Cromatografia por EXCLUSÃO MOLECULAR

01. A cromatografia por exclusão molecular é o mais simples processo

cromatográfico. Sobre a cromatografia por exclusão molecular responda:

a) Como se dá o princípio de funcionamento dessa técnica?

A separação consiste na partição de moléculas de acordo com as diferenças entre o
tamanho das espécies presentes, por meio da interação de uma fase móvel e uma fase
estacionária com porosidade pré-determinada.

b) Quais os principais fatores que afetam esse tipo de separação?

- Características da matriz;
- Tamanho do poro;
- Distribuição de tamanhos de partículas;
- Volume da amostra;
- Volume da coluna;
- Vazão de eluente;
- Viscosidade da amostra e do tampão
- Densidade de empacotamento do gel na coluna;

c) Cite pelo menos três aplicações dessa técnica

Fracionamento de proteínas: Para obter bons resultados de purificação as amostras
devem estar parcialmente purificadas a fim de eliminar moléculas com tamanhos parecidos
que sejam indesejadas

Determinação de massas molares: Empregada para determinação de massa molar de

macromoléculas hidrofílicas e de polímeros e também na distribuição de massas
moleculares

Determinação do tamanho de poros: Utiliza-se de compostos de tamanho conhecidos

para determinar as dimensões dos poros da matriz
Cromatografia por TROCA IÔNICA

02 A cromatografia por troca iônica é uma das mais empregadas industrialmente por
ser baseada na competição eletrostática de íons:

a) Como é realizada a purificação da molécula-alvo por essa técnica?

Esse tipo de cromatografia é regido por diferentes graus de afinidade eletrostática entre a
fase estacionária e os íons da fase móvel
Baseia-se principalmente na competição entre os íons de interesse e concomitantes pelos
grupos carregados da fase estacionária As proteínas têm em sua superfície grupamentos
com cargas positivas e negativas:

b) A partir do princípio de funcionamento descreva como seria realizada a purificação

por cromatografia por troca iônica de uma proteína com carga liquida positiva.

A separação de proteínas é feita de acordo com as diferenças no equilíbrio entre os íons da

fase móvel (F.M.) e os íons da fase estacionária (F.E.). Para uma purificação efetiva por
troca iônica, a fase estacionária deve ser capaz de se ligar a proteínas que estejam
carregadas positiva ou negativamente. Na purificação de uma proteína com carga líquida
positiva a matriz deve conter grupos negativamente carregados, ou seja, trocadores
catiônicos e assim irão adsorver proteínas com carga liquida positiva. Para proteínas de
cara liquida negativa, a matriz deve conter grupos carregados positivamente, ou seja,
torcadores aniônicos.

03. Na cromatografia por troca iônica, como é realizado o processo de pré-tratamento

da matriz (fase estacionária) antes de iniciar o processo cromatográfico?
Remoção de impurezas;
Mistura do adsorvente com o tampão desejado;
Intumescimento
Lavagem
Condicionamento do contra-íon.

Cromatografia por INTERAÇÃO HIDROFÓBICA

04. Sobre a cromatografia por interação hidrofóbica: discorra sobre o princípio de

funcionamento dessa técnica.

O método, baseia-se na interação hidrofóbica ou na associação entre proteínas e ligantes

hidrofóbicos imobilizados em suporte sólido. A ligação induzida sob elevadas concentrações
salinas, as quais reduzem a solubilidade das proteínas em solução, bem como aumentam o
nível de entropia na camada de moléculas de água que envolvem os grupos hidrofóbicos
05. Qual a necessidade da presença de íons salting-out e salting-in na cromatografia
por interação hidrofóbica e qual sua função no processo?
O processo de adsorção requer frequentemente a presença de ions salting-out ions

Salting-out:
- diminui a disponibilidade de H2O na solução.
- aumenta tensão superficial
- aumenta interações hidrofóbicas

Salting in: Impedem a interação não iônica

06. O hormônio do crescimento humano recombinante é um bioproduto purificado

utilizando a cromatografia de imunoafinidade, sabendo que esse produto é muito
sensível a variações drásticas do meio. Proponha um processo de purificação desse
bioproduto de forma que se obtenha o maior rendimento possível.

Cromatografia POR AFINIDADE

07. Sobre a cromatografia por afinidade:
a) Descreva as etapas do processo.
Baseia-se no isolamento seletivo de proteínas, mediante o uso das propriedades
bioquímicas destas de se unirem reversivelmente a ligantes específicos;

O processo é dividido em três etapas:

Etapa 1- imobilização do ligante na superfície interna de uma matriz porosa;
Etapa 2 - ocorre a adsorção pelo contato da fase liquida com a matriz contendo ligante, e
lavagem onde a coluna é equilibrada para remoção dos componentes adsorvidos de forma
não especifica;
Etapa 3 – eluição da proteína;
Por fim é realizada a regeneração da coluna

b) Quais as principais vantagens inerentes dessa técnica?

Elevada sensibilidade, elevada resolução e elevada capacidade de purificação

Adsorção em leito expandido

08. A adsorção em leito expandido vem sendo bastante empregada devido suas
vantagens em relação as demais cromatografias. Liste as vantagens dessa técnica
em relação as demais técnicas cromatográficas.
Demais cromatografias: utilizam um leito empacotado, exige uma alimentação isenta de
partículas em suspensão, necessitam de um elevado tempo de operação e utilizam como
princípio de funcionamento o princípio da adsorção porém com o adsorvente fixo.
 ALE: meio adsorvente pode se encontrar suspenso, a resistência por difusividade é
reduzida, processo mais rápido, reduz o número de etapas do processo e reduz os riscos
de perda de atividade da molécula alvo.

09. Explique como é realizado a purificação de bioprodutos utilizando a adsorção em

leito expandido.
É uma técnica que baseia-se na fluidização de um leito de adsorção contendo partículas
adsorventes com de densidades diferentes. Ocasionando uma maior interação entre as
partículas adsorventes e o meio.
Os reatores da ALE são tubulares como as colunas de cromatografia em leito fixo, mas
nesse processo adota-se a segregação do leito, a fim de conseguir uma fluidização
controlada e estável. Esse método é uma combinação entre as propriedades
hidrodinâmicas do leito fluidizado com as propriedades do leito empacotado

10. Como pode ser caracterizado o leito na adsorção em leito expandido para otimizar
o processo de separação?

A caracterização do leito baseia-se na medida da expansão do leito em função da

velocidade linear do fluido; e ainda, em função dos fatores de distribuição de tamanho
das partículas, viscosidade do fluido e presença de células. Existem dois parêmtros que
caracterizam o leito, que é o grau de expansão do leito e a distribuição do tempo de
resistência.

Membranas adsortivas
11. O processo de separação por membranas adsortivas é bastante empregado por
sua alta velocidade de purificação.
Sobre essa técnica:

a) Descreva o processo de purificação por membranas adsortivas.

Consiste na separação através da adsorção da biomolécula de interesse no sitio de
adsorção localizado no interior dos poros da membrana; Processo pode ser dividido em
etapas:
Etapa I: A adsorção da molécula-alvo na membrana, remoção das impurezas;
Etapa II: consiste na lavagem da membrana com um tampão especifico( tampão de
adsorção) onde as impurezas que ficaram retidas indevidamente na membrana são
removidas;
Etapa III: Consiste na eluição da molécula alvo pelo enfraquecimento da interação
biomolécula ligante, variando condições do meio através da aplicação de um tampão
específico (tampão de dessorção);
Etapa IV: Recuperação da membrana. Membranas Adsortivas Princípio de funcionamento A
biomolécula alvo pode ser recuperada se for produto de interesse ou descartada se for
impureza
b) Quais as vantagens da aplicação desse método?
- Capacidade de purificação elevada;
- Maior área superficial de contato com o fluido;
- Detém de menor tempo para realizar a purificação;
- Facilmente empregado em processos industriais