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- Dosagem de proteínas
- Métodos cromatográficos para separação de
proteinas e para a separação de imunoglobulinas
Métodos de 1 proteína
purificação isolada
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Método de Dosagem de Proteínas das Frações
Gama-Globulinas Precipitadas com Sulfato de
Amônio.
Método de BRADFORD
Cromatografia de Troca Iônica em
DEAE-Celulose para Purificação de
IgG Bovina
2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a
separação de Ig G
2.1.- Materiais
2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento
com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).
2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de
amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna
de DEAE – celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser
previamente determinada.
2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e
preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de
cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna.
2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.
2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados
com a numeração de 1 a 15.
2.2.- Método
12 gotas/min
Assunto 04- figura 01
3ml
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo zero Tempo 1 Tempo 2 Tempo n
Amostra com
diferentes Líquido
componentes Componentes da que sae
Mais tampão é
amostra se da coluna
colocado na
Resina separam e saem é
coluna,
embebida da coluna com recolhido
forçando os
em diferentes em tubos
componentes
tampão volumes de de um
da amostra a
tampão coletor de
interagirem
frações
com a resina
Concentração
• massa molecular
• carga elétrica Um cromatograma, como o
• solubilidade gráfico ao lado, é a maneira
• afinidade usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia. Tempo ou volume
Cromatografia de troca iônica
DEAE CM
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou +
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): +
+ +
+
+
+ + +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: ++
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a Moléculas com a mesma carga,
mesma carga; ou sem carga, não interagem com a resina,
2) eluição das proteínas adsorvidas. sendo as primeiras a sair da coluna
Eluição
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
+
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a +
interação entre as proteínas e a resina. +
+
+
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da Na+Cl- + +
++
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
_ (+)
(-) =
+
_ = Não retidas +
Não retidas
+
Carboximetil~celulose Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de cátions) (trocadora de ânions)
Tipos de Resina de troca Iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1
Tipos de
Fortemente básica
Resina de troca
Ø - CH N (CH )
Iônica
+ Troca aniônica
2 3 3
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3-H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração
básico - CH 2CH 2N+(C2H 5)2 e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH 2COOH e troca iônica de proteínas
básicas e neutras
proteína pequena
Fluxo do tampão
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina
Passo 2. Acoplar
o ligante
Molécula-alvo (analito)
ligante