TRABALHO PRÁTICO Nº 1

FICOCIANINA: UMA PROTEÍNA FOTORECETORA

Nota introdutória [1]

Hoje em dia, é possível adquirir células desidratadas de Spirulina (um tipo de

cianobactéria, Fig.1) em lojas e farmácias que vendem produtos naturais destinados à
saúde. As cianobactérias são seres unicelulares, coloniais ou filamentosos, que utilizam
o mecanismo da fotossíntese para obterem os compostos de que necessitam para
produzirem a energia requerida para o metabolismo.

Fig. 1 - Imagem SEM (Microscópio

Eletrónico de Varrimento) de células
de Spirulina

As células de Spirulina, para além de moléculas de clorofila e carotenóides,

possuem ficocianina em grande quantidade – uma proteína que contém um pigmento
designado por ficocianobilina (Fig.2) que está covalentemente ligado à proteína através
de uma ligação tioéter. A ficocianina é uma proteína fotorecetora, solúvel em água,
estável à temperatura ambiente, de cor azul (tem um máximo de absorção a 620-
630nm) e fluorescente (com um máximo de fluorescência a 650nm, cor vermelha). A
proteína atua como uma espécie de “andaime” que mantém o grupo cromóforo numa
conformação linear através do estabelecimento de pontes de hidrogénio com cadeias
laterais vizinhas; quando a proteína desnatura por algum motivo, o cromóforo adota
uma conformação cíclica – nesta situação, o cromóforo passa a ter um máximo de
absorção a 370-380nm. Assim, a presença da ficocianobilina na proteína pode ser usada
para monitorizar a integridade da estrutura da ficocianina. Quando a proteína passa da
sua forma nativa para uma forma desnaturada, além de diminuir a intensidade da
coloração azul da solução, também desaparece a fluorescência vermelha.

Fig. 2 – Estrutura da ficocianobilina (o pigmento

presente na ficocianina)

1
 Os processos de desnaturação proteica dependem fortemente das forças
intermoleculares presentes em solução. Quando o solvente possui uma elevada tensão
superficial (caso da água), a proteína irá assumir o menor volume possível que
corresponde, normalmente, ao seu estado nativo. Quando, por adição de co-solventes
ou através de processos físicos, as forças intermoleculares no seio do solvente
enfraquecem, então a proteína pode “estender-se” e assumir uma conformação
desnaturada.

Objetivos

Estudar as propriedades de absorção e emissão de radiação da proteína

fotorecetora ficocianina. Compreender a ação das forças intermoleculares nos
processos de desnaturação da ficocianina e nas suas propriedades como proteína
fotorecetora.

Parte experimental

Reagentes

Spirulina em pó, solução tampão fosfato de sódio 0,10M (pH=7, ajustado com
HCl), solução NaCl 0,10M, acetona, solução ureia 6,0M, solução com detergente,
solução sacarose 1,0M, solução HCl 1,0M, solução NaOH 1,0M.

Material/grupo de trabalho

Almofariz, tubos de centrífuga de 10ml, funil, papel de filtro, copos graduados,

tubos de ensaio, pipetas de 5ml

Material Geral

Espectrofotómetro (com célula de quartzo), espetrofluorímetro, vórtex,

lanterna.

Técnica experimental

1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO 1: Num almofariz, moa 0,5g de Spirulina (cianobactérias)

durante cerca de 5min. De notar que, quanto maior for o tempo de moagem, maior
a eficácia no rompimento das paredes celulares e maior o rendimento em proteína.
Adicione 20ml de tampão fosfato de sódio 0,10M (pH=7) à pasta obtida e
homogeneíze a mistura com uma vareta de vidro.
2. PREPARAÇÃO DO EXTRATO 2: Adicione 20ml de tampão a 0,5g de Spirulina. Deixe
esta suspensão durante 30min num banho de ultrassons.

2
3. Divida os extratos por tubos de centrífuga e centrifugue (use uma centrifuga
refrigerada) durante 5min, a 3500rpm.
4. Com uma pipeta de Pasteur de vidro, retire o sobrenadante dos tubos para um copo.
5. Filtre as soluções usando um funil e papel de filtro – deverá obter soluções límpidas
e de cor azul (quando muito ricas em ficocianina, também é visível uma coloração
avermelhada devido ao fenómeno de fluorescência).
6. Trace o espectro de absorção das soluções obtidas usando um espectrofotómetro
(na gama dos 200-800nm). Se necessário, proceda a uma diluição da solução.
7. Trace o espectro de fluorescência das soluções obtidas usando um
espetrofluorímetro (na gama dos 400-700nm). Se necessário, proceda a uma
diluição da solução.

3
Técnica experimental

8. Coloque 1ml da solução obtida a partir do EXTRACTO 1 em cada um de 12 tubos de

ensaio e proceda de acordo com a tabela abaixo, registando as observações.

PROCEDIMENTO Qual é a cor da A solução fica A solução emite A proteína está

solução? turva ou fluorescência
límpida? vermelha? desnaturada?

Junte 5ml de
tampão fosfato de
sódio 0,1M (pH=7) 1

Junte 5ml de NaCl

0,1M
2

Junte 5ml de água

destilada
3

Junte 5ml de
acetona
4

Junte 5ml de ureia

6,0M
5

Junte 5ml de uma

solução com
detergente 6

Junte 5ml de
sacarose 1M
7

Junte 5ml de HCl

1M
8

Junte 5ml de NaOH

1M
9

Junte 5ml de
tampão fosfato de
sódio 0,1M (pH=7) 10
e coloque o tubo
num copo com
água em ebulição

Junte 5ml de
tampão fosfato de
sódio 0,1M (pH=7) 11
e coloque o tubo
num copo cheio de
gelo

Junte 5ml de
tampão fosfato de
sódio 0,1M (pH=7) 12
e agite o tubo
vigorosamente
durante 1min

4
9. Após registo das observações relativas ao procedimento do ponto 9, adicione mais
5ml de solução tampão fosfato de sódio 0,1M (pH=7) a cada um dos 12 tubos de
ensaio. Registe o que observa.

Notas para a elaboração do relatório

1. Na introdução, explicar o que é o fenómeno de “fluorescência”.

2. Apresentar e explicar os espectros de absorção e emissão obtidos.
3. Estimar a concentração em ficocianina nos extratos obtidos usando a seguinte
equação [2]:

C (mg/ml) = 0,198 A 620nm – 0,133 A650nm – 0,0019 A565nm

4. Apresentar as observações efetuadas no trabalho sob a forma de tabelas, dando

uma explicação adequada para cada situação.

Referências

1. Bowen R., Hartung R., Gindt Y.M. A Simple Protein Purification and Folding
Experiment for General Chemistry Laboratory. J. Chem. Ed. 77:1456-1457 (2000).
2. Furuki T., Maeda S., Imajo S., Tetsuya H., Amaya T., Hirokawa T., Ito K., Nozawa H.
Rapid and selective extraction of phycocyanin from Spirulina platensis with
ultrasonic cell disruption. J Appl. Phycol. 15:319–324 (2003).