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TRABALHO PRÁTICO Nº 1

FICOCIANINA: UMA PROTEÍNA FOTORECETORA

Nota introdutória [1]

Hoje em dia, é possível adquirir células desidratadas de Spirulina (um tipo de cianobactéria, Fig.1) em lojas e farmácias que vendem produtos naturais destinados à saúde. As cianobactérias são seres unicelulares, coloniais ou filamentosos, que utilizam o mecanismo da fotossíntese para obterem os compostos de que necessitam para produzirem a energia requerida para o metabolismo.

para produzirem a energia requerida para o metabolismo. Fig. 1 - Imagem SEM (Microscópio Eletrónico de

Fig. 1 - Imagem SEM (Microscópio Eletrónico de Varrimento) de células de Spirulina

As células de Spirulina, para além de moléculas de clorofila e carotenóides, possuem ficocianina em grande quantidade – uma proteína que contém um pigmento designado por ficocianobilina (Fig.2) que está covalentemente ligado à proteína através de uma ligação tioéter. A ficocianina é uma proteína fotorecetora, solúvel em água, estável à temperatura ambiente, de cor azul (tem um máximo de absorção a 620- 630nm) e fluorescente (com um máximo de fluorescência a 650nm, cor vermelha). A proteína atua como uma espécie de “andaime” que mantém o grupo cromóforo numa conformação linear através do estabelecimento de pontes de hidrogénio com cadeias laterais vizinhas; quando a proteína desnatura por algum motivo, o cromóforo adota uma conformação cíclica – nesta situação, o cromóforo passa a ter um máximo de absorção a 370-380nm. Assim, a presença da ficocianobilina na proteína pode ser usada para monitorizar a integridade da estrutura da ficocianina. Quando a proteína passa da sua forma nativa para uma forma desnaturada, além de diminuir a intensidade da coloração azul da solução, também desaparece a fluorescência vermelha.

da solução, também desaparece a fluorescência vermelha. Fig. 2 – Estrutura da ficocianobilina (o pigmento presente

Fig. 2 – Estrutura da ficocianobilina (o pigmento presente na ficocianina)

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Os processos de desnaturação proteica dependem fortemente das forças intermoleculares presentes em solução. Quando o solvente possui uma elevada tensão superficial (caso da água), a proteína irá assumir o menor volume possível que corresponde, normalmente, ao seu estado nativo. Quando, por adição de co-solventes ou através de processos físicos, as forças intermoleculares no seio do solvente enfraquecem, então a proteína pode “estender-se” e assumir uma conformação desnaturada.

Objetivos

Estudar as propriedades de absorção e emissão de radiação da proteína fotorecetora ficocianina. Compreender a ação das forças intermoleculares nos processos de desnaturação da ficocianina e nas suas propriedades como proteína fotorecetora.

Parte experimental

Reagentes

Spirulina em pó, solução tampão fosfato de sódio 0,10M (pH=7, ajustado com HCl), solução NaCl 0,10M, acetona, solução ureia 6,0M, solução com detergente, solução sacarose 1,0M, solução HCl 1,0M, solução NaOH 1,0M.

Material/grupo de trabalho

Almofariz, tubos de centrífuga de 10ml, funil, papel de filtro, copos graduados, tubos de ensaio, pipetas de 5ml

Material Geral

Espectrofotómetro

lanterna.

(com

Técnica experimental

célula

de

quartzo),

espetrofluorímetro,

vórtex,

1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO 1: Num almofariz, moa 0,5g de Spirulina (cianobactérias) durante cerca de 5min. De notar que, quanto maior for o tempo de moagem, maior a eficácia no rompimento das paredes celulares e maior o rendimento em proteína. Adicione 20ml de tampão fosfato de sódio 0,10M (pH=7) à pasta obtida e homogeneíze a mistura com uma vareta de vidro.

2. PREPARAÇÃO DO EXTRATO 2: Adicione 20ml de tampão a 0,5g de Spirulina. Deixe esta suspensão durante 30min num banho de ultrassons.

3.

Divida os extratos por tubos de centrífuga e centrifugue (use uma centrifuga refrigerada) durante 5min, a 3500rpm.

4. Com uma pipeta de Pasteur de vidro, retire o sobrenadante dos tubos para um copo.

5. Filtre as soluções usando um funil e papel de filtro – deverá obter soluções límpidas e de cor azul (quando muito ricas em ficocianina, também é visível uma coloração avermelhada devido ao fenómeno de fluorescência).

6. Trace o espectro de absorção das soluções obtidas usando um espectrofotómetro (na gama dos 200-800nm). Se necessário, proceda a uma diluição da solução.

7. Trace o espectro de fluorescência das soluções obtidas usando um espetrofluorímetro (na gama dos 400-700nm). Se necessário, proceda a uma diluição da solução.

Técnica experimental

8. Coloque 1ml da solução obtida a partir do EXTRACTO 1 em cada um de 12 tubos de ensaio e proceda de acordo com a tabela abaixo, registando as observações.

 

PROCEDIMENTO

 

Qual é a cor da solução?

A solução fica turva ou límpida?

A solução emite fluorescência vermelha?

A proteína está

 

desnaturada?

Junte 5ml

de

         

tampão fosfato de sódio 0,1M (pH=7)

1

Junte 5ml de NaCl

         

0,1M

 

2

Junte 5ml de água

         

destilada

 

3

Junte

5ml

de

         

acetona

 

4

Junte 5ml de ureia

         

6,0M

 

5

Junte 5ml de uma

         

solução

 

com

detergente

 

6

Junte

5ml

de

         

sacarose 1M

7

Junte 5ml

de HCl

         

1M

8

Junte 5ml de NaOH

         

1M

9

Junte 5ml

de

         

tampão fosfato de sódio 0,1M (pH=7)

10

e

coloque

o

tubo

num copo com água em ebulição

Junte 5ml

de

         

tampão fosfato de sódio 0,1M (pH=7)

11

e

coloque o tubo

num copo cheio de

gelo

 

Junte

5ml

de

         

tampão fosfato de sódio 0,1M (pH=7)

12

e

agite

o

tubo

vigorosamente

durante 1min

9. Após registo das observações relativas ao procedimento do ponto 9, adicione mais 5ml de solução tampão fosfato de sódio 0,1M (pH=7) a cada um dos 12 tubos de ensaio. Registe o que observa.

Notas para a elaboração do relatório

1. Na introdução, explicar o que é o fenómeno de “fluorescência”.

2. Apresentar e explicar os espectros de absorção e emissão obtidos.

3. Estimar a concentração em ficocianina nos extratos obtidos usando a seguinte equação [2]:

C (mg/ml) = 0,198 A 620nm – 0,133 A 650nm – 0,0019 A 565nm

4. Apresentar as observações efetuadas no trabalho sob a forma de tabelas, dando uma explicação adequada para cada situação.

Referências

1. Bowen R., Hartung R., Gindt Y.M. A Simple Protein Purification and Folding Experiment for General Chemistry Laboratory. J. Chem. Ed. 77:1456-1457 (2000).

2. Furuki T., Maeda S., Imajo S., Tetsuya H., Amaya T., Hirokawa T., Ito K., Nozawa H. Rapid and selective extraction of phycocyanin from Spirulina platensis with ultrasonic cell disruption. J Appl. Phycol. 15:319–324 (2003).