Purificao de Enzimas

Programa de Ps Graduao de Engenharia Qumica - PPGEQ Tpicos Especiais Professora Marta Langone Aluna Barbara Costa dos Santos

Introduo
Enzimas so catalisadores biolgicos, elas podem aumenta a velocidade de reao em por um fator de 1014 do que uma no catalisada. Elas aumentam a velocidade de reao diminuindo a energia de ativao.

Introduo
O grau de pureza das enzimas comerciais varia de preparaes enzimticas brutas at altamente purificadas e depende da sua aplicao final. Alm disso, a escolha do procedimento de purificao depende de sua origem (animal, vegetal ou microbiana)

Etapas
Garantia da estabilidade enzimtica; Obteno de um Extrato bruto; Enzima Extracelular; Enzima Intracelular; Purificao; Baseada na Solubilidade; Baseada na Carga; Baseada no Tamanho; Baseada na Afinidade; Concentrao; Acabamento;

Extrao
Embora todas as enzimas sejam produzidas inicialmente no interior das clulas, algumas so excretadas atravs da parede celular e funcionam no ambiente em que est a clula. Com base no local de ao, so considerados dois tipos de enzimas: intracelular ou extracelular

Enzima Extracelular
Remoo de Partculas
Geralmente,
Centrifugao

Filtrao

Enzima Intracelular
Rompimento celular Mixers; Agitao com abrasivo; Extruso slida e liquida; Ultrasom; Congelamento e Descongelamento; Choque osmtico; Enzimas hidrolticas de parede; Tratamento Alcalino; Uso de detergentes e solvente.

Purificao - Solubilidade

Mudana no pH Ponto Isoeltrico Prximo do pI Solubilidades

Diminuem as foras repulsivas entre as molculas de protenas Agregados = Precipitados

Mudana na fora Inica

[sal] Interaes ons salinos e cargas de protenas

Adio de sais (NaCl; (NH4)2SO4)

[sal] Competio de ons salinos e cargas das protenas pela gua

Salting in

Salting out Diminuio da constante dieltrica da soluo. Competio pela gua, alterao do interior hidrofbico, [GUA] Precipitao

Solventes Orgnicos

Metanol, etanol e acetona

Purificao - Carga
Cromatografia de Troca Inica

Purificaco - Tamanho
Cromatografia de excluso em gel

Purificao -Afinidade
Cromatografia de Afinidade

Eletroforese
Migrao de ons em um campo eltrico; Especialmente til como mtodo analtico; Vantagem suas protenas podem ser visualizadas e separadas;

Avaliao do processo de separao

Atividade

Nmero total de unidades presentes em uma soluo;

Atividade Especfica

O nmero de unidades enzimticas por miligrama de protenas totais;

Mtodos quantitativos de Protenas Totais

-

Biureto baseia na reao do reativo do biureto (uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo, sendo o tartarato de sdio ); Absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm; Lowry Mistura contendo molibdato, tungstato e cido fosfrico reduz na presena do catalisador cobre (II) ; Composto com absoro mxima em 750 nm ; Bradford Baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas; + rpido e sensvel que o Lowry; variao da absortividade especfica para diferentes protenas Irreprodutibilidade dos resultados; Absorve fortemente em 595 nm.

Concentrao
A concentrao pode ser obtida por remoo de gua:

Adio de um polmero, Sephadex G-25, cujos poros so muito pequenos para permitir a entrada de molculas grandes ; Remoo de solvente atravs de uma membrana semipermevel que no permite a passagem da enzima de interesse (ultrafiltrao); * Oferece vrias vantagens sobre outros mtodos alternativos e dentre elas a de ser mais rpida e ter melhor recuperao. Por remoo de gua sob vcuo (Liofilizao) * Concentrao dos sais presentes na soluo inicial; * Desvantagem: Perda de atividade enzimtica *Uma vez obtida a enzima ativa na forma de p, esta muito mais estvel que em soluo aquosa.

Acabamento
O produto final no pode apresentar baixa

granulometria;
A maioria das preparaes enzimticas industriais

contm, alm da enzima ativa, outras protenas, estabilizantes, preservativos, sais e um diluente que permite a padronizao obtida de diversas bateladas com diferentes atividades especificam;
Manuteno da atividade enzimtica - Aditivos,

modificao qumica controlada ou imobilizao enzimtica.

Exemplos
Purificao e caracterizao bioqumica de lipase extracelular produzida por uma nova linhagem de Rhizopus sp.
Apenas 3 etapas de purificao foram necessrias para alcanar homogeneidade em eletroforese de protena desnaturada. Adio de Sulfato de Amnio; 2. Centrifugao 4C por 10 minutos;
1. 3.

Dilise do precipitado resultante;

 Uma nica banda com massa molecular de 37,5 KDa e atividade

especfica de 1446U/mg foi obtida.

A frao purificada apresentou duas isoformas de lipase, ambas

com temperatura tima de atividade igual a 50C, mantiveram-se estveis entre valores de pH entre 6,5 e 7,5 e a temperaturas inferiores a 50C.
Mantiveram sua atividade na presena de hexano. A frao lipoltica foi inativada por Hg+ e por n-bromosuccinimida

e ativada por Na+.

A Determinao de Protena foi feita pelo Mtodo de Lowry.

Fim!

Obrigada