Aula Prática - Determinação de Proteína pela Reação de Biureto

Objetivos

1. Preparar soluções de caseína de concentrações diferentes, a partir da diluição de uma solução de

caseína padrão, ler a absorbância em 550 nm e traçar uma curva de calibração.
2. Determinar a concentração de caseína em uma amostra desconhecida por meio de
espectrofotometria na região do visível.

Teoria

As proteínas podem ser dosadas em diversas amostras, como alimentos, materiais biológicos, etc. por várias
metodologias. A reação do “Biureto”, utilizada para a caracterização de proteínas, também pode ser usada
para determinar a quantidade das mesmas por meio da colorimetria*.
O método está baseado na reação de complexação das proteínas com o íon cúprico (Cu2+) em meio alcalino
com formação um complexo de cor azul violáceo (reação de Biureto) e tal complexo apresenta um pico de
absorção a 550 nm.
A reação é positiva para proteínas, polipeptídios e tripeptídios (3 aminoácidos ligados por 2 ligações
peptídicas na molécula). Dipeptídios (2 aminoácidos ligados por uma única ligação peptídica na molécula)
e aminoácidos não reagem com o biureto, ou seja, há necessidade de, pelo menos, 2 ligações peptídicas
na molécula para que a reação ocorra.

Complexo Proteína – Cobre

*Colorimetria ou espectrofotometria na região do visível: medida da radiação eletromagnética absorvida na região do visível por
uma amostra colorida.

Procedimento experimental

1. Numerar as cubetas; preparar a amostra e as soluções diluídas de caseína nas cubetas,

adicionando água, solução de caseína 10mg/ml e biureto (este sempre por último, para agitar a
mistura), usando a tabela a seguir.
2. Deixar em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente, ler a absorbância em 550 nm.

Reagente de Biureto
Dissolva 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio em 500 ml de água destilada.
Junte com agitação constante 300 ml de solução de NaOH 10%. Adicione 1 g de iodeto de potássio. Dilua
a 1 litro com água destilada e guarde em frasco âmbar. Este reagente conservar-se indefinidamente.

Solução Padrão de Caseína (10mg/ml)

100 mg de Caseína dissolvida em 10 ml de NaOH 0,1 M.
 Tubo Caseína Vol. de Solução Vol. H20 Vol. De Reag. Absorbância
(mg) Padrão de caseína destilada Biureto
1 0 0 1,0 ml 4 ml
2 2,0 0,2 ml 0,8 ml 4ml
3 4,0 0,4 ml 0,6 ml 4 ml
4 6,0 0,6 ml 0,4 ml 4ml
5 8,0 0,8 ml 0,2 ml 4ml
6 10,0 1,0 ml 0 4ml
7 amostra ? ? 4ml

Cálculos

1. Completar tabela acima com os valores de absorbância.

2. Traçar um gráfico (curva de calibração) com os valores de absorbância (eixo y) e concentração, em
mg/ml (eixo x).
A
Concentração
Absorbância
de Caseína (mg/ml)
(A)
(C)
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0

C (mg/ml)

3. Achar a equação da reta no Excel e determinar o valor da concentração de caseína na amostra em

mg/ml.