Aula Prática

Caracterização de Enzimas
Urease
Objetivos:
 Demonstrar a natureza protéica das enzimas;
 Determinar qualitativamente a atividade enzimática, usando a urease como exemplo;
 Exemplificar desnaturação (inativação) enzimática;
 Demonstrar a especificidade da ação enzimática.

As enzimas desempenham um papel essencial no metabolismo de todos os organismos.

Catalisam e controlam a maior parte das reações químicas no nosso corpo – desde a replicação da
informação genética (DNA polimerase) à digestão (tripsina). A atividade enzimática nem sempre é,
no entanto, fácil de visualizar. Este é um protocolo simples para auxiliar na visualização
da‘atividade enzimática’, em sala de aula.
Os mamíferos, anfíbios e alguns invertebrados libertam resíduos nitrogenados na forma de
ureia, que é produzida no fígado. A ureia é um composto especialmente indicado para a eliminação
de nitrogênio, pois é solúvel em água e menos tóxica que a amônia - que é o produto da excreção
nos peixes, por exemplo. A urina humana contém 2% de ureia.

Reação da Urease:
A urease é uma enzima, que catalisa a hidrólise (quebra de ligação com adição de moléculas
de água) da uréia em amônia e dióxido de carbono (reação abaixo). Esta enzima é encontrada
principalmente em sementes, microrganismos e invertebrados. Nas plantas, a urease é um hexâmero
– consiste em seis cadeias idênticas – e localiza-se no citoplasma. Em bactérias, é constituída por
duas ou três subunidades diferentes.

NH2
C O + H2O
NH2

Em meio aquoso:

2NH3 + 2H2O 2NH4OH (Hidróxido de Amônio)

CO2 + H2O H2CO3 (Ácido Carbônico)

H2CO3 + 2NH4OH (NH4)2CO3 + 2H2O

(Carbonato de Amônio)

Somando as reações teremos:

2NH3 + CO2 + H2O (NH4)2CO3 (Carbonato de Amônio )

A atividade da Urease (enzima) pode ser verificada pela formação de carbonato de amônio,
que é um sal de reação de característica básica e cuja presença pode ser revelada por meio de um
indicador ácido-base como o vermelho de fenol, por exemplo. (pH 6,8 , cor amarela, pH 7,0 , cor
laranja, pH 7,2 , cor rósea, pH 8,0 , cor vermelha ). A urease esta presente em algumas bactérias e
plantas. Esta enzima pode ser extraída com facilidade da soja (Glycine max).
Aplicação médica
Muitos pacientes apresentam queixas digestivas crônicas de esofagite, gastrite (inflamação
do estômago), úlcera gastroduodenal ou mesmo refluxo gastroesofágico. Mais de 80% dos pacientes
que possuem a bactéria Helicobacter Pilori no estômago continuam com queixas digestivas mesmo
tendo feito endoscopia digestiva e o exame haver excluído o diagnóstico de câncer e sendo
submetidos à terapêutica específica. A bactéria H. Pylori é considerada um agente cancerígeno.
A enzima urease (produzida pela bactéria Helicobacter Pilori) normalmente não é
encontrada no estômago.Quando isso ocorre, então se tem uma evidência da presença da bactéria no
estômago.
Muitas espécies de bactérias produzem urease, incluindo Helicobacter pylori, a bactéria
responsável pelas úlceras do estômago. Ao fazer isto, H. pylori eleva o pH do suco gástrico de
aprox. pH 3 para pH 7, o pH ótimo para se desenvolverem. Dois testes baseados na urease podem
ser realizados:
a) O teste rápido da urease CLO (Campylobacter-like organism test) após biopsia, consiste
de tampão fosfato com uréia, extrato de levedura e vermelho fenol pH 6,8. O vermelho fenol fica
amarelo no pH ácido e rosa carmim no pH alcalino. A solução é esterilizada, aliquotada e
congelada. Se a biópsia gástrica tem H. pylori, com a produção da urease, então a uréia presente na
solução teste é metabolizada em bicarbonato e amônia, assim, o meio passa de ácido para alcalino,
ocorrendo viragem da cor de amarelo para cor-de-rosa. A leitura é realizada em até 24h.
b) O teste respiratório consiste em ingerir uma cápsula contendo uréia radioativa marcada
com carbono 14C ou 13C pelo paciente. Aproximadamente três minutos após a ingestão, ela se
dissolve no estômago e entra em contato com a bactéria Helicobacter pilori, que imediatamente
quebra a uréia marcada em CO2 e Amônia. O CO2 chega aos pulmões pela circulação e é expelido
pela respiração em aproximadamente 10 minutos. Uma amostra do ar expirado é coletado e
analisado em um Contador Beta (radiação) que detecta a presença da radiação do Carbono 14C ou
13
C no paciente H. Pilori positivo.

Procedimento Experimental
1. Extração:
Pesar cerca de 15g de farinha de soja e colocar em um erlenmeyer de 250 ml. Adicionar 100 ml de glicerol a
75%. Arrolhar o erlenmeyer e agitar a suspensão com a mão, por 15 minutos.
Colocar no refrigerador até o dia seguinte.
Filtrar o extrato glicerinado através de gaze, espremendo levemente com a mão. Acondicionar em frasco de
vidro. A solução de urease, assim obtida, é estável por cerca de 6 (seis) anos quando conservada em
refrigerador.

2 - Reação de caracterização proteica com o Biureto (reação de Biureto)

A reação do Biureto é devida às ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com
três ou mais resíduos de aminoácidos (2 lig. peptídicas). A reação consiste na interação das
proteínas (ou oligopeptídios) com o Cu2+ do sulfato de cobre (CuSO4) em meio alcalino.
Dependendo da complexidade da proteína ou do peptídeo em questão,a cor do produto de reação na
presença do Biureto pode variar: proteínas dão coloração violeta, peptídios dão coloração rosa.

Preparar 2 de tubos, contendo:

Tubo A → 5 gotas de solução de urease + 2 mL do reativo de Biureto

Tubo B → 2 ml de água destilada + 2 mL do reativo de Biureto

Aguardar a reação. Observar e explicar o resultado.

Reação de Biureto
Caracterização da enzima:
Reativos
a) Solução de urease
b) Tampão fosfato 0,001 M, pH 7,0 (contendo 1% de uréia).
c) Tampão fosfato 0,001 M, pH 7,0 (contendo 1% de Tiouréia).
d) Solução de cloreto de mercúrio:
e) Solução vermelho de fenol:

2.1) Teste nº.1 - Atividade da enzima

Neste teste utiliza-se o indicador vermelho de fenol que passa de cor amarela ou laranja em
meio ácido ou neutro para cor rósea ou vermelha, em meio básico.
Usar 2 (dois) tubos de ensaio e marcar A e B. No tubo A colocar 3 ml de tampão fosfato
0,001 M, pH 7,0 (contendo uréia). No tubo B (controle) colocar 3 ml de tampão fosfato 0,001M pH
7,0 (sem uréia) . Adicionar 2 gotas de solução de vermelho de fenol a ambos os tubos. Adicionar 5
gotas da solução de urease aos dois tubos. Agitar e observar se há mudança de cor nos próximos 5 -
10 minutos. Concluir o resultado.
Observação: esta reação processa-se melhor a 37 ºC.

2.2) Teste nº.2 - Desnaturação da enzima pelo calor

Em um tubo de ensaio (identifique como tubo D) colocar 10 gotas de urease. Agitar e
colocar em banho-maria fervente por 2 minutos.
Em outro tubo ( identifique como T2) colocar 3 ml de tampão fosfato 0,001 M, pH 7,0
(contendo uréia), e 2 gota de solução de vermelho de fenol. A este tubo adicionar a solução de
urease fervida anteriormente. Misturar e aguardar 5-10 minutos. Observar modificação da cor em
relação ao tubo A do teste 1.

2.3) Teste nº.3 - Especificidade da enzima

Tomar 2 (dois) tubos de ensaio e marcar nº1 e nº2. No tubo nº1 colocar 3 ml de tampão
fosfato 0,001 M, pH 7 (contendo 1% de uréia), 2 gotas de solução de vermelho de fenol, e 5 gotas
de solução de Urease. No tubo nº2, colocar 3 ml de tampão fosfato 0,001 M, pH 7 (contendo 1% de
Tiouréia) e 2 gotas de solução de vermelho de fenol. E adicionar 5 gotas de Urease. Agitar e
observar se há mudança de cor nos próximos 5-10 minutos. Concluir o resultado.
A tiouréia (Enxofre na estrutura) é um composto com a seguinte estrutura; muito
Tiouréia Uréia
NH2 NH 2

C S C O
NH2 NH 2
semelhante à uréia.

2.4) Teste nº.4 - Inibição por sais de mercúrio

Os grupos sulfidrilas (-SH) são essenciais para a atividade enzimática da urease. Eles podem manter
ou talvez constituir parte do sítio ativo da enzima. O mercúrio se liga aos grupos sulfidrilas e inativa
a enzima. Para verificar a inibição da atividade da urease pelo cloreto de mercúrio, preparar a
seguinte série de tubos, contendo:

Tubo 4A → 5 gotas de solução de urease +2 gota de solução de vermelho de fenol

Tubo 4B → 5 gotas de solução de urease + 10 gotas da solução de cloreto de mercúrio 5 % + 2
gota de solução de vermelho de fenol
Misturar levemente e adicionar a ambos os tubos 3 ml de tampão fosfato 0,001 M, pH 7 (contendo
uréia) a cada um dos tubos. Observar e explicar os resultados
 Análise dos testes efetuados durante a aula sobre propriedades enzimáticas.

Teste de Biureto
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Teste nº 1:
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Teste nº 2:
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Teste nº 3:
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Teste nº 4:
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Relatório de Aula Prática em Bioquímica:

Extração e Caracterização de enzimas
Urease
Questões:

1) Qual teste pode ser realizado para determinação do caracter protéico de uma enzima ?
2) Como pode ser visualizada a atividade enzimática do teste feito na aula?
3) Escreva os resultados e a interpretação dos testes realizados
4) Qual o tipo de interação que o mercúrio provoca nas enzimas
5) Qual aplicação médica pode ser descrita para a reação da urease
6) Explique o mecanismo do teste da urease após biopsia de estomago