sódio, cetoprofeno entre outros. Esses são mais antigos e são designados como
convencionais ou tradicionais, enquanto que os mais recentes, designados como
seletivos, incluem os chamados COXIBES (rofecoxibe, celecoxibe, etoricoxibe,
parecoxibe etc.) (BATLOUNI, 2010; ALINEZHAD et al., 2018).
A ação biológica dos NSAIDs pode ser atribuída à inibição da enzima ciclo-
oxigenase (COX), à qual existe sob três isoformas: COX-1 se apresenta de forma
bastante expressiva na maioria dos tecidos, sendo responsável pela manutenção
fisiológica normal deles, incluindo a proteção da mucosa gastrointestinal, controle do
fluxo sanguíneo dos rins, respostas autoimunes, funções pulmonares e do sistema
nervoso central, cardiovascular e reprodutivo; a COX-2, por outro lado, é induzida
nos processos inflamatórios, contribuindo para o desenvolvimento do edema, rubor e
febre; e a COX-3, forma variante da COX-1, é produzida particularmente no cérebro.
Os NSAIDs seletivos tratam a inflamação por inibir especificamente a COX 2,
enquanto que os tradicionais ou não seletivos inibem todas as isoformas. Em
consequência disso, os mecanismos fundamentais de proteção da mucosa gástrica
contra os efeitos corrosivos do ácido estomacal ficam comprometidos, resultando no
aumento da produção de secreção ácida, podendo levar a úlceras e hemorragia
(BATLOUNI, 2010; SZABÓ-RÉVÉSZ, 2018).

3.2.1 Propriedades Físico-Químicas dos NSAIDs

Os anti-inflamatórios não esteroides são compostos polares e muitos deles

são também ácidos orgânicos, pois possuem o grupo –COOH em suas fórmulas
estruturais. Eles podem ocorrer em meio aquoso tanto na forma ionizada (alto pH)
como na forma neutra (baixo pH). Uma diminuição no pH da amostra resulta também
em redução na solubilidade em água, de modo que, durante os processos de
extração com solventes, os NSAIDs são mais facilmente extraídos se estiverem na
 21

forma neutra. Seus valores de pKa geralmente variam de 2 a 5, mas podem alcançar
números superiores a 10. A Tabela 1 mostra as propriedades de alguns NSAIDs
(SHUKRI et al., 2015; SZABÓ-RÉVÉSZ, 2018).

Tabela 1 – Propriedades de alguns NSAIDs

Fármaco Estrutura molecular *pKa *logKow Solubilidade em
água a 25ºC
(mg.L-1)
Ácido
mefenâmico 4,20 5,12 20,0

Cetoprofeno 4,45 3,12 51,0

Diclofenaco de 4,14 4,51 4,82

Sódio

Flurbiprofeno 4,42 4,16 8,0

Ibuprofeno 4,91 3,97 21,0

Naproxeno 4,15 3,18 15,9

Paracetamol 9,38 0,46 4150

*pKa= logarítmo negativo da constante de dissociação do ácido

*logKow= logarítmo do coeficiente de partição octanol/água
Fonte: SALLMANN (1986); LUGER et al (1996); MIGOWSKA et al (2012); ANVISA (2017);
SZABÓ-RÉVÉSZ (2018).
 22

O caráter lipofílico dos NSAIDs é fortemente influenciado pelos grupos arila e

seus substituintes presentes nas moléculas. Essa característica depende do
coeficiente de partição, parâmetro que expressa a afinidade dos analitos entre a fase
orgânica e aquosa. Seus valores são calculados como logKow e também são
mostrados na Tabela 1. O log Kow representa também a solubilidade em água e a
habilidade do analito de migrar de zonas lipídicas para o ambiente aquático,
influenciando assim a bioconcentração para a vida marinha. Em baixos valores de
pH, o caráter lipofílico será dominante em razão de o composto estar na forma não-
ionizada. (ESLAMI et al., 2015; SZABÓ-RÉVÉSZ, 2018).

3.3 TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRAS AQUOSAS PARA DETERMINAÇÃO DE NSAIDS

A presença de fármacos nos ambientes aquáticos em concentrações muito

baixas torna necessário o uso de procedimentos de pré-concentração e clean-up a
fim de aumentar a sensibilidade de detecção e eliminar interferentes oriundos da
matriz. A extração em fase sólida (SPE), por exemplo, é uma técnica amplamente
utilizada para esses fins em diversas matrizes (PAÍGA et al., 2015; AMÉRICO-
PINHEIRO et al., 2017; WOLECKI et al., 2019). Ascar et al (2013) foram bem
sucedidos ao utilizar SPE com cartuchos Oásis HLB®, que consistem em
copolímeros de divinilbenzeno e vinilpirrolidona, na análise de quatro NSAIDs em
amostras de água. Eslami et al (2015) também utilizaram SPE para determinar
NSAIDs em águas residuais, superficiais e potável no Irã. Outro método bastante
utilizado é a extração líquido-líquido (LLE). Todavia, em ambas as técnicas, o gasto
de tempo e de solventes orgânicos é muito grande. Em vista disso, novas
metodologias de extração foram propostas (CALDAS et al., 2016).
Métodos otimizados para análise de NSAIDs utilizam a microextração em
fase sólida (SPME) acoplada com técnicas cromatográficas, mas eles possuem
custo elevado e limitada vida útil. Então, para superar as desvantagens já citadas,
foram desenvolvidos métodos de microextração em fase líquida, entre os quais é
possível citar a microextração em gota suspensa (SDME) (TANG et al., 2018), a
microextração com fibra oca (HF-LPME) (MANSO, LARSSON e JÖNSSON, 2014;
SILVA, LIMA e ESTEVES, 2017), o uso de líquidos iônicos (MARCINKOWSKA at al.,
2019) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) em seus diferentes
modos (BELDEAN-GALEA et al., 2015).
 23

Rezaee et al (2006) desenvolveram a DLLME. Nessa técnica, uma mistura

formada por microlitros de solventes extrator e dispersor é injetada na amostra
aquosa com uma seringa ou uma micropipeta. O extrator se dispersa formando finas
gotas. Posteriormente, a mistura é centrifugada para permitir a separação do extrator
e sua retirada manual. Embora seja uma técnica rápida, simples e de baixo custo,
possui a desvantagem de usar solventes muito tóxicos. Além disso, por serem mais
densos que a água, os extratores comumente utilizados se acumulam no fundo do
tubo, dificultando sua retirada. Para superar esses problemas, Zanjani et al (2007)
propuseram a técnica de microextração líquido-líquido dispersiva com solidificação
de gota orgânica flutuante (DLLME-SFOD) (MANSOUR; DANIELSON, 2017). A
Figura 2 apresenta uma linha do tempo dos avanços na DLLME ao longo dos anos.

Figura 2 – Linha do tempo dos avanços da DLLME desde sua criação.

*USA: ultrasound assisted; ST: solvent terminated; SI: sequential injection; SA:
surfactant-assisted, SM: supramolecular; AA: air-assisted; TEME: total organic solvent-
free emulsification microextraction; SAP: solidification of aqueous phase.
Fonte: MANSOUR e DANIELSON (2017).

3.3.1 Microextração Líquido-líquido Dispersiva com Solidificação de Gota Orgânica

Flutuante (DLLME-SFOD)

A Figura 3 apresenta um esquema simplificado da técnica DLLME-SFOD.

Em resultado da adição de microlitros da mistura do extrator e do dispersor na
amostra aquosa com o auxílio de uma seringa ou micropipeta, será formada uma
espécie de nuvem devido à dispersão dos solventes na água (I e II). O sistema deve
 24

ser então centrifugado (III) para promover a formação de duas fases e depois levado
a um banho de gelo para que o extrator (na forma de gota flutuante) solidifique
completamente na superfície (IV) e seja facilmente retirado com uma espátula (V). A
gota retirada, após se fundir, estará pronta para ser analisada em um cromatógrafo
(VI). Portanto, a DLLME-SFOD é considerada um método rápido (o processo é
concluído em alguns minutos), simples (não possui muitas etapas), apresenta baixo
consumo de solventes (sendo por isso ambientalmente mais vantajosa) e faz uso de
solventes menos tóxicos que a DLLME (CHANG, C; HUANG, S., 2010; MANSOUR;
DANIELSON, 2017).

Figura 3 – Esquema simplificado demonstrando as etapas da DLLME-SFOD

(I) (II) (III) (IV) (V) (VI)

Amostra
aquosa

Fonte: A própria autora.

3.3.1.1 Fatores determinantes na eficiência da DLLME-SFOD

3.3.1.1.1 Efeito do tipo e volume do solvente extrator

A escolha de um solvente extrator apropriado tem grande importância na

DLLME-SFOD. Diversos compostos orgânicos podem ser empregados, desde que
atendam a certos requisitos (ZANJANI et al., 2007; MANSOUR; DANIELSON, 2017).
São eles:
i. Ser imiscível em água para que ocorra a separação de fases após
 25

a centrifugação;
ii. Ter densidade inferior à da água para permitir a formação da gota
na superfície;
iii. Ter baixa volatilidade para não ocorrer perdas por evaporação;
iv. Ter elevado coeficiente de partição a fim de extrair bem os
analitos;
v. Ser capaz de se dispersar na amostra em presença de um
solvente dispersor;
vi. Ter baixo ponto de fusão e solidificação;
vii. Ser compatível com os métodos instrumentais utilizados;
viii. Não coeluir com os compostos de interesse durante a corrida
cromatográfica;
ix. Ter custo razoável.
A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de solventes comumente utilizados.

Tabela 2 – Solventes extratores mais utilizados em DLLME-SFOD.

Solvente Ponto de Ponto de Ebulição (°C) Densidade
Fusão (°C) (g.mL-1)
1-Undecanol 13-15 243 0,83
1-Dodecanol 22-24 259 0,83
2-Dodecanol 17-18 249 0,80
n-Hexadecano 18 287 0,77
1 – Bromohexadecano 17-18 190 0,99
1,10-Diclorodecano 14-16 167 0,99
1-Clorooctadecano 20-23 157 0,85

Fonte: GHAMBARIAN; YAMINI; ESRAFILI (2013)

Além do cuidado na escolha do tipo de extrator é preciso ter cautela também

quanto ao seu volume, pois essa é uma variável que pode causar impactos
significativos na eficiência da extração. Em tese, o aumento no volume de solvente
extrator resulta em maiores porcentagens de recuperação, conforme mostra a
Equação 1, onde os termos Co e Vo representam a concentração do analito e o
volume da fase orgânica, respectivamente, e os termos Caq e Vaq, representam a
 26

concentração inicial do analito e o volume da fase aquosa, respectivamente

(MANSOUR; DANIELSON, 2017).

É preciso considerar também que um aumento no volume de extrator resulta

numa diminuição do termo Co devido ao efeito de diluição, diminuindo assim o fator
de pré-concentração ou enriquecimento (FP, Equação 2) e impactando
negativamente na eficiência do processo. Portanto, é preferível o uso de pequenas
quantidades de solvente extrator (usualmente de 10-200L), tendo o cuidado de
garantir altos fatores de pré-concentração e o não comprometimento do volume
disponível para análise (GHAMBARIAN; YAMINI; ESRAFILI, 2013; MANSOUR;
DANIELSON, 2017).

3.3.1.1.2 Efeito do tipo e volume do solvente dispersor

Ao contrário do solvente extrator, que precisa atender a vários requisitos, o

dispersor só precisa ser miscível na fase orgânica e na aquosa e provocar a
dispersão adequada no momento em que a mistura extratora é adicionada à
amostra. Esse solvente favorece o aumento da área da superfície de contato entre
o extrator e a amostra contendo os analitos, melhorando assim a eficiência da
microextração. Os solventes metanol, acetona, etanol e acetonitrila são bastante
empregados. O volume deles na DLLME-SFOD varia de 5 a 500L. Se a quantidade
for muito pequena, pode não ocorrer a dispersão de forma adequada. Por outro lado,
volumes muito altos podem aumentar a solubilidade do analito na fase aquosa,
prejudicando a extração. Por isso, esse critério deve ser otimizado a fim de resultar
em altas porcentagens de recuperação (SENA et al., 2017; MANSOUR;
DANIELSON, 2017).
 27

3.3.1.1.3 Efeito da adição de sal

A adição de sais na amostra é um fator que pode influenciar a eficiência da

DLLME-SFOD. Em alguns casos, essa influência pode não ser significativa, mas em
outros pode gerar um efeito positivo. Isso ocorre pelo efeito salting-out, que
corresponde à diminuição da solubilidade do composto na água, favorecendo assim
sua extração. Esse efeito é causado pela alteração dos coeficientes de partição dos
analitos entre a fase aquosa e a orgânica. A ocorrência disso aumenta com a
concentração do sal até atingir um limite, pois se a concentração for alta, haverá
restrições no transporte dos analitos para a gota orgânica em razão do aumento da
viscosidade da amostra, dificultando assim a extração (ZANJANI et al., 2007;
MARTÍN et al., 2015; MANSOUR; DANIELSON, 2017).

3.3.1.1.4 Efeito do pH

O pH das amostras pode ter um efeito significativo na eficiência da

microextração. Isso ocorre porque se o composto analisado for ionizável, a
quantidade extraída dependerá do grau de ionização, que está relacionado ao pH. É
possível observar essa dependência na equação a seguir:

Na equação acima, x é igual a -1 para ácidos, que é o caso da maioria dos

NSAIDs. Assim, em baixo pH, eles estarão na forma neutra, o que facilitará sua
transferência para o solvente extrator (BELDEAN-GALEA et al., 2015; MANSOUR;
DANIELSON, 2017).

3.3.1.1.5 Efeito do modo de agitação

Durante a etapa de dispersão, é formada uma ampla superfície de contato

entre a amostra e as finas gotas da mistura extrator/dispersor. Isso favorece a
transferência de massas entre as fases, permitindo a migração do analito para o
solvente extrator. Porém, para que esse fenômeno ocorra de forma adequada, é
 28

necessário avaliar não somente o tipo e volume de dispersor, mas também o modo
em que ocorre a mistura, já que esse parâmetro influenciará diretamente no contato
entre as fases. Por esse motivo, na otimização da DLLME-SFOD, normalmente são
avaliados a mistura manual, por vórtex, por agitação magnética e por ultrassom
(GUIÑEZ et al., 2017).

3.3.2 Técnicas Cromatográficas Aplicadas à Determinação de NSAIDs

Visto que os NSAIDs ocorrem em baixas concentrações no meio ambiente, é

necessário o uso de métodos analíticos bastante sensíveis e seletivos para
determinar esses compostos. Sua detecção ocorre normalmente por meio de
técnicas cromatográficas, tais como a cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massas (MIGOWSKA et al., 2012; MARSIK et al., 2017) e a
cromatografia líquida, acoplada a detectores como o UV/Vis (ALINEZHAD et al.,
2018; WANG, LI, CHEN, 2018), arranjo de diodo – DAD (ASCAR et al., 2013;
NGUBANE et al., 2019), fluorescência (TOLEDO-NEIRA; ÁLVAREZ-LUEJE, 2015) e
espectrômetro de massas (ARCHER et al., 2017). Para uso da cromatografia gasosa
na determinação dos NSAIDs, se faz necessária a prévia derivatização das
amostras. Já quando utilizada a cromatografia líquida, dispensa-se essa etapa
(MARTINEZ-SENA et al., 2016).

3.4 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA

A validação é uma importante etapa do desenvolvimento de um método

analítico e visa assegurar que, nas condições em que será utilizado, ele gere
resultados confiáveis. Para isso, é necessário o controle dos fatores que levam à
imprecisão e inexatidão de dados obtidos, caso contrário, decisões equivocadas
podem ser tomadas. A fim de garantir a padronização das exigências a serem
seguidas pelos laboratórios durante os processos de validação, e tornar os
resultados das análises aceitos e reprodutíveis internacionalmente, criou-se o
sistema SEM/IEC-25 (do inglês International Organization for
Standarization/International Electrotechnical Commission) a partir de iniciativas de
instituições vinculadas ao governo americano, tais como a Food and Drug
Administration (FDA) e a Environmental Protection Agency (EPA). Baseada nessas
 29

normas, cada país determina seu próprio programa para assegurar a qualidade dos
métodos, porém, sempre em conformidade com a SEM/IEC-25 (LANÇAS, 2016). No
Brasil, a ANVISA e o INMETRO são os órgãos reguladores responsáveis pela
definição de procedimentos de validação de métodos analíticos (RIBANI et al.,
2004). A Tabela 3 apresenta alguns critérios de validação recomendados não só
pelas instituições reguladoras brasileiras, mas também pelas internacionais.

Tabela 3 – Critérios de validação segundo a USP, ICH, FDA, ANVISA e INMETRO.

USP ICH FDA ANVISA INMETRO
Especificidade Especificidade Especificidade Especificidade/ Especificidade/
Seletividade Seletividade
Exatidão Exatidão Exatidão Faixa de Faixa de
Trabalho Trabalho
Precisão Precisão Precisão Linearidade Linearidade
Repetitividade Repetitividade Repetitividade
Precisão Precisão Precisão
intermediária e intermediária e intermediária e
Reprodutividade Reprodutividade Reprodutividade
Limite de Limite de Limite de - Curva de
Detecção Detecção Detecção Calibração
Limite de Limite de Limite de Limite de Limite de
Quantificação Quantificação Quantificação Detecção Detecção
Linearidade Linearidade Linearidade Limite de Limite de
Quantificação Quantificação
Robustez Robustez Robustez Sensibilidade -
Faixa de Faixa de Faixa de Exatidão Exatidão
Trabalho Trabalho Trabalho
- - Sensibilidade Precisão Precisão
Repetitividade Repetitividade
Precisão Precisão
intermediária e intermediária e
Reprodutividade Reprodutividade
- - Recuperação Robustez Robustez
- - Estabilidade Incerteza de -
Medição
- - System - -
Suitability
Fonte: NEVES (2014)

Durante a validação de um método desenvolvido, as figuras de mérito mais

comumente estimadas são a seletividade, faixa de trabalho, limites de detecção (LD)
e quantificação (LQ), precisão e exatidão (RIBEIRO et al., 2008).
 30

4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 METODOLOGIA ANALÍTICA
4.1.1 Padrões Analíticos, Solventes e Reagentes

Padrões analíticos dos anti-inflamatórios CET, NPX, IBU, DCF e MFN, e os

solventes extratores 1-undecanol e 1-dodecanol, todos de pureza superior a 98%,
foram obtidos da Sigma-Aldrich® (Estados Unidos). Os solventes dispersores
metanol (MET), acetonitrila (ACN) e etanol (ET), todos de grau cromatográfico, foram
da Merck (Alemanha). A água ultrapura utilizada foi produzida pelo sistema de
ultrapurificação Milli-Q Direct 8, da marca Millipore (Alemanha). Os demais
reagentes empregados, tais como o ácido orto-fosfórico (85%), acetato de sódio
anidro (99%), ácido acético glacial (99,7%), hidróxido de sódio (99%) e cloreto de
sódio (99%) foram adquiridos da Isofar (Brasil).
As vidrarias usadas no preparo das soluções foram previamente lavadas
com solução aquosa de Extran® neutro 5% e depois enxaguadas com água potável,
água ultrapura e ambientados com o solvente apropriado.

4.1.2 Preparo das Soluções Estoque e das Soluções de Trabalho

A partir dos padrões analíticos em estado sólido foram preparadas soluções

estoque na concentração de 100 mg.L-1 pela diluição de cada analito em metanol e
em uma mistura acetonitrila/água (1:1), para testar qual seria o melhor solvente a ser
utilizado. Elas foram mantidas sob refrigeração a uma temperatura de 4°C em
frascos âmbar (BELDEAN-GALEA et al.; SHUKRI et al., 2015).
As soluções de trabalho foram preparadas partindo das soluções estoque
pela retirada de alíquotas e diluição destas também em metanol e na mistura
acetonitrila/água (1:1).

4.1.3 Equipamento de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC)

Utilizou-se para executar a pesquisa um sistema de cromatografia líquida de

alta performance da marca Shimadzu®, modelo LC 20AT Prominence, equipado
com injetor de capacidade 20L e duas bombas de alta pressão acopladas a dois
detectores em série: um de fluorescência (FD), modelo RF-10AXL e outro UV/Vis,
 31

modelo SPD-20A. A obtenção dos dados foi feita pelo uso do software LC Solution,
versão 1.24 SP1.
Para a separação dos compostos utilizou-se uma coluna de fase reversa C-
18, empacotada com partículas de 5m de diâmetro, modelo Luna, da marca
Phenomenex®, com 250mm de comprimento e 4,6mm de diâmetro interno.

4.1.4 Definição das Condições Cromatográficas

A fim de definir condições cromatográficas que garantissem uma análise

rápida e eficiente dos compostos, foram testadas duas propostas analíticas obtidas
pela adaptação de métodos apresentados por diversos autores. Elas estão descritas
a seguir:
a) Proposta 1: fase móvel acetonitrila/tampão acetato de sódio
(25mmol.L-1, pH 3,2) na proporção 60/40, modo de eluição
isocrático, fluxo 1,2 mL.min-1, temperatura de 25°C, detector UV/Vis
(comprimentos de onda iniciais de 220, 234, 256 e 275nm) em série
com detector de fluorescência (comprimentos de 220, 245 e 360nm
de excitação; 290, 330 e 495nm de emissão) (GALLO et al., 2010;
SHUKRI et al., 2015; TOLEDO-NEIRA; ÁLVAREZ-LUEJE, 2015);
b) Proposta 2: fase móvel acetonitrila/H3PO4 em água (pH 2,24) na
proporção 55/45, modo de eluição isocrático, fluxo 1 mL.min-1,
temperatura de 25°C, detector UV/Vis (234nm e 256nm) em série
com detector de fluorescência (245 e 360nm de excitação; 330 e
495nm de emissão) (GALLO et al., 2010; BELDEAN-GALEA et al.,
2015; SHUKRI et al., 2015; TOLEDO-NEIRA; ÁLVAREZ-LUEJE,
2015).
Primeiro, foram feitos testes com soluções de trabalho de cada analito nas
concentrações de 50 e 200 g.L-1, utilizando os dois tipos de solvente, para verificar
o comportamento individual deles frente às diferentes condições testadas, bem como
para determinar seus tempos de retenção. Após isso, foram preparadas duas
soluções mistas nas mesmas concentrações para avaliar seu comportamento em
conjunto durante a análise.
 32

4.1.5 Construção das Curvas Analíticas

Após concluída a definição das condições cromatográficas a serem

empregadas durante a análise dos anti-inflamatórios, foi possível a construção das
curvas analíticas de apenas quatro dos cinco compostos pretendidos inicialmente
(NPX, DCF, IBU e MFN). Essa etapa foi realizada a partir de várias soluções de
trabalho preparadas em solvente apropriado e teve como objetivo verificar a faixa de
concentrações dos analitos na qual o equipamento fornecia uma resposta linear.
Para a construção dos gráficos, determinação das equações das retas e dos
coeficientes de determinação (r2) utilizou-se o aplicativo Origin 7.0. A Tabela 4
apresenta as faixas de concentrações utilizadas para cada analito.

Tabela 4 – Faixas de concentrações utilizadas na construção das curvas analíticas

(HPLC-UV-FD)
Composto Detector Faixa de Concentrações (g.L-1)
NPX FD 1-1000
NPX UV/Vis 8-1000
DCF UV/Vis 20-1000
MFN UV/Vis 20-1000
IBU UV/Vis 20-1000

4.2 VERIFICAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ESTOQUE

A estabilidade de um composto corresponde ao período em que suas

soluções padrão e amostras que o contém podem ser utilizadas sem que haja
decomposição apreciável dentro de condições experimentais fixas (LANÇAS, 2016).
A fim de avaliar o tempo máximo em que as soluções dos anti-inflamatórios
poderiam ser armazenadas sob a temperatura de 4°C, foram feitas semananalmente
análises, utilizando as condições cromatográficas otimizadas, de uma solução
padrão de concentração 300g.L-1. As áreas dos picos eram comparadas para
verificação da qualidade deles.
 33

4.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE MICROEXTRAÇÃO

4.3.1 Seleção do Solvente Extrator

A fim de determinar o melhor solvente extrator para a aplicação pretendida,

foram testados os solventes 1-undecanol e 1-dodecanol. Eles possuem os requisitos
mínimos necessários para serem utilizados na DLLME-SFOD, dentre os quais baixa
densidade, imiscibilidade em água, baixos pontos de fusão e solidificação, entre
outros (GHAMBARIAN; YAMINI; ESRAFILI, 2013).
O protocolo-base inicial consistiu na introdução de uma mistura de 30L do
extrator testado juntamente com 150L de ACN em 5 ml de água ultrapura com pH 2
(ajustado com H3PO4 a 85%). A mistura foi agitada com o auxílio de um vórtex e
levada à centrifugação por 4 minutos a 5000rpm. As gotas obtidas em cada
experimento foram então submetidas à análise cromatográfica (BELDEAN-GALEA et
al.; SHUKRI et al., 2015).

4.3.2 Seleção do Tipo e Volume do Solvente Dispersor

Para testar o tipo de solvente dispersor adequado à pesquisa foram

avaliados três tipos comumente utilizados: MET, ACN e ET. Visto que o volume
também é um parâmetro que deve ser considerado durante a otimização, foram
testados três volumes diferentes: 50, 150 e 200L de cada solvente (MANSOUR;
DANIELSON, 2017). O procedimento de testes consistiu na introdução de uma
mistura de 30L do extrator juntamente com os diferentes volumes de cada
dispersor testado em 5 ml de água ultrapura com pH 2 (ajustado com H3PO4 a 85%),
fortificada com 1,2 g.L-1 dos NSAIDs. A mistura foi agitada com o auxílio de um
vórtex e levada à centrifugação por 4 minutos a 5000rpm. As gotas obtidas em cada
experimento foram então submetidas à análise no cromatógrafo (BELDEAN-GALEA
et al.; SHUKRI et al., 2015).

4.3.3 Efeito da Adição de Sal

Durante a avaliação do efeito da adição de sal na amostra, foram testadas 4

diferentes concentrações de NaCl dentro da faixa de 0-10%. O objetivo foi verificar a
influência do aumento da força iônica na eficiência da DLLME-SFOD. O protocolo de
 34

testes incluiu a introdução de uma mistura de 30L do extrator e o volume otimizado

do dispersor em 5 ml de água ultrapura com pH 2 (ajustado com H3PO4 a 85%),
fortificada com 1,2 g.L-1 dos NSAIDs e contendo as diferentes quantidades de NaCl
(0; 2,5; 5 e 10%). O sistema foi agitado com o auxílio de um vórtex e levado à
centrifugação por 4 minutos a 5000rpm. As gotas obtidas em cada experimento
foram levadas à análise cromatográfica (BELDEAN-GALEA et al.; SHUKRI et al.,
2015).

4.3.4 Efeito do pH

Para a verificação do efeito do pH da amostra, foram testados 4 diferentes

valores (1,0; 2,0; 4,0 e 7,0). Essa etapa teve como objetivo avaliar a influência desse
parâmetro na eficiência da DLLME-SFOD. O protocolo de testes incluiu a introdução
de uma mistura de 30L do extrator e o volume otimizado do dispersor em 5 ml de
água ultrapura com os diferentes pH (ajustado com H3PO4 a 85% e solução de
NaOH 1mol.L-1), contendo NaCl e fortificada com 1,2 g.L-1 dos NSAIDs. O sistema
foi agitado com o auxílio de um vórtex e levado à centrifugação por 4 minutos a
5000rpm. As gotas obtidas em cada experimento foram então encaminhadas para a
análise cromatográfica (BELDEAN-GALEA et al.; SHUKRI et al., 2015).

4.3.5 Seleção do Volume do Extrator

Com a finalidade de avaliar qual volume de solvente extrator forneceria

melhores resultados na DLLME-SFOD, foram testados quatro diferentes valores: 20,
30, 40 e 50L. O protocolo de testes incluiu a introdução de uma mistura de cada
volume de extrator e o volume otimizado do dispersor em 5 ml de água ultrapura,
com pH adequado, fortificada com 1,2 g.L-1 dos NSAIDs, contendo NaCl. O sistema
foi agitado com o auxílio de um vórtex e levado à centrifugação por 4 minutos a
5000rpm. As gotas obtidas nos experimentos foram então encaminhadas para a
análise cromatográfica (BELDEAN-GALEA et al.; SHUKRI et al., 2015).
 35

4.3.6 Seleção do Modo de Agitação

A seleção do processo de agitação que melhor se enquadrasse na aplicação

pretendida foi feita avaliando-se três estratégias: mistura manual, por vórtex e por
ultrassom. O protocolo do experimento envolveu a introdução de uma mistura do
volume otimizado do extrator e o do dispersor em 5 ml de água ultrapura, com pH
adequado, fortificada com 1,2 g.L-1 dos NSAIDs, contendo NaCl. O sistema foi
submetido aos três modos de mistura separadamente e levado à centrifugação por 4
minutos a 5000rpm. As gotas obtidas em cada experimento foram então
encaminhadas para a análise cromatográfica (BELDEAN-GALEA et al.; SHUKRI et
al., 2015).

4.4 ÁREA DE ESTUDO

As amostras de água salgada foram coletadas no cais da Praia Grande

(próximo ao Terminal de Integração), e a potável, na torneira de uma residência no
bairro do Filipinho, ambos localizados em São Luís. A água doce foi coletada no Rio
da Prata, localizado no bairro do Araçagi, Região Metropolitana de São Luís. A
Figura 4 mostra os locais de coleta das amostras.
A residência que serviu como ponto de coleta da água potável é abastecida
unicamente pelo Sistema Italuís, o qual tem como fonte de captação o Rio Itapecuru.
A água é captada nas proximidades do povoado Timbotiba, no município de Rosário,
distante cerca de 56 km da capital maranhense. O Rio da Prata, por outro lado,
possui nascentes em uma área de proteção permanente (APP) localizada no
município de São José de Ribamar. Embora esteja em uma APP, esse rio é
ameaçado pela ocupação desordenada em suas proximidades.
 36

Figura 4 – Área de coleta no cais da Praia Grande (a) (2°31’47.4”S 44°18’26.3”W),

no Rio da Prata (b) (2°28’58.7”S 44°12’13.2”W) e na residência (c) (2°32’26.9”S
44°16’12.8”W).

(a)
(b)

(c)

Fonte: Google Imagens/Google Maps

 37

4.5 PERFORMANCE ANALÍTICA

4.5.1 Seletividade

A seletividade é uma figura de mérito que corresponde à capacidade do

método em avaliar um analito de forma inequívoca na presença de compostos
interferentes da matriz. Ela deve ser o primeiro critério a ser verificado e precisa ser
reavaliado continuamente durante a validação e subsequente uso do método. Se
esse parâmetro não for garantido, a linearidade, exatidão e precisão estarão
comprometidas. Portanto, a seletividade assegura que o pico de resposta seja de
fato da substância de interesse (RIBANI et al., 2004).
Para avaliar a seletividade, compararam-se os cromatogramas do branco da
matriz (água) e da matriz fortificada com os analitos, ambas submetidas ao inteiro
processo da DLLME-SFOD já otimizada, a fim de verificar se havia compostos que
eluíam no tempo de retenção dos NSAIDs (LANÇAS, 2016).

4.5.2 Linearidade e Coeficiente de Determinação (r2)

A linearidade é um parâmetro que expressa a faixa na qual o sinal medido

(variável y) é linearmente proporcional à sua concentração (variável x). Essa relação
é expressa pela equação matemática denominada curva analítica ou curva de
calibração. A partir dessa curva e utilizando o método matemático de regressão
linear, será possível calcular os coeficientes de regressão (a e b) e o coeficiente de
correlação, a fim de estimar a qualidade dos dados obtidos (RIBANI et al., 2004;
RIBEIRO et al., 2008).
Durante o estabelecimento da linearidade do método de microextração,
foram utilizadas 7 (sete) concentrações diferentes dos NSAIDs, conforme
especificado pela ANVISA, a qual sugere no mínimo 5 (cinco) níveis de
concentração e cada nível foi injetado no mínimo em triplicata (ANVISA, 2017). As
gotas utilizadas para esse fim foram preparadas a partir de amostras de água
ultrapura fortificadas com os NSAIDs e submetidas ao inteiro procedimento da
DLLME-SFOD otimizada. Para a construção das curvas analíticas, determinação das
equações das retas e do coeficiente de determinação (r2) utilizou-se o aplicativo
Origin 7.0.
 38

4.5.3 Limites de Detecção (LD) e de Quantificação (LQ)

O limite de detecção (LD) é um parâmetro que representa a menor

concentração da substância em análise possível de ser detectada, mas não
necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento
experimental. O limite de quantificação (LQ), por outro lado, representa a menor
concentração quantificável da substância em estudo. É possível estimar o LD e o LQ
pelo método visual, da relação sinal-ruído e por parâmetros da curva analítica. Neste
trabalho, optou-se pelo uso deste último em virtude da maior confiabilidade
estatística em relação aos outros dois. Os parâmetros das curvas dos NSAIDs foram
calculados por meio do aplicativo Origin 7.0 e substituídos nas equações (4) e (5)
para determinar o LD e o LQ (RIBANI et al., 2004; RIBEIRO et al., 2008).

Nas equações acima, s é desvio padrão da resposta (desvio padrão do

branco, da regressão linear ou do coeficiente linear da equação) e S é a inclinação
ou coeficiente angular da curva analítica.

4.5.4 Precisão

A precisão é uma figura de mérito que expressa a dispersão de resultados

entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras
semelhantes ou padrões sob condições definidas. As três formas mais comuns de
expressá-la são por meio da repetitividade ou repetibilidade, da precisão
intermediária e da reprodutibilidade, sendo normalmente expressas pelo desvio
padrão e coeficiente de variação (CV, também conhecido como desvio padrão
relativo – DPR) (RIBANI et al., 2004; INMETRO, 2011).
A verificação da precisão do método proposto neste trabalho foi determinada
segundo critérios estabelecidos pela ANVISA para a repetibilidade. São eles:
 39

avaliação das amostras sob as mesmas condições operacionais, com o mesmo

analista, utilizando o mesmo instrumento e no menor espaço de tempo possível.
Foram feitas 10 (dez) determinações de cada um dos 3 (três) níveis de concentração
contemplados da curva analítica (baixo, médio e alto)(ANVISA, 2017).

4.5.5 Exatidão

A exatidão refere-se à concordância entre os resultados individuais

encontrados em um ensaio e o valor aceito como verdadeiro ou tido como
referência. Normalmente, para avaliar a exatidão de um método são utilizados os
materiais de referência, a comparação de métodos, ensaios de recuperação e a
adição-padrão. Neste trabalho, essa figura de mérito foi verificada a partir de ensaios
de recuperação para os NSAIDs utilizando o método de microextração proposto.
Foram feitas 10 (dez) determinações contemplando o intervalo linear do método em
análise, ou seja, 3 (três) concentrações (baixa, média e alta), seguindo os critérios
determinados pela ANVISA. Os resultados obtidos foram inseridos na equação (6)
para cálculo das porcentagens de recuperação (RIBANI et al., 2004; ANVISA, 2017).

4.6 APLICABILIDADE DA METODOLOGIA DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD EM AMOSTRAS REAIS

E AVALIAÇÃO DO EFEITO MATRIZ

A aplicabilidade da metodologia de microextração proposta neste trabalho foi

avaliada em amostras de águas superficiais da Região Metropolitana de São Luís.
Todas as amostras coletadas foram submetidas à filtração a vácuo utilizando filtro de
membrana de Nylon (porosidade de 0,45m), tiveram o pH ajustado para o valor
adequado e foram armazenadas a 4°C sob o abrigo da luz até serem utilizadas.
Após isso, elas foram fortificadas com os NSAIDs em três níveis de concentração da
curva analítica (baixo, médio e alto) e submetidas ao inteiro protocolo da DLLME-
SFOD, para então serem encaminhadas à análise cromatográfica. As recuperações
obtidas (%) foram calculadas por meio da Equação (6).
 40

Visto que componentes da amostra podem co-eluir com as substâncias de

interesse, provocando aumento ou supressão do sinal analítico, foi necessário
avaliar o efeito matriz (ME). Essa avaliação foi feita mediante procedimento descrito
por Vieno, Tuhkanen e Kronberg (2006), onde foram preparados três conjuntos de
experimentos: 1- água ultrapura fortificada com os NSAIDs nas três concentrações
avaliadas nos ensaios de recuperação, 2-matriz fortificada nas mesmas
concentrações e 3-matriz não fortificada. Após análise cromatográfica das gotas, as
áreas obtidas foram substituídas na Equação (7), a fim de calcular a magnitude da
supressão ou aumento do sinal.

(A1) é a área dos picos das gotas obtidas a partir da microextração de uma
amostra de água ultrapura fortificada com os anti-inflamatórios nas concentrações
avaliadas, (A2) é a área dos picos das gotas obtidas a partir da microextração da
matriz fortificada nas mesmas concentrações e (A3) é a área dos picos das gotas
obtidas a partir da microextração da matriz não fortificada. Se ME apresentar valor
negativo, pode-se afirmar que houve aumento de sinal analítico em resultado da
presença da matriz (sinal do analito na matriz é maior que o observado utilizando
apenas a água ultrapura). Um ME positivo significa que houve supressão do sinal
em virtude da matriz (resposta do analito em água ultrapura é maior que a
observada na matriz). Por outro lado, um ME nulo significa que não houve efeito
matriz significativo.

4.7 GERENCIAMENTO DOS RESÍDUOS

A Tabela 5 apresenta de forma simplificada os resíduos que foram gerados

durante as etapas da pesquisa e a destinação dada a eles.
 41

Tabela 5- Resíduos gerados em cada etapa da pesquisa e respectivos destinos.

Etapa Resíduo Destino
Preparo de Soluções dos NSAIDs em Acondicionamento em frasco
soluções mistura ACN/água (1:1). apropriado para destinação por
padrão dos empresa especializada;
NSAIDs
Preparo de Soluções dos NSAIDs em Acondicionamento em frasco
soluções MET. apropriado para destinação por
padrão dos empresa especializada;
NSAIDs
Análise Fase móvel (ACN, água, Acondicionamento em frasco
cromatográfica tampão acetato de sódio apropriado para destinação por
25mmol.L-1, H3PO4 e empresa especializada;
NSAIDs).
DLLME-SFOD Solvente extrator. Totalmente utilizado na análise
e análise de cromatográfica;
amostras reais
DLLME-SFOD Solvente dispersor e amostra Acondicionamento em frasco
e análise de aquosa. apropriado para destinação por
amostras reais empresa especializada;

Esforços foram feitos para minimizar sua geração, incluindo o preparo de

pequenos volumes de soluções estoque e de trabalho e utilização delas respeitando
o tempo de estabilidade, evitando assim perdas por longos períodos de
armazenamento e necessidade constante de preparo delas.
Visto que o Instituto Federal do Maranhão, local onde foi realizada toda a
pesquisa, não dispõe de estrutura adequada para tratamento e reciclagem de
resíduos oriundos dos laboratórios, foi necessário o acondicionamento de todos eles
em frascos apropriados para posterior encaminhamento a uma empresa
especializada para destinação final.
 42

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

Durante a definição das condições cromatográficas para análise dos

compostos, foram testadas duas propostas analíticas obtidas a partir da adaptação
de métodos apresentados em outros trabalhos. A descrição das duas propostas é
feita de forma detalhada no item “4.1.4 Definição das Condições Cromatográficas”. A
proposta 1, mesmo após tentativas de alterar suas condições, só possibilitou a
detecção de um composto, o NPX, e apenas no detector de fluorescência, tornando
inviável sua aplicação. Os cromatogramas de uma solução mista dos NSAIDs
utilizando essa proposta podem ser vistos nas Figuras 5 e 6.

Figura 5 - Cromatograma de solução mista (200g.L-1) dos cinco NSAIDs utilizando

a proposta 1, onde apenas o NPX aparece. Condições: solução feita em MET, fase
móvel ACN/tampão acetato de sódio (25mmol.L-1, pH 3,2), proporção 60/40, eluição
isocrática, fluxo 1,2 mL.min-1, 25°C, detector FD (exc= 245 nm; ems=330nm).
 43

Figura 6 - Cromatogramas de solução mista (200g.L-1) dos cinco NSAIDs

utilizando a proposta 1, onde nenhum composto aparece. Condições: solução feita
em MET, fase móvel ACN/tampão acetato de sódio (25mmol.L-1, pH 3,2), proporção
60/40, modo de eluição isocrático, fluxo 1,2 mL.min-1, 25°C, detector UV/Vis (220 e
234nm).

A proposta 2, por outro lado, se mostrou eficaz na detecção de todos os

analitos por UV/Vis e apenas do NPX por fluorescência nos comprimentos de onda
testados, conforme será detalhado mais à frente. Isso ocorreu porque somente ele
possuía anéis aromáticos condensados e, portanto, molécula mais rígida que os
demais, critério essencial para fluorescência (LANÇAS, 2016). Assim, a proposta 2
foi escolhida para ser aplicada nesta pesquisa. Sua escolha se baseou no sucesso
dos testes individuais e coletivos feitos com as soluções dos anti-inflamatórios,
comprovando assim que os picos mostrados eram das substâncias de interesse.
A proposta escolhida mostrou-se significativa em alguns aspectos. Primeiro,
o uso da eluição isocrática tornou a análise dos compostos mais rápida, pois visto
que nesse modo a composição da fase móvel permanece inalterada durante a
corrida, não foi observada a necessidade de espera entre as injeções para a
completa estabilização do cromatógrafo. Segundo, o uso dos dois detectores em
série conferiu maior relevância ao trabalho. Terceiro, embora o uso do detector de
fluorescência só tenha gerado resultados expressivos para o NPX, como será
detalhado mais adiante, sua elevada sensibilidade permitirá a detecção de
concentrações menores que as observadas para o detector UV/Vis (LANÇAS, 2016).
 44

5.1.1 Escolha do Melhor Solvente para as Soluções Estoque e de Trabalho

Após escolha preliminar da proposta 2, determinou-se qual solvente seria

mais apropriado para ser utilizado no preparo das soluções estoque e de trabalho.
Na Figura 7, compara-se o sinal dos NSAIDs com soluções preparadas em MET e
mistura ACN/água (1:1) em detector UV/Vis, já nas condições da proposta escolhida.
Na Figura 8, por outro lado, consideram-se os sinais em detector de fluorescência.

Figura 7 - Comparação do sinal dos NSAIDs (1- NPX; 2- CET; 3- DCF; 4-IBU e 5-
MFN) com soluções preparadas em MET e em mistura ACN/água (1:1). Condições:
fase móvel ACN/H3PO4 em água (pH 2,24), proporção 55/45, modo isocrático, fluxo
1 mL.min-1, concentração 200g.L-1, detector UV/Vis (234nm).
 45

Figura 8 - Comparação do sinal do NPX em solução preparada em MET e em

mistura ACN/água (1:1). Condições: fase móvel ACN/H3PO4 em água (pH 2,24) na
proporção 55/45, modo isocrático, fluxo 1 mL.min-1, concentração 200g.L-1, detector

FD (exc= 245 nm; ems = 330nm).

A comparação dos sinais em ambos os detectores deixa claro que as

respostas dos analitos foram bem mais expressivas com uso do solvente MET.
Tanto a resposta dos compostos de interesse como a do próprio solvente em si
(caracterizada pelo pico que aparece antes dos 5 minutos) são mais intensas. Por
esse motivo, adotou-se para todas as atividades seguintes o uso de MET como
solvente das soluções estoque e de trabalho.

5.1.2 Otimização do Fluxo da Fase Móvel

Durante o desenvolvimento da metodologia de análise dos NSAIDs, buscou-

se não apenas alcançar uma boa separação, mas também uma redução no fator
tempo. Por isso, foram feitos testes com três fluxos diferentes. Na Figura 9, é
apresentada uma comparação dos cromatogramas nas três situações.
 46

Figura 9 - Comparação dos tempos de análise dos NSAIDs (1- NPX; 2- CET; 3-
DCF; 4-IBU e 5-MFN) em três fluxos diferentes (1,0; 1,1 e 1,2 mL.min-1). Condições:
solução preparada em MET, fase móvel ACN/H3PO4 em água (pH 2,24), proporção
55/45, modo isocrático, concentração 200g.L-1, detector UV/Vis (234nm)

Observou-se que o aumento do fluxo de fase móvel proporcionou a redução

do tempo total de análise. Por exemplo, o uso de 1,2 mL.min-1 provocou uma
redução de 4 minutos, comparando-se com 1 mL.min-1. Isso resultou em grande
vantagem para o método já que seria possível realizar a análise dos compostos em
um tempo menor, gastando menos fase móvel e gerando menos resíduos. Assim,
determinou-se como fluxo de trabalho para as próximas atividades o valor de 1,2
mL.min-1.
 47

5.1.3 Otimização da Separação dos Compostos

Um problema observado com o uso da proposta analítica escolhida

(proposta 2), é que os compostos 1 e 2 da série (NPX e CET) coeluíram, conforme
visto na Figura 7. Testes individuais confirmaram que os dois possuem tempos de
retenção muito próximos, visto que seus fatores de retenção (k), ou seja, suas
velocidades de migração através da coluna também são semelhantes. Com o intuito
de separá-los, melhorando assim a resolução, foram feitas várias alterações na
concentração da fase móvel, mas não houve sucesso. Em situações assim,
mudanças na fase móvel podem ser feitas para controlar a força de eluição do
solvente e alterar os valores de k dos analitos, com isso os tempos de retenção são
modificados (SKOOG et al., 2005; LANÇAS, 2016). Visto que a separação não foi
possível, foi necessário descontinuar o uso do CET nas etapas posteriores à
otimização das condições de análise. A escolha pelo NPX ocorreu pelo fato dele
poder ser identificado por mais de um detector, conferindo maior destaque ao
trabalho.
Observou-se durante a tentativa de separar o CET e o NPX que o uso da
proporção de fase móvel 60% ACN/40% H3PO4 em água (pH 2,24) provocou uma
redução nos tempos de retenção em comparação com a 55% ACN/45% H3PO4 em
água (pH 2,24), usada inicialmente. A Figura 10 apresenta uma comparação entre
análises feitas utilizando as duas proporções. O cromatograma da proporção 60%
ACN/40% H3PO4 em água (pH 2,24) já não possui mais o CET.
 48

Figura 10 - Comparação dos cromatogramas dos NSAIDs (1- NPX; 2- CET; 3- DCF;
4-IBU e 5-MFN) utilizando duas proporções de fase móvel diferentes. Condições:
solução preparada em MET, fase móvel ACN/H3PO4 em água (pH 2,24), modo
isocrático, fluxo 1,2mL.min-1, detector UV/Vis (234nm)

A redução nos tempos de retenção em cromatografia de fase reversa

devido à redução da porcentagem de água ou aumento da fase orgânica ocorre pela
mudança na força de eluição do solvente, o qual gera alterações na afinidade dos
analitos com a fase estacionária. Assim, sempre que for desejável uma diminuição
do tempo de análise, é necessário o aumento da proporção do composto orgânico
na fase móvel (LANÇAS, 2016). A aplicação desse princípio provocou uma redução
de 6 minutos no tempo total da corrida cromatográfica. Uma proporção 70%
ACN/30% H3PO4 em água (pH 2,24) não pôde ser utilizada, porque o primeiro
composto, o NPX, ficaria localizado em uma área de muitos interferentes, podendo
gerar problemas em análises futuras. Assim, foi definido o uso da proporção 60%
ACN/40%H3PO4 em água (pH 2,24) para as próximas atividades, resultando num
tempo total de análise de 15 minutos. A Tabela 6 mostra os tempos de retenção
finais alcançados para cada um dos NSAIDs da série nessa condição.
 49

Tabela 6 – Tempos de retenção dos NSAIDs na proporção de fase móvel 60%

ACN/40% H3PO4 em água (pH 2,24).
Composto Tempo de Retenção (minutos)
NPX 5,5
DCF 8,8
IBU 9,8
MFN 13,0

Percebeu-se também, ao longo dos experimentos, que alguns compostos da

série geravam melhor sinal em 234nm e outro em 256nm no detector UV/Vis. Vale
ressaltar que esses dois comprimentos foram amplamente destacados na literatura
como apropriados para detecção de anti-inflamatórios. A Figura 11 apresenta uma
comparação dos cromatogramas nesses dois comprimentos de onda.

Figura 11 - Comparação dos cromatogramas dos NSAIDs (1- NPX; 2-CET; 3- DCF;
4- IBU e 5- MFN) utilizando dois comprimentos de onda diferentes no detector
UV/Vis. Condições: fase móvel ACN/H3PO4 em água (pH 2,24) na proporção 55/45,
modo isocrático, fluxo 1,2mL.min-1, solução em MET, concentração 200g.L-1.
 50

Observou-se que o NPX é o único dos NSAIDs analisados que apresentou

melhor resposta em 256nm. Os demais, por outro lado, são melhor detectados na
condição de 234nm, sendo o IBU detectado apenas nesse comprimento. Por esse
motivo, determinou-se que durante a análise seria feito o uso dos dois comprimentos
de onda no detector UV/Vis, sendo que de 0 a 7 minutos seria utilizado o
comprimento de 256nm e de 7 a 15 minutos, o de 234nm, favorecendo assim todos
os analitos. Em relação ao detector de fluorescência, escolheu-se trabalhar durante
a corrida cromatográfica com apenas um comprimento de onda de emissão e outro
de excitação. Isso porque somente o NPX foi identificado por meio dele.

5.1.4 Condições Finais de Análise

A Tabela 7 descreve de forma pormenorizada as condições cromatográficas

otimizadas, a Figura 12 apresenta o cromatograma de uma solução padrão
analisada nessas condições com o detector de fluorescência e a Figura 13, com o
detector UV/Vis.

Tabela 7- Condições cromatográficas otimizadas para análise simultânea dos

NSAIDs.
Coluna Luna C-18 (fase reversa), Phenomenex® (250mm x 4,6mm, 5m)
Fase Móvel ACN/H3PO4 em água (pH 2,24), na proporção 60/40% (v/v)
Solvente MET (solução estoque e de trabalho)
Fluxo 1,2 mL.min-1
Temperatura 25°C
Detector e  UV/Vis; 256nm (0-7min), 234nm (7-15 min)
FD: exc= 245 nm; ems = 330nm;
TR(NPX) 5,5 minutos
TR(DCF) 8,8 minutos
TR(IBU) 9,8 minutos
TR(MFN) 13,0 minutos
TTOTAL da 15 minutos
análise
* = Comprimento de onda
* TR= tempo de retenção
 51

Figura 12 - Cromatograma do NPX (1000 g.L-1) em detector FD nas condições

cromatográficas otimizadas.

Figura 13 – Cromatograma de uma solução padrão dos quatro NSAIDs (1000 g.L-1)
nas condições cromatográficas otimizadas (1- NPX; 2- DCF; 3- IBU e 4- MFN) em
detector UV/Vis.
 52

5.2 CURVAS ANALÍTICAS PARA OS NSAIDS USANDO HPLC-UV-FD

Após definição das condições cromatográficas, foram construídas as curvas

analíticas dos quatro compostos, já que foi necessária a retirada do CET. Durante as
fases iniciais da pesquisa, as curvas foram obtidas a partir do uso de soluções de
trabalho preparadas em MET. A Tabela 8 apresenta os parâmetros das curvas
analíticas dos NSAIDs (faixas de trabalho, equações das curvas e coeficientes de
determinação (r2)) .

Tabela 8- Parâmetros das curvas analíticas para os quatro NSAIDs por HPLC-UV-FD.
Composto Faixa de Trabalho Equação da curva r2
(g.L-1)
NPX (UV/Vis) 8-1000 Y= 18,89X + 1,62 0,9994
NPX (FD) 1-1000 Y= 10059,9X – 4289,5 0,9998
DCF 20-1000 Y= 21,36X + 90,08 0,9994
IBU 20-1000 Y= 11,53X – 298,05 0,9980
MFN 20-1000 Y= 33,71X + 68,49 0,9992

As curvas analíticas dos NSAIDs foram satisfatórias levando em

consideração seus respectivos coeficientes de determinação (r2), os quais variaram
de 0,9980 a 0,9998, evidenciando assim um bom ajuste dos dados e estando de
acordo com as diretrizes para validação de métodos analíticos (RIBANI et al., 2004;
ANVISA, 2017).
A partir do coeficiente angular das curvas analíticas é possível determinar
também a sensibilidade do método. A partir dos dados da Tabela 8, é possível
afirmar que o método se mostrou mais sensível para o NPX com uso do detector de
fluorescência, pois seu coeficiente foi maior comparado aos demais. Isso já era
esperado, pois esse tipo de detector apresenta elevada sensibilidade (LANÇAS,
2016). Assim, foi possível trabalhar com concentrações menores de NPX, em
relação aos demais NSAIDs.

5.3 OTIMIZAÇÃO DA DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD

Definidas as condições cromatográficas mais apropriadas para esta pesquisa

e após o estabelecimento dos parâmetros das curvas analíticas dos compostos, foi
realizada a otimização da metodologia DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD. Para isso,
 53

foram avaliados os solventes extrator e dispersor, bem como seus respectivos

volumes, aumento da força iônica ou efeito salting out, pH e modo de agitação do
sistema.

5.3.1 Seleção do Solvente Extrator

Com base na literatura, foram escolhidos dois solventes para serem testados
na DLLME-SFOD: 1-undecanol e 1-dodecanol. A Figura 14 apresenta uma
comparação entre os cromatogramas do 1-undecanol e do 1-dodecanol no detector
UV/Vis, enquanto que a Figura 15 compara os resultados obtidos para os dois
extratores no detector FD. Mediante análise dessas figuras, foi possível selecionar o
solvente extrator mais adequado à pesquisa.

Figura 14 - Comparação entre os cromatogramas obtidos pelo uso dos extratores 1-

undecanol e 1-dodecanol em detector UV/Vis. Condições da DLLME-SFOD: 5mL de
água ultrapura pH 2, 150L de ACN e 30L do extrator.
 54

Figura 15 - Comparação entre os cromatogramas obtidos pelo uso dos extratores 1-

undecanol e 1-dodecanol em detector FD. Condições da DLLME-SFOD: 5mL de
água ultrapura pH 2, 150L de ACN e 30L do extrator.

Foi possível perceber claramente que, tanto no detector FD como no UV/Vis,

o 1-undecanol apresentou traços de outros compostos, embora a pureza desse
reagente seja elevada e não tenha sido utilizada amostra fortificada com os NSAIDs.
O 1-dodecanol, por outro lado, forneceu melhores resultados em relação a isso. Em
virtude de não ter evidenciado traços de substâncias que poderiam interferir na
análise dos NSAIDs, o 1-dodecanol foi escolhido como solvente extrator.
A fim de verificar se havia interferentes presentes nos mesmos tempos de
retenção dos anti-inflamatórios, foi feita a sobreposição dos cromatogramas de uma
solução mista dos NSAIDs (HPLC-UV-FD) e do 1-dodecanol (DLLME-SFOD-UV-FD)
em detector UV/Vis na Figura 16 e na Figura 17, essa sobreposição refere-se ao
detector FD.
 55

Figura 16 - Sobreposição dos cromatogramas do 1-dodecanol e de uma solução

mista de NSAIDs (1- NPX; 2- DCF; 3- IBU e 4- MFN) em detector UV/Vis. Condições
da DLLME-SFOD: 5mL de água ultrapura pH 2, 0.05g de NaCl, 150L de ACN e
30L de 1-dodecanol. Solução mista dos NSAIDs preparada em MET.

Figura 17 - Sobreposição dos cromatogramas do 1-dodecanol e do NPX em

detector FD. Condições da DLLME-SFOD: 5mL de água ultrapura pH 2, 0.05g de
NaCl, 150L de ACN e 30L do 1-dodecanol. Solução mista preparada em MET.
 56

Verificou-se que o 1-dodecanol não gerou interferentes nos tempos de

retenção dos analitos de interesse, o que constitui um dos requisitos fundamentais
para sua utilização como extrator na DLLME-SFOD. Assim, ele foi selecionado como
solvente a ser utilizado nesta pesquisa, tendo em vista que além de possuir os
requisitos mínimos de solubilidade reduzida em água, baixa densidade e volatilidade
e ponto de fusão próximos à temperatura ambiente, ele não coeluirá com os
compostos durante a análise cromatográfica (ZANJANI et al., 2007). A escolha do 1-
dodecanol também representou uma grande vantagem em relação ao custo, visto
que ele é significativamente mais barato que o 1-undecanol.

5.3.2 Seleção do Tipo e Volume do Solvente Dispersor

Na Figura 18, observa-se o efeito de diferentes tipos e volumes de solvente

dispersor na eficiência de extração dos compostos.

Figura 18 - Efeito do tipo e volume do solvente dispersor. Condições da DLLME-

SFOD: 5mL de água ultrapura pH 2 e fortificada com os NSAIDs, diferentes volumes
dos dipersores e 30L do solvente extrator (1-dodecanol).

50L de ACN
150L de ACN
120 200L de ACN
50L de ET
110 150L de ET
200L de ET
100
50L de MET
90 150L de MET
200L de MET
80
Extração (%)

70

60

50

40

30

20

10

0
NPX (FD) NPX (UV) DCF IBU MFN
 57

Foi possível observar que o volume de 150L de ACN contribuiu de forma

muito positiva para a eficiência da extração de todos os anti-inflamatórios avaliados.
As recuperações alcançadas nesse caso variaram na faixa entre 70-103%. Beldean-
Galea et al. (2015) obtiveram taxas máximas de extração para quatro NSAIDs
utilizando esse mesmo volume de ACN. O volume de 50L, por outro lado, gerou
uma eficiência de extração inferior a 70% para o NPX no detector de fluorescência
(NPX-FD) e para o IBU, embora tenha se comportado bem com os demais. O uso de
200L de ACN não resultou em dados significativos em se tratando do NPX no
detector UV/Vis (NPX-UV) e para o IBU (extração inferior a 60%). No caso dos
volumes de 50 e 150L de ET, bem como para 50 e 200L de MET, não foram
gerados resultados para o NPX-UV e IBU. Assim, tendo em vista o cumprimento dos
requisitos mínimos para um dispersor e da capacidade de atuar na extração dos
quatro analitos avaliados com porcentagens aceitáveis, a ACN foi selecionada para
os experimentos seguintes e seu volume escolhido foi de 150L.

5.3.3 Avaliação do Efeito Salting out

Na Figura 19, são apresentados os resultados obtidos durante a avaliação

do efeito do aumento da força iônica (efeito Salting out) na extração dos anti-
inflamatórios. Durante essa etapa, verificou-se a influência de quatro concentrações
diferentes de NaCl na amostra.
 58

Figura 19 - Efeito da adição de NaCl na eficiência de extração. Condições da

DLLME-SFOD: 5mL de água ultrapura pH 2 e fortificada com os NSAIDs, 150L do
solvente dispersor (ACN), 30L do solvente extrator (1-dodecanol) e diferentes
quantidades de NaCl (0; 2,5; 5 e 10%).

0% NaCl
2.5% NaCl
5% NaCl
120 10% NaCl

100

80
Extração (%)

60

40

20

0
NPX (FD) NPX (UV) DCF IBU MFN

Observa-se que para todos os anti-inflamatórios estudados o uso de 2,5%

de NaCl provocou um aumento nas porcentagens de extração. Isso se deve ao
efeito salting out, no qual a solubilidade dos compostos na água é diminuída devido
à alteração dos seus coeficientes de partição, favorecendo o aumento da quantidade
extraída pela gota orgânica (MARTÍN et al., 2015; MANSOUR; DANIELSON, 2017).
Mas, quando quantidades maiores de NaCl (5 e 10%) foram adicionadas à amostra,
percebeu-se que ao invés de aumento houve diminuição das quantidades extraídas.
Isso está de acordo com a discussão feita por Zanjani et al (2007), que atribui essa
redução a restrições na difusão dos analitos para a gota extratora devido ao
aumento na viscosidade da amostra. Embora a adição de 2,5% de NaCl tenha
contribuído de forma pouco expressiva para a microextração (aumento de no
máximo 16,5% na eficiência), comprovou que a técnica pode ser utilizada de forma
bem sucedida em águas oceânicas, pois a salinidade do mar (cerca de 3,5%) não
causará problemas ao processo.
 59

5.3.4 Seleção do pH

Os resultados obtidos durante a seleção do pH que melhor se adequasse à

pesquisa podem ser vistos na Figura 20.

Figura 20 - Seleção do pH. Condições da DLLME-SFOD: 5mL de água ultrapura

em diferentes pH e fortificada com os NSAIDs, 150L do solvente dispersor (ACN),
30L do solvente extrator (1-dodecanol) e 2,5% de NaCl.

pH 1
pH 2
pH 4
120

100

80
Extração (%)

60

40

20

0
NPX (FD) NPX (UV) DCF IBU MFN

É possível perceber que a condição que permite uma melhor extração de

todos os NSAIDs analisados é o pH 2, no qual foram obtidas porcentagens na faixa
de 81 a 119%. Por esse motivo, esse foi o pH escolhido para as etapas posteriores
da DLLME-SFOD. Isso está de acordo com Beldean-Galea et al. (2015) e Shukri et
al. (2015), os quais também demonstraram em seus trabalhos que o pH 2 seria o
melhor para ser utilizado com os NSAIDs. Não houve sucesso nas análises com pH
7, por isso nenhum dado é visto na Figura 20 para esse valor. Esse fato ocorreu
porque, em valores mais altos de pH, os analitos estão majoritariamente na forma
ionizada, o que afeta a capacidade de serem extraídos. Por outro lado, baixos
 60

valores de pH da amostra garantem que as espécies estarão na forma neutra,

facilitando assim sua transferência para o solvente extrator (MANSOUR;
DANIELSON, 2017).

5.3.5 Seleção do Volume do Extrator

A Figura 21 apresenta os resultados obtidos durante a seleção da

quantidade de solvente extrator (1-dodecanol) que fornecesse maiores porcentagens
de recuperação dos anti-inflamatórios estudados.

Figura 21 - Seleção do volume de solvente extrator. Condições da DLLME-SFOD:

5mL de água ultrapura pH 2 e fortificada com os NSAIDs, 2.5% de NaCl, 150L do
dispersor (ACN) e diferentes volumes de extrator (1-dodecanol).

30uL de 1-dodecanol
40uL de 1-dodecanol
50uL de 1-dodecanol
120

100

80
Extração (%)

60

40

20

0
NPX (FD) NPX (UV) DCF IBU MFN

Foi possível notar que o aumento do volume do extrator provocou uma

diminuição das porcentagens de extração para todos os analitos, chegando ao ponto
de não gerar dados para o DCF, IBU e MFN com o uso de 50L. Isso se deve ao
efeito de diluição, provocando redução da concentração dos compostos na fase
orgânica, o qual impacta no fator de enriquecimento (pré-concentração) e
 61

consequentemente na eficiência do processo, conforme visto na Equação 2.

Observou-se também que não houve dados para o volume de 20L. Isso
ocorreu devido ao comprometimento do volume disponível para a injeção no
cromatógrafo. Assim, dos quatro volumes testados, o que forneceu melhores
resultados foi o de 30L, sendo este o valor escolhido para os próximos
experimentos.

5.3.6 Seleção do Modo de Agitação

Os resultados obtidos durante a avaliação das três estratégias de mistura

são mostrados na Figura 22.

Figura 22 - Seleção do modo de agitação. Condições da DLLME-SFOD: 5mL de

água ultrapura pH 2 e fortificada com os NSAIDs, 2.5% de NaCl, 150L do solvente
dispersor (ACN) e 30L do solvente extrator (1-dodecanol).

Ultrassom
Mistura manual
Vórtex
120

100

80
Extraçção (%)

60

40

20

0
NPX (FD) NPX (UV) DCF IBU MFN

Com base na Figura 22, foi possível perceber facilmente que o modo de
agitação que forneceu melhores resultados para todos os compostos analisados foi
o vórtex, sendo por isso escolhido para ser utilizado na metodologia de
microextração. Guiñez et al. (2017) demonstraram em seu trabalho com nitro-HPAs
 62

que o uso de vórtex também gerou maiores porcentagens de recuperação em

comparação com a mistura manual e o ultrassom. Isso se deve ao fato de que o
vórtex permite uma melhor e mais uniforme dispersão do sistema, favorecendo o
contato entre as fases aquosa e orgânica.

5.3.7 Condições Otimizadas da DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD

Finalizados todos os experimentos de otimização, as condições finais para

execução da DLLME-SFOD foram estabelecidas e podem ser visualizadas na forma
de fluxograma (Figura 23).

Figura 23 – Fluxograma das condições otimizadas da DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD.

Em relação a outras técnicas de extração, tais como a extração em fase

sólida (SPE), apresentadas por vários autores para determinação de NSAIDs em
amostras de água, a metodologia otimizada neste trabalho apresentou grandes
vantagens. É possível citar a simplicidade das etapas, baixo volume de amostra
(5mL), economia de tempo, baixo custo e uso de pequenas quantidades de
 63

solventes por amostra (30L de extrator e 150L de dispersor) (ASCAR et al., 2013;
TRIÑANES et al., 2015; AMÉRICO-PINHEIRO et al., 2017).

5.4 PERFORMANCE ANALÍTICA DA DLLME-SFOD-HPLC-UV-FD

Para a verificação da performance analítica do método proposto, foi feita a

avaliação da sua linearidade e obtenção dos coeficientes de determinação (r2),
limites de detecção (LD) e quantificação (LQ). Para isso, foram construídas curvas
analíticas dos NSAIDs utilizando as condições cromatográficas e da DLLME-SFOD
já otimizadas. Foram preparados sete níveis de concentração (0,3; 0,6; 1,2; 2,4; 3,0;
4,0 e 5,0g.L-1). A Tabela 9 apresenta os resultados obtidos para os anti-
inflamatórios, exceto para o IBU, que apresentou problemas de reprodutibilidade dos
dados. Visto que não foi possível a construção de sua curva analítica, foi necessário
descontinuar seu uso nesta pesquisa.

Tabela 9 – Faixas de trabalho, equações, coeficientes de determinação (r2), limites

de detecção (LD) e quantificação (LQ) dos NSAIDs.
Composto Faixa de Equação da Curva r2 LD LQ
Trabalho g.L-1) g.L-1)
(g.L-1)
NPX (FD)* 0,3 – 5 Y=892457,2x + 167168 0,9978 0,274 0,914
NPX (UV)** 0,6 – 5 Y= 1557,35x + 309,08 0,9964 0,336 1,122
DCF 0,6 – 5 Y= 3022,1x – 577,32 0,9956 0,426 1,421
MFN 1,2 – 5 Y=3207,5x + 277,08 0,9940 0,394 1,314
*Naproxeno analisado em detector de fluorescência.
** Naproxeno analisado em detector de UV/Vis.

Foi possível perceber que o método mostrou-se linear dentro da faixa de

trabalho para os NSAIDs, levando em consideração que para todos os casos os
coeficientes de determinação foram superiores a 0,99. Isso significa que as curvas
analíticas obtidas apresentaram boa qualidade, já que a dispersão entre seus pontos
experimentais foi pequena. Esse fato está de acordo com o que é determinado pela
ANVISA para validação de métodos analíticos (RIBANI et al., 2004; ANVISA, 2017).
O método apresentou também boa sensibilidade, sendo que, dos compostos
avaliados, o NPX no detector de fluorescência mostrou-se o mais sensível. Esse fato
 64

é comprovado verificando-se os coeficientes angulares das curvas. Em relação aos

limites de detecção para os três NSAIDs restantes, seus valores variaram na faixa
de 0,274 – 0,426g.L-1, considerado baixo para análise de traço.
5.5 ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ESTOQUE

Os testes de estabilidade das soluções-estoque dos anti-inflamatórios

revelaram que o tempo máximo de armazenamento delas sob a temperatura de 4°C
em frascos âmbar é de 3 meses. Após esse período, o sinal analítico dos picos
começa a diminuir, o que compromete a qualidade das análises. Assim, esforços
foram feitos para que as soluções pudessem ser utilizadas o máximo possível dentro
desse período, a fim de garantir a confiabilidade dos resultados.

5.6 APLICAÇÃO EM AMOSTRAS REAIS E EFEITO MATRIZ

A verificação da seletividade do método proposto foi feita por meio de uma

avaliação prévia quanto à presença de interferentes nas amostras reais, mediante a
submissão delas ao inteiro protocolo da DLLME-SFOD e posterior análise
cromatográfica segundo as condições já otimizadas. A sobreposição dos
cromatogramas do branco das matrizes e das matrizes fortificadas com os NSAIDs
foi realizada com o objetivo de verificar se algum interferente eluía nos mesmos
tempos de retenção dos analitos em estudo.
As Figuras 24, 26, 28 e 30 mostram os resultados obtidos em detector UV/Vis
para as amostras de água ultrapura, salgada (cais da Praia Grande), doce (rio da
Prata) e potável (residência abastecida pelo sistema de tratamento da cidade de São
Luís), respectivamente. As Figuras 25, 27, 29 e 31 mostram os resultados obtidos
para as mesmas amostras em detector FD.
 65

Figura 24 – Sobreposição dos cromatogramas da água ultrapura fortificada e não-

fortificada com os NSAIDs (5 g.L-1), em detector UV/Vis (1- NPX; 2- DCF; 3- MFN).

Figura 25 – Sobreposição dos cromatogramas da água ultrapura fortificada e não-

fortificada (5 g.L-1), em detector FD.
 66

Figura 26 – Sobreposição dos cromatogramas da água salgada fortificada e não-

fortificada com os NSAIDs (5g.L-1), em detector UV/Vis (1- NPX; 2- DCF; 3- MFN).

Figura 27 – Sobreposição dos cromatogramas da água salgada fortificada e não-

fortificada (5g.L-1), em detector FD.
 67

Figura 28 – Sobreposição dos cromatogramas da água doce fortificada e não-

fortificada com os NSAIDs (5g.L-1), em detector UV/Vis (1- NPX; 2- DCF; 3- MFN).

Figura 29 – Sobreposição dos cromatogramas da água doce fortificada e não-

fortificada (5g.L-1), em detector FD.
 68

Figura 30 – Sobreposição dos cromatogramas da água potável fortificada e não-

fortificada com os NSAIDs (5g.L-1), em detector UV/Vis (1- NPX; 2- DCF; 3- MFN).

Figura 31 – Sobreposição dos cromatogramas da água potável fortificada e não

fortificada (5g.L-1), em detector FD.
 69

O método mostrou-se plenamente seletivo para a água ultrapura e para as

amostras de água salgada e potável. Porém, no caso da água doce, interferentes
eluíram nos mesmos tempos de retenção dos compostos em análise. Embora isso
tenha ocorrido, o estudo do efeito matriz para essa amostra revelou baixos valores
comparados com as demais matrizes, indicando baixa relevância da presença
desses interferentes na validação do método. A porcentagem máxima de supressão
do sinal analítico na presença dessa matriz foi de apenas 8% (para o DCF a 3g.L-
1
). A Tabela 10 mostra os valores de efeito matriz obtidos a partir da aplicação da
Equação 7 para as amostras reais nas três concentrações testadas.

Tabela 10 – Valores do efeito matriz (ME) nas amostras reais, em três níveis de
concentração (1,2; 3 e 5 g.L-1) para os NSAIDs.
Água Doce Água Salgada Água Potável

Concentração Concentração Concentração

(g.L-1) (g.L-1) (g.L-1)
1,2 3 5 1,2 3 5 1,2 3 5
NPX 0,01 -0,03 -0,18 -0,01 -0,15 -0,11 -0,01 -0,02 0,11
(FD)*
NPX 0,00 -0,06 -0,17 -0,08 -0,13 -0,19 0,21 0,17 0,04
(UV)**
DCF -0,22 0,08 -0,10 -0,25 -0,08 -0,18 -0,19 0,03 -0,03
MFN 0,07 -0,11 -0,20 -0,24 -0,13 -0,20 0,11 0,07 -0,07
*Naproxeno analisado em detector de fluorescência.
** Naproxeno analisado em detector de UV/Vis.

Verifica-se que dos três tipos de amostras reais, as que apresentaram maior
efeito matriz foram a água salgada e a potável. Nota-se que a água salgada exibiu
maior aumento de sinal analítico (equivalente a 25%), o que fica evidente pelo seu
valor negativo no caso do DCF a 1,2g.L-1. A água potável, por outro lado,
apresentou maior perda de sinal (equivalente a 21%), evidenciado pelo valor positivo
para o NPX a 1,2g.L-1 em detector UV/Vis mais alto que para os demais.
A Tabela 11, por outro lado, apresenta de forma pormenorizada os resultados
obtidos para os ensaios de recuperação, para a precisão e fatores de
enriquecimento ou pré-concentração.
 70

Tabela 11 – Recuperações, desvios padrão relativo (DPR) e fatores de pré-

concentração dos NSAIDs em três níveis de concentração (1,2; 3 e 5 g.L-1) nas
amostras reais, para dez repetições (N=10).
Água Doce (Rio da Prata)
Analito *C (g.L-1) **Rec (%) DPR (%) FP#
NPX (FD)## 1,2 111,93 2,55 187
3 108,85 0,37 181
5 120,77 3,73 201
NPX (UV/Vis)### 1,2 107,00 3,15 178
3 113,13 1,47 189
5 118,22 3,08 197
DCF 1,2 94,94 6,07 193
3 91,65 4,72 166
5 106,92 5,04 187
MFN 1,2 84,03 18,67 140
3 116,33 3,18 194
5 120,30 1,47 201
Água Salgada (cais da Praia Grande)
Analito *C (g.L-1) **Rec (%) DPR (%) FP#
NPX (FD)## 1,2 105,61 1,89 176
3 118,91 1,29 198
5 111,77 1,06 186
NPX (UV/Vis)### 1,2 109,78 4,53 183
3 118,07 1,08 197
5 119,20 0,74 199
DCF 1,2 111,38 4,98 186
3 112,80 1,90 188
5 118,97 3,28 198
MFN 1,2 114,12 10,78 190
3 118,41 4,21 197
5 119,69 2,57 199
Água Potável
Analito *C (g.L-1) **Rec (%) DPR (%) FP#
NPX (FD)## 1,2 108,01 2,08 180
3 106,31 1,92 177
5 89,32 4,42 149
NPX (UV/Vis)### 1,2 75,64 2,06 126
3 85,08 2,99 142
5 95,42 4,61 159
DCF 1,2 107,18 5,52 179
3 102,09 5,64 170
5 104,12 4,82 174
MFN 1,2 79,83 6,39 133
3 97,10 2,16 162
5 106,70 2,17 178
*Concentração do ensaio
**Porcentagem de Recuperação
 71

#
Fator de pré-concentração ou enriquecimento
##
Naproxeno analisado em detector de fluorescência.
###
Naproxeno analisado em detector de UV/Vis.

Observa-se que os ensaios que evidenciaram maiores perdas de sinal

analítico devido à presença da matriz estão associados a menores porcentagens de
recuperação. Isso ocorreu, por exemplo, com o DCF (3g.L-1) na água doce e com o
NPX (no detector UV/Vis e FD, nas concentrações de 1,2 e 5g.L-1,
respectivamente) e MFN (1,2g.L-1) na água potável. Ainda assim, os valores
obtidos neste trabalho para a recuperação dos anti-inflamatórios foram satisfatórios,
pois variaram entre 75 e 120%, estando assim de acordo com o que é estabelecido
pela literatura para a análise de traços (70 a 120%). A faixa de desvios padrão
relativo obtida durante os testes de precisão (0,37-18,67%) também está de acordo
com o que é determinado para processos de validação, ou seja, até 20%. Logo,
pode-se afirmar o método é preciso e que a matriz não representou aspecto
relevante na validação do método proposto (RIBANI et al., 2004)..
Em relação aos fatores de pré-concentração, valores entre 126 e 201 foram
alcançados, mostrando assim a boa capacidade do método em concentrar os
compostos estudados. Essa faixa foi bem maior que a obtida por Toledo-Neira e
Álvarez-Lueje (2015) em seu trabalho com líquidos iônicos, os quais obtiveram
valores entre 49 e 57.

5.7 COMPARAÇÃO COM OUTROS MÉTODOS

Na Tabela 12 é mostrada uma comparação da DLLME-SFOD validada nesta

pesquisa com outros métodos para determinação de NSAIDs.
 72

Tabela 12 – Comparação da DLLME-SFOD com outros métodos de determinação

de NSAIDs.
Método Rec* LD** DPR*** Volume Referência
(%) (g.L-1) (%) de
Amostra
SPE-HPLC- 84 - 100 5,8 - 1,8 - 5,4 1000mL ASCAR et al (2013)
DAD 35,4
IL-HPLC- 89 - 103 17 - 95 2-3 5mL TOLEDO-NEIRA;
DAD-FD ÁLVAREZ-LUEJE
(2015)
MSPE#- 93,6 – 0,05 – 6,1 - 9 50mL ALINEZHAD et al
HPLC-UV 98,9 0,08 (2018)
C18- 91,9- 6,9 – 4,1- 9,2 20mL MAO et al (2016)
MPSBSE##- 114 7,69
HPLC-UV
DLLME- 75 - 120 0,274 - 0,37- 5mL Este trabalho
SFOD- 0,426 18,67
HPLC-UV-
FD
* Porcentagem de Recuperação
**Limite de Detecção
***Desvio Padrão Relativo
#
Extração em fase sólida magnética
##
Extração sortiva em barra de agitação protegida por membrana
Fonte: Própria autora

Comparando o método DLLME-SFOD com outros trabalhos, é possível

perceber que ele possui diversas vantagens. Por exemplo, o método mostrou-se
eficaz na recuperação dos analitos mesmo utilizando pouco volume de amostra
(5mL). Esse volume é 200 vezes menor que o utilizado por Ascar et al (2013), mas
ainda assim a faixa de recuperações foi boa nos dois trabalhos. O limite de detecção
obtido foi mais baixo que para os demais trabalhos, exceto o de Alinezhad et al.
(2018), comprovando que o método desta pesquisa é capaz de determinar
concentrações muito baixas na água.
Em geral, a DLLME-SFOD se mostra bastante vantajosa em relação às outras
técnicas por sua simplicidade, por fazer uso de pouca quantidade de solventes
orgânicos, ter baixo custo, ser rápida e ainda assim fornecer resultados satisfatórios,
sendo assim uma excelente ferramenta na determinação de anti-inflamatórios em
águas superficiais.
 73

6 CONCLUSÃO

Um método utilizando a DLLME-SFOD combinada à cromatografia em fase

líquida para a determinação dos NSAIDs NPX, DCF e MFN em águas superficiais foi
desenvolvido e validado. Pelo fato de ter havido coeluição entre o CET e o NPX, foi
necessária a descontinuação do uso do CET. Em relação ao IBU, a dificuldade em
reproduzir seus dados durante a construção da curva analítica com a microextração,
obrigou sua retirada da série de compostos estudados. Porém, a saída desses dois
analitos de forma alguma comprometeu a qualidade da pesquisa.
A análise cromatográfica desenvolvida mostrou-se rápida, permitindo a
detecção dos três compostos em apenas 15 minutos, facilitando a possibilidade de
seu uso em rotinas de laboratório. O novo método apresentou também significativa
relevância por utilizar os detectores UV/Vis e fluorescência em série, aumentando
assim o rol de opções de análise.
A metodologia de microextração otimizada destacou-se por sua simplicidade
(com poucas etapas), rapidez, baixo custo (com uso de extrator mais barato que os
normalmente usados), compatibilidade ambiental (uso de solventes de menor
toxicidade e em menor volume que nas formas de extração líquido-líquido e em fase
sólida) e elevada capacidade de concentração (com fatores de enriquecimento entre
126 e 201).
Em se tratando de sua performance durante a validação, o método exibiu
baixos limites de detecção, boa linearidade, recuperação e precisão para os três
anti-inflamatórios. Sua utilização em amostras reais não demonstrou efeito matriz
que comprometesse a eficácia do método, sendo possível aplicá-lo de forma bem
sucedida em amostras de água doce, salgada e potável.
 74

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