UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE CCB

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA E BIOLOGIA MOLECULAR DBB
BIOQUMICA ANALTICA BQI 305

AULA PRTICA N 04
Eletroforese, SDS-PAGE, Gel Nativo, Zimograma

Geniana Gomes-74204
Letcia Lopes-77389
Aramis Silva-78906
Dbora Gouveia-79180
Graziela Paulino-81792

VIOSA
SETEMBRO, 2016

1) Introduo

A Eletroforese uma tcnica de separao baseada na migrao das substancias

(protenas, DNA, RNA, etc.) mediante a presena de um potencial eltrico, esta
migrao se baseia no tamanho, forma molecular e tambm o tempo que se gasta
durante todo o processo.
F = q. E/d

F Fora do campo eltrico = potencial em volts/cm = E/d

E Voltagem aplicada (diferena de potencial entre os dois eletrodos)
d distncia (cm) entre os eletrodos
q carga da partcula
A eletroforese de protenas realizada normalmente em gel de poliacrilamida. O gel
de poliacrilamida formado pela polimerizao de monmeros de acrilamida na
presena de pequena quantidade de bis-acrilamida. A bis-acrilamida formada por dois
monmeros de acrilamida ligadas por um grupo metileno e utilizado como agente
formador de ligaes cruzadas.
A polimerizao da acrilamida iniciada pela adio de TEMED (N, N, N, Ntetramethylenediamine). TEMED catalisa a decomposio de ons persulfato em nion
sulfato e radical sulfato.
S2O

2
8

.
2

S
O
4 +S O 4
+
e

OBS: o representa o eltron desemparelhado

O tamanho do poro gerado no gel de poliacrilamida pode ser alterado variando-se a
porcentagem de acrilamida. Os gis de acrilamida podem ser preparados na
porcentagem entre 29-1% de acrilamida. Baixas porcentagens resultam em gis com
tamanho de poro maior.

SDS-PAGE
SDS-PAGE um mtodo em que as protenas so separadas segundo o tamanho,
a anlise de protenas por SDS-PAGE tambm til para a determinao da massa
molecular relativa da protena.
O SDS um detergente aninico e liga-se fortemente protena desnaturando-a.
Uma molcula de SDS liga-se a dois resduos de aminocidos.
As amostras no so aplicadas diretamente no gel de separao e sim sob uma
camada de gel mais poroso conhecido como gel de empilhamento. A funo do gel de
empilhamento concentrar a amostra de protena para formar bandas mais finas antes
de entrar no gel de separao, para que elas possam comear a correr no mesmo
instante, assim a carga e ponto de partida no contribui para os possveis erros.
O gel de empilhamento possui poros maiores aos quais permitem a livre
migrao das protenas sob a ao de um campo eltrico. Quando a corrente ligada,
todas as espcies inicas precisam migrar com a mesma velocidade. O complexo
protena-SDS carregado negativamente migra para o nodo, e como todas as protenas
possuem a mesma carga eltrica, elas migram no gel de separao com a mesma
velocidade. No entanto, medida que eles passam no gel de separao as protenas de
tamanhos diferentes se separam devido ao tamanho dos poros presentes no gel. Desta
forma, quanto menor a protena mais facilmente ela migrar no gel, enquanto protenas
maiores tem sua migrao retardada.
Gel Nativo
O SDS-PAGE no vivel para experimentos em que o intudo detectar uma
protena com base em sua atividade biolgica, pelo fato do SDS desnaturar
completamente a protena destruindo sua atividade biolgica. Neste caso, utiliza-se o
gel nativo que preparado utilizando-se o gel de poliacrilamida na ausncia de SDS.
Nestas condies as protenas possuem carga eltrica distinta no pH do gel e as
protenas so separadas com base em sua motilidade pelo gel. Nas anlises utilizando
gel nativo difcil informar o comportamento de cada protena, mas devido s
caractersticas distintas de cargas e formas, consegue-se uma boa separao das
protenas em uma mistura. A enzima de interesse pode ser identificada incubando-se o
gel em soluo contendo um substrato adequado.

Deteco da Protena no gel

O corante mais comumente utilizado para detectar as protenas em um gel o
Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB). A colorao normalmente feita com Soluo
corante Coomassie-blue 0,1% Coomassie-Blue R-250 (p/v), 9% cido actico glacial
(v/v), 45% metanol ou etanol (v/v). A mistura cido-metanol age como um agente
desnaturante que precipita e fixa as protenas no gel, evitando que as protenas sejam
perdidas no processo de lavagem do gel.
2) MATERIAIS E REAGENTES:
REAGENTES:

TRIS-base, SDS, Acrilamida, Bis-acrilamida, Persulfato de amnio, Soluo

comercial de TEMED, glicerol, azul de bromofenol, -mercaptoetanol, Glicina,
EDTA, Coomassie-Blue R-250, cido actico glacial, metanol, etanol e gua
destilada.

MATERIAS:

Sistema de montagem de gel, pipetas automticas, ponteiras para pipetas

automticas, pisetas com gua, cuba de eletroforese e fonte para cubas de
eletroforese.

SOLUES:

Tampo de Separao 4x (Tampo de Baixo-TB) 1,5 M TRIS-base, 0,4% SDS,

pH 8,8;
Tampo de Concentrao 4x (Tampo de Cima-TC) 0,5 M TRIS-base, 0,4%

SDS, pH 6,8;
Soluo Acrilamida/Bis-acrilamida - (30%, 29:1);
Soluo 10% de Persulfato de amnio;
Soluo comercial de TEMED;
Tampo de amostra 3x glicerol 30%, SDS 9,2%(v/v), azul de bromofenol 1%

(p/v), -mercaptoetanol 20% (v/v), 0,25 M TRIS-base pH 6,8;

Tampo de corrida 10x 0,25 M TRIS-base, 1,9 M Glicina, 10 mM EDTA, 35

mM SDS;
Soluo corante Coomassie-blue 0,1% Coomassie-Blue R-250 (p/v), 9% cido
actico glacial (v/v), 45% metanol ou etanol (v/v);

Soluo descorante 7,5% cido actico glacial, 25% metanol ou etanol;

Tampo de extrao de protenas TRIS-base 50 mM pH 6,8.

2.1)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

Primeiramente o sistema de eletroforese vertical foi montado com o auxlio do

professor da aula prtica, a seguir o sistema gel foi tambm preparado seguindo os
seguintes passos:

Identificao de 4 bqueres: (1) SDS-PAGE-gel de cima, (2) SDS-PAGE-gel de

baixo, (3) Zimograma-gel de cima e (4) Zimograma-gel de baixo;

Preparo dos gis seguindo a tabela:

GEL DE BAIXO OU GEL DE SEPARAO:

Reagente
gua
Tampo de baixo 4X
Bis-acrilamida (30%)
Persulfato de Amnia 10%
Temed

Concentrao final
1X
10%

Para 7,5 mL (para um gel)

3.044uL
1875uL
2500uL
75uL
7uL

GEL DE CIMA OU GEL DE EMPILHAMENTO

Reagente
gua
Tampo de cima 4X
Bis-acrilamida (30%)
Persulfato de Amnio 10%
Temed

Concentrao final
1X
5%

Para 3,2 mL (para um gel)

1778
800
560
80
5

Etapas feitas durante o procedimento:

- Foi adicionado e solubilizado alguns grnulos de Bromofenol aos bqueres com gel de
cima;
- Ao bquer Zimograma-gel de baixo foi adicionado 15,0 mg de gelatina (para 7,5 mL
de gel), depois o gel foi agitado e aquecido no micro-ondas por 5 segundo a 100% de
potncia, aps foi deixado na bancada para esfriar;
- Foi adicionado, ao bquer SDS-PAGE-gel de baixo, PA e TEMED na soluo do gel
de separao (gel de baixo), aps homogeneizado 5,5 mL da soluo foi vertida no
sistema de gel, utilizando uma pipeta de 1,0 mL sendo deixado um espao para o gel
empilhador (gel de cima);

- Imediatamente aps foi adicionado lentamente a soluo 500 uL da soluo de nButanol;

- Aps a polimerizao, o butanol foi descartado na pia e a superfcie do gel foi lavada
com gua deionizada, e seu excesso foi seco;
- Foi adicionado ao bquer Zimograma-gel de baixo, PA e TEMED na soluo do gel
de separao (gel de baixo) que homogeneizado e adicionado 5,5 mL no sistema de gel,
utilizando uma pipeta de 1,0 mL, foi tambm deixado um espao para o gel empilhador
(gel de cima);
- Imediatamente aps foi adicionado 500 uL da soluo de n-Butanol e feito seu
descarte aps a polimerizao do gel;
- Em seguida foi colocado PA e TEMED no bquer SDS-PAGE-gel de cima, o qual
foi homogeneizado e adicionado sobre o gel de separao at ter completado o
sanduche, o pente adequado foi tambm colocado no lugar adequado;
- O mesmo procedimento descrito acima foi feito para Zimograma-gel de cima;
- Aps dos esses passos foi esperado o tempo de o gel polimerizar, os pentes foram
retirados suavemente.
As amostras foram preparadas seguindo as seguintes instrues do professor:

Preparo das amostras usando o tampo TA sem agente redutor;

Zimograma: no ferver as amostras a serem aplicadas no gel;
Aps a aplicao das amostras, conectar os cabos dos eletrodos na fonte, ligar

selecionando amperagem de 40 mA fixa;

Proceder a eletroforese at que o corante azul de bromofenol a 1,0 cm do final
do gel, desligar, desmontar o sistema e colocar os gis na soluo corante por

pelo menos 4 horas;

Proceder descolorao fazendo trocas de tampo de descolorao at que o gel
fique translcido e as protenas coradas em azul.

A revelao do Zimograma seguiu os seguintes passos:

1). Aps a corrida, lavar 3 vezes com 15 mL de triton 2.5% por 40 min;
2). Lavar 3 vezes com 15 mL de tampo de incubao (tris base 100 mM, pH 8.0, 2,0
mM CaCl2 e Triton 0.005%) por 30 minutos;
3). Incubar a 37oC/18 horas em 40 mL de tampo de incubao, sem agitao;
4). Corar com 50 mL comassie R-250 por 2 horas;
5). Lavar com soluo de descolorao. Visualizar as bandas claras indicativas de
protelise da gelatina no gel.

3) Resultados e discusses:

O gel de SDS page do grupo 1 , obteve uma tima corrida de protenas,

permite visualizar nitidamente, a separao das protenas presente na amostra de acordo
com a massa molecular, j que, o SDS torna a carga e a forma da protenas
insignificante, assim a corrida de eletroforese separa quase que exclusivamente por
massa molcula. As bandas mais salientes, na imagem, so protenas de peso molecular
maior, no caso da banda referente a quimiotripsina a banda mais forte, pode representar
a quimiotripsina em sua integridade quase total ou o domnio funcional da enzima,
podemos verificar isso pelo peso molecular.
O zimograma mostra, que a corrida foi bem-sucedida na caneleta 3
(quimiotripsina), nas canaletas 5 e 6, (Amaciante de carne e extrato proteico de fungo
respectivamente), a cor esbranquiada, devido a ao da enzima na sua conformao
nativa, bem como, das proteases em sua conformao nativa, o esbranquiamento
resultado da digesto, ou seja, quebra das ligaes peptdicas do gel de eletroforese,
pois, ele composto de protenas que compe a gelatina.
Grupo 2:
Em relao ao gel de SDS do nosso grupo, nota- se que houve a separao de
protenas de diferentes massas moleculares, no entanto, a corrida no foi muito
eficiente, porque, as protenas correram pouco, o que atrapalha a separao das mesmas,
essa corrida ineficiente, pode ser resultado de contaminantes nas amostras, mas, o erro

mais provvel, o fato de o tampo de corrida, no cobrir totalmente a cuba, o que

dificulta a passagem da corrente eltrica.
Obs.: o nvel do tampo de corrida, estava baixando durante a corrida do gel de
SDS Page, e teve que ser monitorado e resposto, a causa desse vazamento, foi a
montagem imperfeita da parte interna da cuba, e como no notamos esse vazamento, na
presena de gua, no corrigimos o erro a tempo.
Em nosso zimograma, notamos a presena de atividade de proteases, nas
canaletas referentes ao amaciante de carne e ao extrato proteico de fungo, o que mostra,
que as proteases esto em sua conformao nativa. No entanto, a canaleta 3 referente a
quimiotripsina, no mostrou atividade, provavelmente porque, a enzima est
desnaturada, ou ainda, no h enzima (devido a erros de execuo da pratica, como
pipetagens).

Grupo 3 :

O gel de SDS do grupo 3, teve uma excelente corrida, permitindo a separao

das protenas presentes nas amostras, por diferena de massa molecular. As bandas
destacadas pelas setas vermelhas, possuem peso molecular de aproximadamente de
50KDa (canaleta 2), 60KDa (canaleta 4), 20KDa (canaleta 3) e de 40 50 KDa
(canaleta 7).
4) Discusso geral da prtica:
Alguns pontos importantes da pratica devem ser discutidos como:
Os erros referentes a separao de protenas (SDS-PAGE) e visualizao da
atividade proteica (zimograma), podem ser resultados de pipetagens erradas, corrida
insuficiente, preparo dos gis, solues tampes no adequadas e/ou contaminadas, e de
condies de trabalho inadequadas.
A eletroforese permite verificamos tanto o grau de pureza quanto a
complexidade da amostra, esta ltima, pode ser verificada pela a separao de bandas na
corrida eletroforetica, o grau de pureza pode ser verificado atravs do peso molecular
das bandas de referncias (caso estejamos analisando uma protena conhecida) e
tambm pela corrida da amostra, por exemplo, caso a amostra em estudo esteja
contaminada ela pode correr pouco, ou ainda, nem chegar a correr, isso acontece por
exemplo, quando a protena extrada do meio biolgico est agregada

a outras

molculas do meio.
Alm disso, possvel

estipular o peso molecular das protenas, quando

dispomos de marcadores de peso molecular, e permite tambm a visualizao da

atividade proteoltica das enzimas (Zimograma), desde de que essas se encontrem em

sua conformao funcional, quando as proteases esto em sua conformao nativa, elas
so capazes de digerir a gelatina, que constitui o gel, deixando um rastro/ mancha
esbranquiada, um exemplo disso, atividade proteoltica na canaleta referente ao
amaciante de carne, a quimiotripsina e ao extrato proteico de fungo, sendo assim essas
enzimas esto em sua conformao funcional (estavam integras), o que mostra a
eficincia da corrida e do tampo de incubao, alm, da coerncias dos procedimentos
prticos. Essas enzimas tiveram atividade contra o gel, porque o gel constitudo em
sua grande parte, por gelatina, que uma substncia proteica.
5) Concluso:
Apesar dos erros experimentais, alguns j discutido acima, foi possvel
separar as protenas das amostras, estimar sua massa molecular e observar sua atividade.
REFERNCIA:
Roteiro de aula pratica, Bioqumica Analtica 2016- UFV, Viosa, MG.
Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular
Biology,

7ed,

p399.

Disponvel

http://www2.iq.usp.br/docente/miyamoto/DEG_5_Tecnicas_eletroforeticas.pdf.

em: